1 Protokol z praktik Mikrobiologie 1, letní semestr 2015/2016 Markéta Novotná, 2005 14. – 18. 3. 2016 marketa.novotnaa@gmail.com Úkol č. 1: Příprava preparátů, barvení dle Grama Barvení dle Grama patří mezi základní diferenciální barvení v bakteriologii. Rozděluje bakterie na grampozitivní (zbarvené modře) a gramnegativní (zbarvené červeně). Toto rozdílné zbarvení je způsobeno odlišným složením buněčné stěny bakterií. Některé bakterie se barví modře i červeně, nazýváme je gramlabilní. Jiné bakterie se velmi těžko barví dle Grama, jsou acidorezistentní (rod Mycobacterium). Postup: Nejdříve preparát zafixujeme: 1. Sklíčko si popíšeme ze strany, kde nebude preparát a vyznačíme si tam i kolečko, kam naneseme preparát. Nepopisujeme lihovým fixem, jelikož bychom si ho při barvení vymyli acetonem. 2. Vezmeme si podložní sklíčko a protáhneme ho plamenem. 2. Na podložní sklíčko kápneme kapku fyziologického roztoku. 3. Kličkou naneseme na sklíčko materiál, vedle kapky fyziologického roztoku a následně je smícháme a rozetřeme po vyznačené ploše sklíčka. 4. Počkáme, až preparát zaschne a protáhneme ho 3x plamenem k zafixování. Poté preparát obarvíme: 1. Na fixovaný preparát se nalije krystalová violeť, kterou tam necháme po dobu 30 s – 3 min. 2. Barvivo se slije a preparát se převrství Lugollovým roztokem (vodný roztok jodidu draselného a krystalického jodu 2:3). Lugollův roztok necháme působit opět 30 s – 3 min. (Tím vznikne modré zbarvení.) 3. Preparát opláchneme acetonem do odbarvení, což je několik desítek sekund. (Aceton poruší vnější vrstvu u G- bakterií a tím se vyplaví modrá barva.) 4. Preparát se vymyje vodou. 5. Obarvení zředěným karbolfuchsinem po dobu 3 – 5 minut. (To obarví G- bakterie.) 6. Preparát se promyje vodou. 7. Preparát se vysuší filtračním papírem. 2 Po osušení jsme pozorovaly následující preparáty v mikroskopu: Candida albicans Escherichia coli (G-) Streptococcus agalactia (G+) Staphylococcus epidermidis (G+) Serratia marcescens (G-) Streptococcus pyogenes (G+) Úkol č. 2: Příprava preparátu, barvení pouzder (Klebsiella Pneumoniae) Na černém pozadí vidíme červeně obarvené bakterie v neobarvené bublině = pouzdro. Postup: 1. Nejdříve si připravíme preparát (suspenzi bakterií v tuši) – na podložní sklíčko dáme kapku tuše, přidáme materiál kličkou a rozetřeme jako v případě krevního nátěru. 2. Preparát necháme pořádně zaschnout. 3. Fixujeme – třikrát protáhneme plamenem. 4. Preparát dobarvíme 3 - 5 min. krystalovou violetí nebo zředěným karbolfuchsinem. 5. Velmi opatrně opláchneme vodou. 6. Necháme zaschnout (nepoužíváme filtrační papír!). 3 Následně jsme preparát pozorovaly v mikroskopu: Klebsiella pneumoniae (G-) Úkol č. 3: Kultivační průkaz infekčního agens Má tři části: 1. naočkování materiálu do vhodného živného média 2. inkubace (optimální teplota) 3. vyhodnocení výsledku (namnožení mikroorganismu) Největší diagnostický význam má v bakteriologii a mykologii, ve virologii se jako vhodné živné médium musí používat živé buňky (kuřecí embrya, tkáňové kultury). Postup: I. Naočkování materiálu: 1. Na očkování používáme bakteriologickou kličku, kterou sterilizujeme v plameni kahanu. Pro nabrání materiálu musíme používat vychladlé sterilizované kličky. 2. Sterilizovanou kličkou odebereme kolonii dané bakterie z předem připravené kultury. 3. Tento kultivační vzorek přeneseme následně na vhodnou kultivační půdu. 4. Vzorek nanášíme ke kraji Petriho misky a rozetřeme na malé ploše (inokulum). Kličku sterilizujeme. 5. Nyní vytíráme sady čar, kdy první dvě čáry první sady čar vycházejí z inokula. 4 6. Po nanesení sad čar vždy sterilizujeme kličku v plameni. 7. Sady čar vedeme následovně: 8. Na krevní agar očkujeme G+ bakterie (rostou na něm oba typy bakterií), na endovu půdu naopak G- bakterie (nerostou na ní G+ bakterie). Candidu albicans nanášíme ze zkumavky na Sabouraudův agar. II. Inkubace: Po naočkování necháme vzorky inkubovat v termostatu do následujícího dne (aerobní kultivace – 24h). III. Vyhodnocení výsledků po namnožení organismů: Candida albicans Streptococcus epidermidis Escherichia coli 5 Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae Serratia marcescens Úkol č. 4: Germ-tube test (GT test) Je to test založený na schopnosti Candida albicans vytvářet do 2 hod. po inokulaci na půdy s obsahem koňského či bovinního séra nebo přímo v samotném séru při inkubaci v teplotě 37°C tzv. klíčky = klíčící hyfy. Postup: 1. Do zkumavky s koňským nebo biovinným sérem naočkujeme Candidu albicans a inkubujeme 2 hodiny při teplotě 37 °C. 2. Následně kápneme kapku séra na podložní sklíčko, přikryjeme krycím sklíčkem a mikroskopujeme bez imerzního oleje. 3. Pozorujeme kličky. 6 Úkol č. 5: Kontrola mikrobiologické čistoty ovzduší Orientační stanovení – SPAD. Postup: 1. Položíme otevřenou misku s krevním agarem na libovolné odběrové místo, zaznamenáme čas a na po určité časové době uzavřeme plotnu, kdy opět zaznamenáme čas. 2. Inkubujeme v termostatu. 3. Následující den spočítáme CFU a přepočteme na jednotku času (1 hodina). Výsledek: 44 kolonií / hod Úkol č. 6: Kontrola mikrobiologické čistoty prostředí Zde provedeme 1. Kvalitativní metodu – stěr a 2. Kvantitativní metodu nepřímým otiskem pomocí sterilních filtračních papírů. 1. Stěr Postup: 1. Zvlhčeným tamponém v bujónu setřeme zvolené místo rozměru 10 x 10 cm (1 dm 2 ). My jsme zvolily parapet. 2. Tamponem vytvoříme inokulum, které následně pomocí kličky rozetřeme jako při očkování. 3. Inkubace Petriho misky a následné zhodnocení. Výsledek: 32 kolonií/1 dm 2 2. Nepřímý otisk filtračním papírem Postup: 1. Přeneseme filtrační papíru sterilní pinzetou na povrch krevního agaru – zvlhčení. 2. Otisk zvlhčeného filtračního papíru na odběrovém místě, navlhčíme ještě bujónem. Opět jsme zvolily parapet. 3. Přeneseme filtrační papír na povrch agarové plotny. 4. Odstraníme filtrační papír vyžíhanou sterilní pinzetou. 6. Kultivujeme do následujícího dne v termostatu. 7.Vyhodnotíme. Výsledek: 11 kolonií x 4 → 44 kolonií/1 dm 2 7 Úkol č. 7: Kontrola dezinfekce jedné ruky Postup: 1. Uděláme kontrolní otisk nemytých rukou na krevní agar - pravá nebo levá ruka, každý prst zvlášť. 2. Omyjeme si a vydezinfikujeme ruce. 3. Uděláme otisk po dezinfekci stejným způsobem jako v bodu 1 na krevní agar. 4. Agarové plotny kultivujeme do následujícího dne v termostatu. 5. Zjistíme počet vyrostlých kolonií (CFU) na plotnách K (Nk) a P (Np). 7. Vyhodnotíme. Před umytím rukou: 157 kolonií Po umytí rukou: 26 kolonií Výsledek: (1− 26 157 )×100= 83, 45 % Zaznamenala jsem 83% účinnost umytí rukou, což znamená, že jsem si špatně umyla ruce. Úkol č. 8: Stanovení citlivosti bakterií na antibiotika Provedeme 1.Diskový difuzní test (DDT) – kvalitativní test a budeme si demonstrovat 2.Stanovení MIC, MBC – kvantitativní test (MIC = minimální inhibiční koncentrace, MBC = minimální baktericidní koncentrace) 1. Diskový difuzní test Postup: 1. Kličkou přeneseme 2-3 kolonie (Proteus vulgaris) do zkumavky s fyziologickým roztokem, rozetřeme je o stěnu zkumavky a protřepáním je suspendujeme. Hustota suspenze se upraví dle McFarlandova zákalu - zkumavka 0,5 - 108 buněk / ml. 2. Inokulujeme misku. Vatový tampon smočíme v suspenzi, přebytek tekutiny otřeme o okraj zkumavky. Tamponem naočkujeme celý povrch Mueller-Hintonova agaru. 3. Klademe disky. Antibiotické disky jsou v zásobnících umístěných v dispenzoru, ten je nastaven na výšku agaru. Dispenzor přiložíme na plotnu a stisknutím pružinového pístu jsou disky umístěny na plotnu. 5. Inkubujeme do následujícího dne v termostatu. 6. Odečteme. Měříme průměr inhibiční zóny kolem disku s antibiotikem a porovnáváme se s limitem pro citlivé a rezistentní kmeny. 8 Zóna je větší = kmen je citlivý Zóna je menší = kmen je rezistentní Výsledky: Očkovaly jsme Proteus vuglaris (G-): CAZ: Ceftazidime – 30 mm = citlivý CN: Gentamicin – 0 = rezistentní MEM: Meropenem – 32 mm = citlivý STX: Cotrimoxazol – 0 = rezistentní CIP: Ciprofloxacin – 12 mm = rezistentní AMC: Amoxicilin s klavulanovou kys. – 24 mm = citlivý 2. Stanovení MIC, MBC Princip stanovení MIC: Roztoky antibiotik v kultivační půdě (MH) jsou umístěny ve sloupcích destičky (1 až 12). Po naočkování a inkubaci se stanoví MIC (nejnižší koncentrace antibiotika, která inhibuje růst). Růst se projevuje zákalem. Výsledky: U G+: Penicilin – 0, 1 mg/l Oxacilin – 1 mg/l Ampicilin – 2 mg/l Ampicilin s sublaktamem – 2 mg/l Chloramfenikol – 2 mg/l Cefalotin – 0,2 mg/l Erythromycin – 0,5 mg/l Clindamycin – 0,2 mg/l Doxycyklin – 0,5 mg/l Gentamicin – 0,5 mg/l Teicoplanin – 2 mg/l Vankomycin – 2 mg/l 9 Úkol č. 9: Průkaz katalázy (Staphylococcus x Streptococcus) Postup: 1. Nakapeme kapku 3% H 2 O 2 na vyšetřovanou kolonii. 2. Sledujeme se uvolňování bublinek při pozitivní reakci. Výsledky: Rod Staphylococcus – pozitivní reakce – pozorujeme bublinky. Rod Streptococcus – negativní reakce – nepozorujeme nic. Úkol č. 10: Průkaz vázané koagulázy (shlukovacího faktoru) Princip: Kolonie stafylokoka, které mají vázanou koagulázu (clumping factor) po smíchání s latexovým činidlem (polystyrenové latexové partikule senzibilizované fibrinogenem a IgG) do 20 vteřin aglutinují. Kolonie streptokoka nikoliv. Postup: 1. Do 1. kroužku míchací podložky kápneme 1 kapku latexového činidla (s IgG a fibrinogenem). 2. Do 2. kroužku míchací podložky kápneme 1 kapku kontrolního latexového činidla. 3. V každém kroužku rozmícháme 2 kolonie vyšetřovaného stafylokoka. 4. Sleduje se aglutinace. Výsledky: 1. Kolonie Staphylococcus epidermidis – nedošlo k aglutinaci, negativní test na koagulázu 2. Kolonie Staphylococcus aureus – v 1. kroužku došlo k aglutinaci, pozitivní test na koagulázu 10 Úkol č. 11: CAMP test (Str. pyogenes x S. agalactiae + S. aureus) Slouží k odlišení β-hemolytických streptokoků a umožní nám odlišit Streptococcus agalctiae od Str. pyogenes. Postup: 1. Na krevním agaru skřížíme linie Staph. aureus a β-hemolytických streptokoků. 2. Inkubujeme do následujícího dne v termostatu. Výsledek: Pozitivní – Str. agalactiae vytváří CAMP faktor a dochází k hemolýze erytrocytů. To pozorujeme vzniknutím mašličky v místě protnutí s linií Staph. aurea. Úkol č. 12: Enterotest Enterotest je určen pro rutinní identifikaci významných druhů střevních bakterií z čeledi Enterobacteriaceae. Využívá se diagnostických souprav testů. Testy jsou umístěny v jamkách mikrotitrační destičky, vždy dvě řady po osmi jamkách. Výsledky odečítáme podle barevného vzoru, tyto hodnoty zapisujeme do speciálního formuláře. Z formuláře získáme kód, který odpovídá určité bakterii. 11 Úkol č. 13: Průkaz cytochromoxidázy (OXI test) Diagnostickými proužkami se dotkeneme vyšetřované kultury. Výsledky: Klebsiella pneumoniae – nedošlo k změně zbarvení → negativní Pseudomonas aeruginosa – zčernání → pozitivní Úkol č. 14: Očkování na UriSelect Postup: Očkujeme stejně jako na krevní agar, inkubujeme a pozorujeme.