Lenka Nožková, 2004 1. OČKOVÁNÍ A KULTIVACE BAKTERIÍ ESCHERICHIA COLI, STAPHYLOCOCCUS AUREUS, NEZNÁMÉ SMĚSI BAKTERIÍ A KVASINEK CANDIDA ALBICANS Postup očkování a kultivace: - sterilizujeme kličku v nesvítivém plameni kahanu - rozžhavíme ji do červena a necháme vychladnout nebo ochladíme o agar v Petriho misce (při okraji) - sterilizovanou kličkou odebereme izolovanou kolonii dané bakterie z předem připravené kultury - odebraný vzorek přeneseme na živný substrát na Petriho misce (postup pro E.coli a S.aureus): 1. vzorek naneseme ke kraji misky a rozetřeme na malé ploše o průměru asi 1 - 1,5 cm 2. kličku sterilizujeme 3. jedním dlouhým tahem vzorek rozetřeme, dalšími třemi až čtyřmi tahy vedenými rovnoběžně s předchozím již vzorek neroztíráme (linie nepřesahují na vzorek) 4. kličku sterilizujeme 5. prvním tahem protneme linie vytvořené v bodě 3., další tahy se s nimi již nekříží 6. kličku sterilizujeme 7. postup (bod 5.) opakujeme ještě jednou nebo dvakrát - pokud vzorek (Candida albicans) přenášíme na šikmo litou půdu (ve zkumavce), vzorek nanášíme směrem ode dna zkumavky nahoru esovitým pohybem - směs bakterií v tekuté půdě ve zkumavce - bujónu - přenášíme sterilizovanou kličkou do čirého (sterilního) bujónu tak, že kličkou se vzorkem potřeme vnitřní stěnu zkumavky těsně nad hladinou bujónu a poté zkumavku nahneme, abychom ze stěny vzorek smyli a promíchali s živnou půdou - vzorky označíme (název bakterie, datum, skupina) a vložíme do termostatu (teplota 37°, doba kultivace 24 h) Použité půdy: - krevní agar: tmavě červený, živná půda s přídavkem krve; hemolyzující bakterie způsobí zesvětlání (hemolýzu) - Endova půda: světle růžová, laktóza-pozitivní bakterie (metabolizují laktózu - tvoří se aldehydy, které reagují s fuchsinem obsaženým v Endově půdě za vzniku Schiffových basí - barviva) způsobí zabarvení půdy do fialova (tmavorůžova); laktóza-negativní bakterie - půda zůstává růžová - Sabouraudův agar: světle žlutý, rostou na něm především kvasinky a plísně, bakterie rostou hůře kvůli nedostatku živin - bujón (tekutá půda) Konkrétní očkované kmeny: - Escherichia coli z Endovy půdy na Endovu půdu - Staphylococcus aureus z krevního agaru na krevní agar - Candida albicans ze Sabouraudovy půdy v Petriho misce na šikmo litou Sabouraudovu půdu ve zkumavce - neznámá směs bakterií z bujónu do bujónu Výsledky (2. den): - Escherichia coli vytvořila na Endově půdě charakteristické tmavorůžové kolonie (stejně jako původní vzorek) - je laktóza-pozitivní - Staphylococcus aureus vytvořil na krevním agaru šedavé kolonie, kolem nichž bylo pozorovatelné prosvětlení - známky hemolýzy - Candida albicans vytvořila na šikmo litém agaru bělavé kolonie charakteristického zápachu (po droždí) - směs bakterií v bujónu způsobila zakalení bujónu ZHOTOVENÍ, BARVENÍ A POZOROVÁNÍ PREPARÁTŮ KULTIVOVANÝCH BAKTERIÍ Technika zhotovení preparátu: - na sterilní podložní sklo naneseme sterilizovanou kličkou vzorek bakterií (rozetřeme na malé ploše) - podložní sklo několikrát protáhneme (vzorkem vzhůru) v nesvítivém plameni kahanu a tím vzorek fixujeme - barvíme dle Grama: 1) převrstvíme krystalvioletí a necháme působit 20 - 180 s 2) krystalvioleť opláchneme Lugolovým roztokem 3) převrstvíme Lugolovým roztokem a necháme působit 20 - 180 s 4) opláchneme Lugolův roztok vodou (opatrně necháme stéct okraje podložního skla, abychom tím nesmyli vzorek) 5) v šikmé poloze odbarvujeme acetonem, dokud se nepřestane vyplavovat barvivo 6) opláchneme vodou 7) převrstvíme karbolfuchsinem a necháme působit (30 - 60 s) 8) opláchneme vodou 9) necháme zaschnout Princip Gramova barvení: Krystalvioleť a jód z Lugolova roztoku vytvoří v buněčné stěně bakterie tmavomodrý komplex, který se dá vymýt pouze u Gram-negativních bakterií. Jejich tenká buněčná stěna umožňuje díky obsaženým lipidům snadný průnik organického rozpouštědla (acetonu) a snadné vymytí komplexu. Gram-negativy se poté dobarvují karbolfuchsinem, který je zbarví do růžova. Pozorování pod imerzním mikroskopem: - Escherichia coli: růžové tyčinky, Gram-negativní - Staphylococcus aureus: tmavomodré koky, Gram-pozitivní 2. KONTROLA ÚČINNOSTI STERILIZACE VZORKU ZEMINY VAREM A AUTOKLÁVOVÁNÍM Postup: - do sterilní Erlenmayerovy baňky dáme vzorek hlíny, přidáme asi 50 ml sterilního fyziologického roztoku a promícháme - vznikne suspenze - sterilizovanou kličkou naočkujeme vzorek ze suspenze na sterilní krevní agar (postup viz den 1.) - suspenzi asi 10 minut povaříme nad kahanem - převařený vzorek naočkujeme na sterilní krevní agar - suspenzi v baňce (hrdlo překryté alobalem) necháme autoklávovat a znovu naočkujeme - vzorky označíme a necháme 24 h kultivovat v termostatu (při 37° C) Výsledky: - nepřevařený vzorek: a) Müller-Hintův agar: bílé a žluté kolonie; velmi husté b) krevní agar: šedivé hemolyzující kolonie, bílé a žluté kolonie; velmi husté - převařený vzorek: šedivé a bílé kolonie, menší hustota (v prvním rozetření a málo v druhém), neobjevuje se hemolýza - autoklávovaný vzorek: nevznikly žádné kolonie MIKROBIOLOGICKÁ KONTROLA PROSTŘEDÍ Krevní agar v otevřené Petriho misce ponechaný půl hodiny na vzduchu: - vznikly různé kolonie bakterií různé velikosti, nejvýraznější kolonie hemolyzujících bakterií - směs kolonií se podobala bakteriím kultivovaným ze vzorků zeminy, z čehož se dá usuzovat, že spad obsahoval bakterie právě z této zeminy (pokus se zeminou se prováděl dříve než tento) Stůl: a) slepá zkouška: - sterilní pinzetou uchopíme sterilní čtvereček a namočíme ve sterilním fyziologickém roztoku - čtvereček přiložíme na sterilní krevní agar v Petriho misce, přitlačíme a čtvereček vyhodíme b) zkouška čistoty stolu: - sterilním čtverečkem namočeným ve sterilním fyziologickém roztoku důkladně otřeme stůl - opakujeme postup ad a) Výsledek: - „slepá" zkouška: v rozsahu čtverečku se objevily husté homogenní šedivé kolonie s částečnou hemolýzou - pokud by byla dodržena sterilita, bakterie by se neobjevily vůbec - z toho a z výsledku následující zkoušky se dá usuzovat, že čtvereček nebyl ani zdaleka sterilní - zkouška čistoty stolu: v rozsahu čtverečku se objevily bílé, šedivé a hemolyzující šedé kolonie, překvapivě v daleko menší míře než při slepé zkoušce - čtvereček (i fyziologický roztok) zde byl zřejmě sterilní a kultivované bakterie pak pocházely z povrchu stolu Ruce: - na sterilní krevní agar přitiskneme palec: a) neumyté ruce: objevily se bílé a žluté kolonie b) ruce umyté mýdlem: neobjevily se téměř žádné kolonie bakterií c) desinfikované ruce: neobjevily se žádné kolonie DEMONSTRACE PŮSOBENÍ LYSOSYMU NA BAKTERIE - na kolonie Micrococcus luteus naneseme lidské sliny, které obsahují lysosym - po inkubaci cca 1 hodinu lze pozorovat, že bakterie lyzovaly (světle žluté kolonie lehce ztmavly) 3. DETEKCE β-LAKTAMASY: - pozitivní kontrolu provedeme pomocí kmenu bakterií, které exprimují β-laktamasu - zkoušku jsme provedli s Gram-pozitivním kmenem Staphylococcus aureus - dvě až tři kolonie bakterií přeneseme sterilizovanou kličkou do zkumavky s roztokem penicilínu (koncentrace 10000 i.u./ml) - kultivujeme cca 1 hodinu v termostatu při 37°C - po kultivaci do zkumavek přidáme 100 μl roztoku škrobu a poté 50 μl Lugolova roztoku - poté by mělo být pozorovatelné fialové zbarvení roztoku, ale to jsme nepozorovaly, roztok se rovnou odbarvil, což znamená, že pozitivní zkouška proběhla tak, jak měla, a že Staphylococcus aureus exprimuje β-laktamasu (pokud se roztok odbarví do 10 s, je to důkaz přítomnosti kyseliny penicilinové vzniklé působení β-laktamasy) DISKOVÁ DIFÚZNÍ METODA STANOVENÍ CITLIVOSTI K ANTIBIOTIKU Stanovovaly jsme Gram-negativním kmenem E.coli. - tři až čtyři kolonie zkoumaných bakterií přeneseme z původního vzorku do 2 ml sterilního fyziologického roztoku - suspenzi nalijeme na MH agar na Petriho misce, necháme vsáknout a přebytek suspenze odstraníme sterilní pipetou - na agar sterilní jehlou přiložíme kolečka filtračního papíru s vhodnými antibiotiky a kultivujeme v termostatu - měříme zóny inhibice: zóna inhibice musí mít určitý hraniční nebo větší průměr, aby bylo možno konstatovat, že bakterie je citlivá na určité antibiotikum: STANOVENÍ MIC (minimální inhibiční koncentrace) A MBC (minimální baktericidní koncentrace) - stanovení MIC, tedy minimální koncentrace antibiotika, na niž je daná bakterie již citlivá (MIC posuzuje inhibiční účinek antibiotik, tedy inhibici růstu bakterií), se provádí dilučním testem: zkoumaný kmen se naočkuje do média s různými koncentracemi v jamkách mikrotitrační destičky, inkubuje se a pak se posuzuje zákal nebo sediment - první jamka v řadě stoupajících koncentrací, v níž je růst potlačen a médium zůstává čiré, udává MIC - MIC jsme stanovovaly s Gram-negativním kmenem Pseudomonas aeruginosa Tabulka uspořádání mikrotitrační destičky pro stanovení MIC Gram-negativních bakterií a výsledky: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H Ampicilin AMP Ampicilin+ Sublaktam AMS Cefmetazol CMZ Cefurixim CXR Cefoxitin CXT Chloramfenikol CMP Doxycyklin DOX Gentamicin GEN Amikacin AMI Trimethoprim TRI Kolistin COL K.oxolinová OXO/ Furantoin FUR A B C D E F G H - MBC (koncentraci, při jaké antibiotikum bakterie usmrcuje) stanovujeme vyočkováním média s různými koncentracemi antibiotika z dilučního stanovení MIC na destičku s krevním agarem následujícím způsobem: 1. očkovací hřeben namočíme v benzínalkoholu a vypálíme nad plamenem 2. očkovací hřeben namočíme do jamek v první polovině antibiotické destičky a infikovanými jehlami se dotkneme povrchu agaru na destičce s krví 3. ad 1. 4. ad 2. s druhou polovinou antibiotické destičky a destičky s agarem - destičku s krevním agarem kultivujeme 24 h při 37°C Výsledky - MBC: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H Ampicilin AMP Ampicilin+ Sublaktam AMS Cefmetazol CMZ Cefurixim CXR Cefoxitin CXT Chloramfenikol CMP Doxycyklin DOX Gentamicin GEN Amikacin AMI Trimethoprim TRI Kolistin COL K.oxolinová OXO/ Furantoin FUR Porovnání MIC a MBC: ELISA (sérologická metoda) - stanovujeme protilátek IgA proti antigenu bakterie Helicobacter pylori - antigen HP je vázán na dno jamek mikrotitrační destičky - po provedení celého postupu (v případě pozitivního výsledku) vznikle tento sendvič: - do jamek s již navázaným antigenem HP (podle tabulky viz níže) napipetujeme po 100 μl vzorku séra protilátkou IgA a necháme 1 hodinu inkubovat při 37°C 1 2 A BL č.3 B N č.3 C CO č.4 D P č.4 E č.1 č.5 F č.1 č.5 G č.2 č.6 H č.2 č.6 BL... blank - slepá zkouška N... negativní kontrola CO... cut off - hranice absorbance, která se hodnotí jako pozitivní výsledek P... pozitivní kontrola kontroly i vzorky jsou ředěny 1:200 - po inkubaci jamky propláchneme a napipetujeme po 100 μl konjugátu antiIgA s peroxidasou a inkubujeme - po inkubaci propláchneme a napipetujeme po 100 μl substrátu peroxidasy (peroxid vodíku a TMB) - pozitivní reakce se projeví zmodráním původně čirého roztoku substrátu - reakci po chvíli zastavíme přidáním kyseliny sírové - spektrofotometrujeme Výsledky: 1 2 A BL č.3 + B N - č.3 + C CO č.4 - D P + č.4 - E č.1 - č.5 ± F č.1 - č. 5 ± G č.2 - č.6 - H č.2 - č.6 -