Vypracované otázky z Biochemie pre Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky 1.LF a VFN (1.paralelka) 2016/2017 Matej Rúra, 2007 I. Základy fyzikální, anorganické a organické chemie 1. Typy chemických vazeb, slabé interakce. 2. Voda a její fyzikální a chemické vlastnosti, význam v organismu. 3. Disperzní soustavy, rozpustnost látek, pravé a koloidní roztoky, emulze a suspenze. 4. Difuze, osmóza, osmotický a onkotický tlak, dialýza, příklady z biochemie. 5. Energetika chemických reakcí, Gibbsova energie a entropie, aplikace na metabolické děje. 6. Chemická rovnováha, Guldbergův-Waageův zákon. Kinetika a energetika následných a vratných reakcí, aplikace v enzymologii. 7. Základní metody pro separaci makromolekul (elektroforéza, chromatografie, vysolování) a jejich využití v klinické praxi. 8. Spektrofotometrie, princip a využití v klinické biochemii. 9. Elektrolytická disociace, disociační konstanta, silné a slabé elektrolyty, příklady z biochemie. 10. Brönstedova teorie kyselin a zásad, rovnováha v protolytických reakcích, příklady z biochemie. 11. Iontový součin vody, pH a jeho význam v medicíně. 12. Amfolyty, jejich vlastnosti, příklady z biochemie. 13. Pufry, výpočet pH, význam v organismu. 14. Oxidace a redukce, oxidoredukční potenciál, závislost na koncentraci reaktantů, příklady z biochemie. 15. Srážecí reakce, součin rozpustnosti, tvorba komplexu, koordinační sloučeniny, příklady a jejich význam v biochemii a medicíně. 16. Chemické vlastnosti hlavních biogenních prvků. 17. Kyslík a jeho anorganické sloučeniny, reaktivita, vlastnosti. 18. Peroxidace lipidů. 19. Toxikologicky významné prvky, mechanismus působení vybraných toxických sloučenin (CO, KCN, HCN, H2S, těžké kovy). 20. Biologický a metabolický význam stopových prvků. 21. Struktura organických sloučenin, izomerie, příklady z metabolických drah. 22. Halogen- a nitroderiváty uhlovodíků, příklady toxikologicky a lékařsky významných sloučenin. 23. Sirné deriváty uhlovodíků, příklady lékařsky významných sloučenin. 24. Aminy, význam v biochemii. 25. Alkoholy, fenoly, aldehydy a ketony, uplatnění v metabolismu. Látky používané jako dezinfekční prostředky, mechanismus jejich účinku. 26. Karboxylové kyseliny, funkční a substituční deriváty karboxylových kyselin, uplatnění v biochemii. 27. Dusíkaté, kyslíkaté a sirné heterocykly, význam. 28. Strukturní charakteristiky aminokyselin, dělení, reakce, význam. 29. Peptidy, peptidová vazba, příklady biologicky významných peptidů. 30. Bílkoviny, struktura, vlastnosti a funkce. 31. Sacharidy, rozdělení, struktura, stereochemie, biologický význam. 32. Reakce a deriváty monosacharidů, disacharidy, O- a N- glykosidová vazba, příklady. 33. Homopolysacharidy a heteropolysacharidy, struktura, výskyt a význam v organismu. 34. Proteoglykany, glykoproteiny, struktura, vlastnosti, příklady. 35. Lipidy − klasifikace, struktura, vlastnosti, funkce v organismu. 36. Mastné kyseliny. 37. Fosfolipidy a sfingolipidy, struktura, vlastnosti a význam. 38. Steroly, žlučové kyseliny a steroidní hormony, struktura, funkce a význam v organismu. II. Základy metabolismu 1. Struktura enzymů (jednoduché a složené; apoenzym a holoenzym; kofaktory: koenzymy, prosthetické skupiny, koaktivátory; oligomerní struktura); mnohočetné enzymové formy a isoenzymy. Klasifikace enzymů. Příklady, význam. 2. Enzymová aktivita a její měření, fyzikálně chemické faktory ovlivňující aktivitu enzymů, regulace enzymů (exprese, kovalentní modifikace, allosterické vlivy). Využití enzymologie v medicíně. 3. Energetika enzymové katalýzy. Kinetika monomerních a oligomerních enzymů, příklady. Km, kcat, katalytická účinnost enzymu. 4. Inhibice enzymů: kompetitivní, nekompetitivní, kovalentní, allosterická. Využití enzymových inhibitorů v medicíně. 5. Dýchací řetězec. Oxidativní fosforylace. 6. Tzv. „makroergní“ sloučeniny, fosforylace na substrátové úrovni, pohon endergonních reakcí. 7. Citrátový cyklus, amfibolický charakter, průběh, regulace. 8. Obecné mechanismy přeměny aminokyselin, deaminace, transaminace, dusíková bilance. 9. Koenzymy oxidoredukčních, karboxylačních a dekarboxylačních reakcí. 10. Tvorba amoniaku, jeho detoxikace, ureosyntetický cyklus a jeho regulace, hyperamonémie. 11. Metabolismus aminokyselin skupiny pyruvátu a oxalacetátu, zapojení těchto aminokyselin do metabolických procesů. 12. Metabolismus uhlíkového skeletu aminokyselin skupiny 2-oxoglutarátu, sukcinyl-CoA, s rozvětveným řetězcem, zapojení aminokyselin do metabolických procesů. 13. Katabolismus aromatických aminokyselin, poruchy. 14. Metabolismus sirných aminokyselin. 15. Biosyntéza, biodegradace a funkce nejdůležitějších biogenních aminů. 16. Konverze aminokyselin do specializovaných produktů: kreatin, S-adenosylmethionin, karnitin, taurin a jejich význam. 17. Glykolýza, regulace, oxidace pyruvátu, pyruvátdehydrogenázový komplex. 18. Glukoneogeneze, regulace. 19. Syntéza a degradace glykogenu, regulace. 20. Pentózový cyklus, regulace. 21. Metabolismus galaktózy a fruktózy, poruchy. 22. Metabolismus kyseliny glukuronové a její význam v organismu. 23. Biosyntéza mastných kyselin. 24. Tvorba ketolátek z acetyl-CoA, metabolické příčiny, význam. 25. Oxidace mastných kyselin, energetický výtěžek, karnitinový systém. 26. Triacylglyceroly, biosyntéza, degradace. 27. Biosyntéza a odbourávání fosfolipidů (glycerofosfolipidů a sfingolipidů). 28. Biosyntéza prostaglandinů, thromboxanů a leukotrienů . 29. Biosyntéza cholesterolu a její regulace, úloha HMG-CoA reduktázy a SREBP proteinu. 30. Přeměna a vylučování cholesterolu, biosyntéza žlučových kyselin a její regulace. 31. Biosyntéza a degradace steroidních hormonů. 32. Transport lipidů, úlohy lipoproteinů, struktura lipoproteinové částice. Elektroforéza lipoproteinů. 33. Transport endogenního a exogenního cholesterolu (vznik, přeměna a úloha chylomiker, VLDL, LDL a HDL lipoproteinů). 34. Biosyntéza tetrapyrrolů – hemu a její poruchy. 35. Degradace tetrapyrrolů – hemu a její poruchy. 36. Metabolismus purinových nukleotidů, regulace, inhibitory, poruchy. 37. Metabolismus pyrimidinových nukleotidů, regulace, inhibitory, poruchy. 38. Reaktivní formy kyslíku, vznik a význam, antioxidanty. III. Základy biochemie orgánů a funkcí 1. Vzájemné biochemické vztahy metabolismu sacharidů a ostatních živin. 2. Glykemie, regulace, diagnostika (oGTT, glykovaný hemoglobin). 3. Metabolismus tukové tkáně. 4. Regulace biosyntézy hemu, rozdíly mezi hepatocytem a erythroidní buňkou, metabolismus železa. 5. Mechanismus účinku hormonů regulujících vodní a minerálový metabolismus. 6. Hormonální regulace energetického metabolismu. 7. Biochemické pochody při trávení živin. 8. Biochemické funkce hepatocytu a jater, možnosti biochemické diagnostiky poškození hepatocytu a jaterních funkcí. 9. Biotransformace endogenních a exogenních látek, typy biotransformačních procesů, toxické a kancerogenní látky v životním prostředí. 10. Pufrové systémy organismu, funkce a význam pro acidobazickou rovnováhu. 11. Metabolismus erytrocytů. 12. Významné proteiny krevní plazmy, význam v organismu (albumin, Ig, proteiny akutní fáze, transportní proteiny). 13. Hemokoagulace, kaskáda koagulačních faktorů, úloha trombocytů. 14. Fibrin, fibrinolýza. Mechanismus účinku antikoagulačních látek. 15. Moč – fyziologické a patologické součásti. 16. Extracelulární matrix, extracelulární polysacharidy a proteiny (kolagen, elastin) – struktura, vlastnosti, funkce. Metabolismus kolagenu. 17. Biochemie pojiva (chrupavka, kost). 18. Biochemie kůže (bariérová funkce, vitamín D, cytokeratiny, mezibuněčná spojení, biosyntéza melaninů). 19. Kontraktilní aparát, řízení kontrakce hladké a kosterní svaloviny. 20. Markery poškození svalové tkáně, význam, stanovení. 21. Biochemie vidění, Waldův cyklus, transducinový cyklus. 22. Biochemie smyslů (chuť, čich). 23. Biochemie nervových synapsí, neurotransmitery. 24. Katecholaminy − biosyntéza, biodegradace. 25. Steroidní hormony − struktura receptorů pro steroidní hormony, mechanismus účinku, funkce. 26. Peptidové hormony − mechanismy účinku, funkce. 27. Lokální mediátory (cytokiny, růstové faktory, chemokiny) − funkce, mechanismus účinku. 28. Hormony štítné žlázy a jejich funkce v regulačních dějích. 29. Struktura a funkce jednotlivých částí imunoglobulinů. Třídy imunoglobulinů, vlastnosti a funkce. Monoklonální protilátky − příprava, využití. 30. Molekulární podstata diverzity imunoglobulinů primární a sekundární protilátkové odpovědi, somatická rekombinace, izotypový přesmyk. 31. Molekulární základy buněčné imunity – rozpoznání patogenu, efektorové mechanismy. MHC molekuly - struktura, funkce, mechanismy prezentace antigenů Tc a Th lymfocytům 32. Základní imunochemické metody. Imunoturbidimetrie, ELISA, RIA. 33. Vitamíny rozpustné v tucích. 34. Vitamíny rozpustné ve vodě. 35. Struktura, složení a vlastnosti buněčných membrán. 36. Transport látek přes membrány. 37. Cytoskelet. 38. Kompartmentace biochemických procesů na subcelulární úrovni. IV. Základy buněčné a molekulární biologie 1. Principy, mechanismy a význam mezibuněčné komunikace a intracelulárních signálně- transdukčních kaskád. 2. Druhy membránových receptorů, jejich ligandy, biologický význam, příklady. 3. Jaderné receptory, heat-shock proteiny, interakce jaderných receptorů s DNA. 4. Amplifikace, integrace a vzájemná komunikace („cross-talk“) signálních drah. 5. G-proteiny − struktura, aktivace, funkce. 6. Typy a úloha druhých poslů v přenosu signálu. 7. Mechanismus a význam reverzibilní fosforylace v signální transdukci. 8. Signalizace stimulovaná růstovými faktory (MAPK, PKB/AKT) a cytokiny (JAK-STAT). 9. Signální dráhy závislé na proteolýze, příklady. Signální úloha HIF v odpovědi na hypoxii. 10. Signalizace využívající NO, medicínský význam. 11. Struktura a funkce DNA. 12. Struktura a funkce RNA. 13. Organizace prokaryontního, eukaryontního a mitochondriálního genomu. 14. Techniky sekvenování DNA (Sanger, NGS, sekvenování lidského genomu). 15. Klasifikace lidské genomové DNA podle repetitivnosti a podle funkce, pseudogeny, transpozony. 16. Replikace eukaryontní DNA, replikační aparát a jeho regulace. 17. Reparace DNA − BER, NER, MMR, přímá reparace modifikovaných bazí. 18. Reparace DNA − HR, NHEJ. 19. Transkripce prokaryontní a eukaryontní genomové DNA. Transkripční faktory, vazba DNA-protein. 20. Struktura mRNA, posttranskripční úpravy (cap, poly A, splicing). 21. RNA interference, druhy a funkce nekódujících RNA. 22. Regulace genové exprese na úrovni transkripce. 23. Genetický kód a jeho vlastnosti. 24. Eukaryontní, prokaryontní translace. Regulace translace. 25. Třídění, transport a posttranslační úpravy proteinů. 26. Biosyntéza glykoproteinů a jejich význam. 27. Vezikulární transport. Endocytóza a exocytóza. 28. Restrikční enzymy a další nástroje genového inženýrství, konstrukce rekombinantních molekul DNA a proteinů. Klonování DNA. 29. Metody frakcionace buňky, elektroforéza nukleových kyselin a proteinů. 30. Polymerázová řetězová reakce, uplatnění PCR v klinické diagnostice, RT-PCR a využití této techniky. 31. Povaha genových mutací, mutace dědičné a získané, polymorfismy, mini- a mikrosatelitové sekvence a jejich využití. 32. DNA a RNA viry – struktura a replikace. 33. Protoonkogeny. 34. Tumor supresorové geny. 35. Buněčný cyklus, úloha komplexů cyklinů a cdks (cyklin dependentní kinázy). 36. Ubikvitinace proteinů a proteazomová degradace proteinů, příklady. 37. Biochemie apoptózy, příklady pro- a antiapoptotických genů/proteinů. Kaspázy. Úloha mitochondrií v buněčné smrti. 38. Epigenetika, modifikace histonů, metylace DNA, význam. I. Základy fyzikální, anorganické a organické chemie I/1.Typy chemických vazeb, slabé interakce Chemická väzba medzi atómami vzniká vtedy, keď sa jej vytvorením uvoľní určitá väzbová energia, ktorej množstvo sa číselne (ale s opačným znamienkom) rovná energii potrebnej na rozštiepenie tejto väzby. Aby väzba vznikla musia sa k sebe obe atómy priblížiť na toľko, aby sa ich väzbové orbitály prekryli a elektróny v týchto orbitáloch musia svojim usporiadaním umožniť vznik elektronového páru a tým aj väzby. Základné typy väzieb sú kovalentná, iónová, kovová, koordinačná a okrem nich poznáme aj slabé väzbové interakcie. Kovalentná väzba vzniká prekrytím orbitálov dvoch atómov (z ktorých každý obsahuje jeden voľný väzbový elektrón) a vytvorenia spoločného elektrónového páru (elektróny musia mať opačný spin), ktorý vzájomne zdieľajú. Ide o najrozšírenejší typ väzby. Datívna kovalentná (koordinačná) väzba je vzniká prekrytím dvoch orbitálov, z ktorých jeden obsahuje dva elektróny a druhý je prázdny. Atóm, ktorý poskytol elektronový pár sa nazýva donorom a atóm, ktorý ho prijíma je akceptorom elektrónového páru. Táto väzba sa využíva v tzv. komplexných zlúčeninách (viac v otázke I/15). Obe väzby majú rôzny pôvod, ale rovnaké vlastnosti. Ak sa prekryjú dva valenčné orbitály za vzniku jedného väzbového páru, vznikne jednoduchá väzba. Prekrytím dvoch alebo viac orbitálov za vzniku viacerých elektrónových párov vznikajú násobné väzby – dvojitá a trojitá. Podľa priestorového usporiadania elektrónových párov rozlišujeme väzby σ a π. Pri σ-väzbe je najväčšia hustota väzbového elektrónového páru na spojnici medzi atómami, naopak pri väzbe π je mimo spojnice v rovine, ktorá spojnicou prechádza. Dá sa povedať, že jednoduchá väzba je tvorená len jednou väzbou σ a násobné jednou väzbou σ ďalšími väzbami π. Hustota elektrónov vo väzbe nie je rozložená symetricky, ale môže byť v priestore rôzne orientovaná, čo podmieňuje aj tvar vzniknutej molekuly. Ak nemá atóm, ktorý má vytvoriť väzbu v orbitále žiadne nepárové elektróny, musí pred vytvorením väzby prejsť do excitovaného stavu s vyššou energiou, pričom je jeden elektrón z dvojelektrónového orbitálu (napr. s) vybudený do ďalšieho pôvodne prázdneho orbitálu (napr. p).Takto vznikne valenčná konfigurácia s dvoma elektrónmi s rovnakým spinom, ktoré sa od seba snažia oddialiť a preto vytvoria hybridný orbitál (v tomto prípade sp), aby sa znížil rozsah vzájomného prekryvu ich dráh. Tento proces sa nazýva hybridizácia. Hybridizáciou sa vysvetľuje vznik rovnocenných kovalentných väzieb z zjednoteným energeticky rozdielnych orbitálov daného atóm za vzniku hybridného orbitálu. Pre každý typ hybridizácie je typické určité priestorové usporiadanie hybridných orbitálov a preto je možné predpovedať aj priestorové usporiadanie kovalnetných väzieb a aj štruktúru molekúl. Ak sú kovalentnou väzbou spojené rovnocenné atómy, ako napr. v molekulách plynov (N 2 , H 2 , Cl 2,.. ), prispievajú spoločné elektróny rovnakým nábojom a molekula sa javí navonok elektricky negatívna, väzba v tomto prípade sa nazýva nepolárna. Opakom je väzba polárna, ktorú vytvárajú medzi opačne nabité častice. Táto väzba vzniká vtedy, keď sa viažu dva rôzne atómy, ku ktorým nie je elektrónový pár priťahovaný rovnakou silou a posúva sa bližšie k atómu, ktorý ho viac priťahuje. Tento atóm získa čiastočný záporný náboj (δ-) a na druhom atóme bude prevládať čiastočný kladný náboj (δ+) a väzba nadobudne polárnej povahy. Vzniknutý dipólový moment väzby bude aj dipólovým momentom celej molekuly. Ide o vektorovú veličinu, takže u viacatómových molekúl sú ich dipólové momenty vektorovým súčtom jednotlivých väzieb. Iónová väzba vzniká vzájomným priťahovaním katiónu s malou hodnotou elektronegativity s aniónom s vysokou hodnotou elektronegativity. Prechodom elektrónu z atómu s nízkou elektronegativitou (napr. alkalického kovu) na atóm s vysokou elektronegativitou (napr. halogénu)vznikne vo vonkajších vrstvách stabilnejšia elektrónová konfigurácia (elektrónový oktet ako v atómoch vzácnych plynov): napr. Na + odpovedá neónu a Cl - argónu. Vzniká nesúhlasný náboj, ktorého vplyvom sú k sebe obe ióny viazané elektrostatickou silou. Za ideálnu iónovú väzbu považujeme elektrostatickú súdržnosť iónov, pri ktorej nevzniká vzájomná deformácia elektrónových obalov. Toto pozorujeme hlavne u solí, ktoré tvoria jednomocné a dvojmocné ióny s elektrónovou konfiguráciou vzácneho plynu, tieto soli sú vo vodných roztokoch úplne disociované. Kovová väzba vzniká medzi atómami kovov v tuhom stave. Aj v tomto prípade atómy zdieľajú spoločné elektróny, ktoré sú však veľmi pohyblivé a pohybujú sa v celej kryštálovej mriežke v energetických pásmach, ktoré vznikli prekrytím orbitálov. Medzi slabé väzbové interakcie radíme vodíkovú väzbu, Van Der Waalsové sily, hydrofóbne interakcie a iné. Vodík, ktorý je viazaný kovalentnou väzbou na atóm s vysokou elektronegativitou (napr. O, F, N,...) je schopný sa združovať s ďalším voľným elektrónovým párom týchto elektronegatívnych atómov a nezáleží či sú z tej istej alebo inej molekuly. Táto väzba sa nazýva vodíková väzba (vodíkový mostík) a je buď intramolekulárna alebo intermolekulárna. Zlúčeniny, ktorých molekuly sú spojené vodíkovými väzbami, majú vyššie teploty topenia a varu, než by odpovedali ich zloženiu (napr. H 2 O, HF,...). Vodíková väzba vzniká veľmi ľahko medzi molekulami vody, každá molekula vody sa môže združiť so štyrmi ďalšími molekulami. Vodíková väzba je veľmi dôležitá v biochémii pri udržiavaní štruktúry a tvaru bielkovín a nukleových kyselín. Všetky atómy a molekuly sa k sebe do určitej miery na krátku vzdialenosť vzájomne priťahujú. Toto priťahovanie je dôsledkom Van Der Waalsových síl. Tieto sily spôsobujú napr. kondenzáciu plynov na kvapaliny a tuhnutie kvapalín na pevné látky aj napriek tomu, že medzi molekulami neexistuje žiadna kovalentná, iónová alebo kovová väzba. Fyzikálne javy ako trenie, viskozita, adhézia, povrchové napätie, etc. majú tiež pôvod v týchto silách. Tieto sily majú význam, ak sú častice blízko u seba, ale priťahujú sa k sebe iba dovtedy, kým sa ich vonkajšie elektróny nezačnú odpudzovať, preto musia častice zostať v určitej vzdialenosti od seba (van der Waalsov polomer). Veľkosť Van Der Waalsových síl rozhoduje o skvapalniteľnosti plynu, čím sú sily slabšie, tým ma nižšiu teplotu varu a horšie sa skvapalňuje. Povrchová adsorpcia na častíc na adsorbant tiež záleží od týchto síl, ide o veľmi slabú silu a dá sa ľahko zrušiť (napr. adsorpcia plynov na aktívnom uhlí). Ako hydrofóbne interakcie označujeme väzby medzi hydrofóbnymi skupinami alifatických a aromatických uhľovodíkov a ich derivátov vo vodnom prostredí. Energia tejto väzby je nepatrná, ale ak sa vyskytuje vo veľkom množstve, dosahuje značnú pevnosť. Veľkosť interakcie sa zisťuje zo zmien entropie systému. Hydrofóbne interakcie majú význam v biochémii a to napr. pri vytváraní biologických membrán. I/2. Voda a její fyzikální a chemické vlastnosti, význam v organismu Voda je najrozšírenejšou molekulou v ľudskom tele, kde tvorí až 60% jeho hmotnosti. Molekula vody sa skladá z dvoch atómov vodíku a jedného atómu kyslíku a má molárnu hmotnosť 18g/mol.Vďaka značnému rozdielu elektronegativít medzi kyslíkom a vodíkom sú väzby v molekule vody polárne a molekula je teda dipólom. Existencia dipólu umožňuje vznik vodíkových väzieb nielen medzi molekulami vody navzájom, ale aj s molekulami iných zlúčenín, ktoré obsahujú atómy kyslíku alebo dusíku (atómy s voľným elektrónovým párom, akceptory vodíku) alebo skupiny –OH, -NH 2 , =NH (obsahujú vodík viazaný na silno elektronegatívny atóm, donory vodíka). Má to veľký význam pre fyzikálne vlastnosti vody, ktoré neodpovedajú jej malej molekulovej hmotnosti – napr. vysoké teploty topenia a varu, vysoké molárne teplo vyparovania, vysoká tepelná vodivosť, vysoká relatívna permitivita,.. Vďaka vodíkovej väzbe molekuly vody vytvárajú oblasti s organizovanou štruktúrou aj v kvapalnom skupenstve. Zlúčeniny, ktoré sú schopné vytvárať vodíkové väzby s vodou zvyšujú na membránach a v bunkách jej usporiadanosť. Taktiež zabudovanie vody do bielkovín často podmieňuje ich biologicky aktívnu konformáciu (napr. u kolagénu). Vysoké molárne teplo vyparovania a vysoká tepelná vodivosť sú podstatou termoregulačných schopností vody v organizme. Schopnosť sublimácie však nesúvisí priamo s funkciami živého organizmu, ale využíva sa v lyolizácii. Lyolizácia alebo vákuová mrazová sublimácia je metóda izolácie biologického materiálu z vodných roztokov bez straty biologickej aktivity. Vzhľadom k svojej vysokej relatívnej permitivite je voda výborné polárne rozpúšťadlo. Výborne rozpúšťa iónové zlúčeniny, polárne látky a hydrofilné koloidy. Vo vode sú rozpustné pevné látky, kvapaliny a aj plyny, zvlášť tie, ktoré s ňou reagujú (napr. HCl, NH 3 , etc.). Okolo nabitých častíc rozpustených látok sa vytvorí z vody hydratačný obal usporiadaním svojich dipolárnych molekúl podľa náboja iónu. Rozpustnosť neutrálnych molekúl polárnych látok sa uskutočňuje pomocou tvorby vodíkových mostíkov s molekulami vody. Pre organizmus je voda nielen najdôležitejším rozpúšťadlom, ale aj transportným médiom rozpustených látok. V metabolizme vystupuje voda ako substrát aj ako produkt. Najvýznamnejším metabolickým dejom, kde je produktom voda je oxidatívna fosforilácia (dýchací reťazec). Taktiež dehydratácie, zahrňujúce odštiepenie vody, sú častým krokom metabolických reakcii (napr. eliminácia vody v priebehu biosyntézy mastných kyselín). V katabolickom deji, β-oxidácia mastných kyselín, má voda zas úlohu substrátu (adícia vody na dvojitú väzbu – hydratácia dvojitej väzby). Pri hydrolytickom štiepení väzieb proteínov, sacharidov, lipidov, ale aj nukleových kyselín je prítomnosť vody nevyhnutná. I/3. Disperzní soustavy, rozpustnost látek, pravé a koloidní roztoky, emulze a suspenze. Disperzné sústavy sú viaczložkové sústavy látok, z ktorých aspoň jedna vytvára spojité prostredie (disperzné prostredie, ktoré je v kvantitatívnej väčšine) a v ňom sú rozptýlené (dispergované) ďalšie látky (disperzný podiel). Disperzné sústavy delíme podľa veľkosti dispergovaných častíc na homogénne a heterogénne a podľa skupenstva na pevné, kvapalné a plynné (tabuľka nižšie). Hrubé disperzie obsahujú rozpustené častice o veľkosti viac ako 10 -7 m. Častice neprechádzajú papierovými filtrami, nedifundujú, opticky sú nepriehľadné a sú viditeľné v optickom mikroskope a staním samovoľne sedimentujú. Typickým príkladom hrubej disperzie v ľudskom tele je krv. Emulzia je heterogénna zmes dvoch kvapalín, ktoré sú navzájom voľne nemiešateľné. Väčšinou ide o kvapaliny s rôznou hustotou a polaritou (napr. olej a voda). Stabilita emulzií je malá a aby sa emulgované častice nezhlukovali, teda aby emulzia bola stabilizovaná, je nutné pridať emulgátor. Emulgátory sú väčšinou tenzidy (látky znižujúce povrchové napätie medzi dvomi fázami). Ako emulgátory pôsobia mydlá, saponáty, žlčové kyseliny, fosfolipidy, etc. Emulgátor obsahuje nepolárnu a polárnu časť molekuly, v emulzii sa nepolárny koniec orientuje k nepolárnej kvapaline (napr. olej) a svojou polárnou časťou sa orientuje k polárnej kvapaline (napr. voda). Suspenzia je heterogénna zmes tuhej látky v kvapaline. Medzi dôležité vlastnosti suspenzií patrí samovoľné, ale pomalé oddeľovanie zložiek zmesi (napr. sedimentáciou). Príkladom suspenzie môže byť už spomínaná krv. Analytické disperzie (pravé roztoky) sú homogénne (jednofázové) disperzné sústavy tvorené disperzným prostredím (rozpúšťadlom) a časticami rozpustených látok, avšak, aby bola sústava homogénna, musia mať rozpustené častice veľkosť menšiu než 10 -9 m. V ľudskom tele je hlavným disperzným prostredím voda a preto väčšinou hovoríme v tele o vodných roztokoch. V ľudskom tele sú tiež významné aj roztoky makromolekulárnych disperzií (alebo koloidné roztoky), ktoré obsahujú rozpustené častice o veľkosti od 10 -7 do 10 -9 m (napr. proteíny, nukleové kyseliny, lipoproteínové častice). Tieto sústavy sú prechodom medzi homogénnymi a heterogénnymi sústavami. Vodný roztok koloidu sa nazýva hydrosol. Niektoré vlastnosti koloidov sa líšia od vlastností pravých roztokov, ide napríklad o stabilitu alebo možnosťou optického rozlíšenia rozpustených častíc. Rozpustenú látku môžeme z koloidu ľahko vyzrážať napr. pridaním elektrolytu, zmenou pH alebo teploty. Makromolekuly sú v dispergovanom stave udržiavané svojim nábojom a solvatačným obalom. Vodné koloidné sústavy podľa vlastností delíme na lyofóbne, lyofilné a micelárne koloidy. Lyofóbne koloidy sú tvorené zhlukmi častíc nízkomolekulárnych látok v roztoku, kde sa častice rozpúšťadlom nezmáčajú (sú napr. hydrofóbne). Ich stabilita je podmienená elektrickými nábojmi dispergovaných častíc. Ľahko sa zrážajú a ich trvanlivosť je obmedzená. Stabilitu lyfóbnych koloidov môžeme upravovať pridaním lyofilných koloidov (nižšie množstvo labilizuje, vyššie stabilizuje). Lyofóbne roztoky sa využívali v niektorých vyšetrovacích metódach a dnes sa využívajú napr. na farbenie bielkovín alebo v iných histologických metódach. Lyofílné koloidy sú najčastejšie roztoky makromolekúl, ktoré majú veľkú afinitu k molekulám rozpúšťadla, teda častice sa v prostredí zmáčajú (vytvára sa okolo molekuly solvatačný obal). Niektoré koloidy (napr. roztoky bielkovín, aminokyselín,...) majú charakter amfolytov, preto ich vlastnosti závisia na pH roztoku (viac otázka I/12). Medicínsky sú významne koloidy hydrofilných biopolymérov (bielkoviny, nukleové kyseliny, polysacharidy,...). Niektoré lyofilné koloidy sa vedia zmeniť na rôsolovitú hmotu - gél, vtedy gél absorboval všetko rozpúšťadlo (prevaha tuhej fázy). Dokážu sa na gél premeniť ochladením dostatočne koncentrovaného roztoku a zahriatím sa premenia naspäť na koloid. Micelárne koloidy alebo micely vznikajú z roztokov látok, ktoré majú polárnu a nepolárnu časť molekuly (mydlá, fosfolipidy). Z molekúl vzniká zhluk molekúl, kde je nepolárna časť orientovaná smerom od rozpúšťadla a polárna smerom k rozpúšťadlu. Rozpúšťanie látok je zložitý dej, pri ktorom dochádza k zániku súdržných síl kryštálovej mriežky pôsobením častíc rozpúšťadla. Uvoľňovaním častíc dochádza k preorganizovaniu molekúl danej látky a rozpúšťadla a nastáva ich vzájomná integrácia (v prípade vody ide o hydratáciu). Počas tohto procesu sa uvoľní hydratačná energia. Rozdiel medzi energiou mriežky (energia potrebná na rozpad mriežky) a hydratačnou energiou označujeme ako rozpúšťacie teplo, ktoré sa buď uvoľní do okolia alebo sa z okolia spotrebuje. Pomer medzi rozpustenou látkou a rozpúšťadlom v nasýtenom roztoku sa nazýva rozpustnosť látky. O miere rozpustnosti látky rozhodujú súdržné sily oboch látok a určitá podobnosť (hlavne v polarite) medzi rozpustenou látkou a rozpúšťadlom. Nepolárne látky sa dobre rozpúšťajú v nepolárnych rozpúšťadlách (napr. uhľovodíky rozpustíme v sirouhlíku CS 2 ), naopak polárne a iónové zlúčeniny sa v nepolárnych rozpúšťadlách rozpúšťajú obmedzene alebo vôbec. Polárne a iónové látky sa dobre rozpúšťajú v polárnych rozpúšťadlách (najčastejšie vo vode). Rozpustnosť látok v danom rozpúšťadle väčšinou závisí od teploty, tlaku (hlavne u plynov) a koncentrácii iných látok v danom roztoku. Väčšina látok sa rozpúšťa lepšie pri vyššej teplote, ich rozpúšťanie je endotermický dej. Rozpustnosť niektorých látok je exotermický dej a preto so stúpajúcou teplotou sa látka rozpúšťa menej (napr. Na 2 SO 4 , Na 2 CO 3 , Ca(OH) 2 ,...). Rozpustnosť nasýteného roztoku môžeme vyjadriť ako jeho molárnu koncentráciu. Niektoré elektrolyty sú vo vode málo rozpustné a ich rozpustnosť vyjadrujeme rovnovážnou konštantou, ktorú nazývame súčin rozpustnosti. Všeobecne sú málo rozpustné uhličitany, sírany, hydroxidy, sulfidy, halogenidy, a oxidy kovov alkalických zemín a d-prvkov. Naopak veľmi rozpustné sú takmer všetky soli alkalických kovov, väčšina amónnych solí a skoro všetky dusičnany. Zloženie roztoku sa dá vyjadriť viacerými spôsobmi. Najčastejšie sa používa látková koncentrácia c = n/V [mol/l], hmotnostná koncentrácia c = m/V [g/l], ďalej sa ešte používa hmotnostný zlomok w = m látky /m roztoku , ktorý sa vyjadruje v percentách. Disperzní prostředí Disperzní podíl (částice) Plynné Kapalné Tuhé Plynný Směsi plynů (vzduch) Pěny Roztoky plynů v kapalinách Tuhé pěny (inkluze) (pěnové sklo, guma, umělé hmoty) Kapalný Aerosoly (mlha) (podávání léků) Emulze (mléko, majonéza) – roztoky kapalin v kapalinách Tuhý Dým (podávání léků) Suspenze (krev) Lyosoly a koloidní roztoky Roztoky tuhých látek v kapalinách Tuhé směsi Tuhé roztoky (slitiny, sklo) I/4. Difuze, osmóza, osmotický a onkotický tlak, dialýza, příklady z biochemie. Ak pridáme do roztoku čisté rozpúšťadlo alebo roztok s nižšou koncentráciou, bez toho, aby došlo ku premiešaniu, rozpustená látka začne pozvoľna prenikať z miesta s vyššou koncentráciou do miesta s nižšou koncentráciou. Tento jav sa nazýva difúzia, ktorej príčinou je tepelný pohyb častíc, častice sa pohybujú v smere koncentračného spádu (obrázok). Difúzia je základom viacerých biologických dejov ako napr. vstrebávanie vody, dýchanie, prenos vzruchu etc. Priebeh difúzie popisujú Fickové zákony (1. Zákon popisuje koľko častíc prejde plochou za jednotku času a 2. Zákon popisuje zmenu koncentrácie častíc v bode) a pomocou nich sa dá vypočítať difúzny koeficient (D) [m.s -1 ], ktorý určuje veľkosť difúzie: 퐷= 퐾 퐵. 푇 푓 = 푅.푇 푁.푓 = 퐾 퐵 .푇 6.휋.휂.푟 , kde K B je Boltzmanová konštanta (1,38.10 -32 J.K -1 ), T je termodynamická teplota, f je koeficient trenia (závisí na veľkosti, tvare a množstve častíc), R je plynová konštanta, N je Avogadrová konštanta. Tretí výraz vyjadruje difúzny koeficient pre difúziu guľovitej častice o polomere r, ktorá sa pohybuje v prostredí o viskozite η [kg.m -1 .s -1 ] (odpor kvapaliny pôsobiací proti pohybu kvapaliny). Každá látka má vlastný difúzny koeficient. Ak roztok od rozpúšťadla oddelíme polopriepustnou membránou, ktorá bude prepúšťať iba molekuly rozpúšťadla, začnú sa častice rozpúšťadla pohybovať smerom do koncentrovanejšieho roztoku v snahe ustálenia rovnováhy. Tento dej nazývame osmóza a ide o samovoľné zrieďovanie koncentrovanejšieho roztoku prenikaním častíc rozpúšťadla cez polopriepustnú membránu. Na membránu počas osmózy je vyvíjaný hydrostatický tlak, ktorý nazývame osmotický tlak. Jeho veľkosť sa rovná tlaku, ktorý je nutné vynaložiť na roztok, aby svoj objem osmózou nezväčšoval. Osmotický tlak si môžeme predstaviť ako silu všetkých častíc, ktorou narážajú na membránu. Je úmerný látkovej koncentrácii rozpustených častíc bez ohľadu na ich veľkosť alebo náboj, rozhodujúci je iba počet osmoticky účinných častíc (rovnakú osmotickú účinnosť má napr. jedna molekula glukózy, albumínu, katión Na + , anión Cl - , etc.). Koncentráciu osmoticky aktívnych častíc, ktoré určujú veľkosť osmotického tlaku môžeme vyjadriť osmolaritou a osmolalitou. Osmolarita [mol/l] vyjadruje celkový počet osmoticky účinných častíc v jednotkovom objeme kvapaliny. Osmolaritu zistíme tak, že látkovú koncentráciu (c) vynásobíme počtom iónov, ktoré vzniknú disociáciou látky (i). Osmotická koncentrácia elektrolytu bude vždy vyššia ako osmotická koncentrácia nedisociovanej látky s rovnakou látkovou koncentráciou. Výraz i.c platí pre veľmi zriedené roztoky, pri menej zriedených roztokoch by sme mali miesto koncentrácie uvažovať aktivitu iónov. Osmolalita [mol/kg] vyjadruje počet osmoticky účinných častíc v 1kg rozpúšťadla a teda vyjadruje aj osmotický tlak v 1kg rozpúšťadla. Nezáleží na tom, či ide o ióny alebo molekuly, nezáleží ani na veľkosti častíc. Výpočet osmolality je niekedy zložitý a preto sa meria osmometrom. Osmolalita krvnej plazmy sa dá odhadnúť z látkových koncentrácií hlavných súčastí séra pomocou empirického vzťahu: osmolalita [mmol/l] = 2 [Na + ] + [glukóza] + [močovina] Vzorec zahrňuje bežne merané zložky plazmy (glukózu a močovinu), ktorých koncentračné odchýlky môžu výrazne ovplyvniť osmolalitu a tiež hlavný katión Na + s koeficientom 2 pre započítanie odpovedajúcich aniónov (Cl - ). Osmotický tlak rastie rovnomerne so stúpajúcou teplotou a je priamo úmerný koncentrácii roztoku. Priame meranie osmotického tlaku je veľmi náročné, preto sa jeho presná hodnota vypočíta zo zníženia bodu tuhnutia (kryštaloskopické meranie, využíva sa pre biologické tekutiny) alebo zvýšenia bodu varu. Ako osmotický tlak, tak aj zníženie bodu tuhnutia závisí od osmoticky účinných častíc. Prítomnosť 1 molu osmoticky aktívnych častíc zníži bod tuhnutia 1 litru vodného roztoku látky o 1,86°C. Osmotický tlak, rovnako ako bod tuhnutia chápeme ako termodynamickú vlastnosť roztoku. Ak má roztok osmotický tlak 1kPa, neznamená to, že roztok vykazuje priamo tento tlak, ale že roztok by bol v rovnováhe s čistým rozpúšťadlom, oddeleným polopriepustnou membránou, ak by bol na roztok vyvinutý dodatočný tlak 1kPa. Osmotický tlak veľmi zriedených roztokov je zhodný s osmotickým tlakom ideálnych plynov a preto ho môžeme vypočítať ako: π = i.c.R.T , kde i je počet osmoticky aktívnych častíc, c je látková koncentrácia, R je plynová konštanta (8,134 J.mol -1 .K -1 ) a T je teplota. Hodnota osmotického tlaku je úmerná počtu častíc v určitom objeme a pri stálej hmotnostnej koncentrácií dvoch rôznych látok (napr. NaCl a albumín) je ich osmotický tlak nepriamo úmerný molekulovej hmotnosti. Pretože bielkoviny majú veľké molekuly, obsahujú ich roztoky málo častíc a ich osmotický tlak je nízky. Zákony o osmotickom tlaku platia len pre veľmi silno zriedené roztoky bielkovín. Pri vyšších koncentráciách je vzostup tlaku väčší než zodpovedá koncentrácií, pretože časť rozpúšťadla je priťahovaná hydrofilnými skupinami bielkovinovej molekuly. Ide o tzv. bobtnavý tlak, ktorý zvyšuje teoretickú hodnotu osmotického tlaku, tento koloidne osmotický tlak bielkovín nazývame onkotický tlak, v krvnej plazme je jeho hodnota 25 mmHg. Vo vnútornom prostredí organizmu je osmotická koncentrácia veľmi udržovaná, osmolarita krvnej plazmy je 0,3 mol/l. Roztoky s rovnakou osmolaritou krvná plazma sú izotonické, s vyššou sú hypertonické a s nižšou sú hypotonické. Membrány buniek sú semipermeabilné a teda sú priepustné pre vodu. V hypotonickom prostredí voda vstupuje do bunky (napr. erytrocytu), zväčšuje jej objem až jej membrána praská (hemolýza). Naopak v hypertonickom prostredí sa voda pohybuje opačným smerom a bunka sa zmršťuje až stratí svoju biologickú aktivitu. Cez membrány buniek môžu voľne prechádzať aj molekuly plynov (O 2 , N 2 , CO 2 , CO, NH 3 , NO, NO 2 ,...), niektoré nízkomolekulové nepolárne látky (uhľovodíky, steroidy,...) a polárne látky (močovina, etanol,...). Dialýza je oddelľovacia metóda, ktorá dokáže oddeliť makromolekulové látky od mikromolekulových. Dialýza je založená na fakte, že makromolekuly sú príliš veľké na to aby prešli polopriepustnou membránou, pričom mikromolekulové látky ňou prejdú a rozdelia sa rovnomerne na obe strany membrány. Po opakovanej výmene látok na membráne, má roztok v dialyzačnom čreve rovnaké vlastnosti ako má okolitý roztok. Dialýza sa využíva ako liečebný postup pri náhrade nefunkčných ľadvín. Na jednej strane membrány sa nachádza dialyzačný roztok, ktorý odoberá z krvi na druhej strane membrány splodiny metabolizmu (obrázok vedľa). V praxi sa využíva aj peritoneálna dialýza, kde sa ako membrána využíva peritoneum. Pacient sa po zavedení katétru do brušnej dutiny udržiava v metabolicky uspokojivom stave pravidelným napúšťaním a vypúšťaním dialyzačného roztoku. I/5. Energetika chemických reakcí, Gibbsova energie a entropie, aplikace na metabolické děje. Energetika chemických reakcií vysvetľuje, prečo niektoré reakcie prebiehajú a iné nie, pri akých reakciách sa energia uvoľní, kedy treba naopak treba pre priebeh reakcie energiu dodať, aká časť uvoľnenej energie môže byť využitá organizmom. Aby sme mohli dôjsť k použiteľným záverom, aj v prípade tak komplikovaného systému, akým je ľudský organizmus, musíme zaviesť niekoľko zjednodušených podmienok. Organizmus je otvorený systém, takže si s okolím vymieňa hmotu aj energiu. Pre úvahy o energetických premenách v priebehu chemických reakcií v organizme sa používa ako model uzavretý systém, ktorý si s okolím vymieňa len energiu. Aby sa tento model čo najviac podobal organizmu, budeme uvažovať len chemické reakcie, čo prebiehajú za konštantnej teploty a tlaku a teda vždy o izotermicko-izobarický dej. Celkový tepelný obsah uzavretého systému za konštantnej teploty a tlaku sa nazýva entalpia (H) [J,kJ]. Entalpia je stavová veličina, čo znamená, že jej hodnota závisí iba usporiadaní systému a nezávisí na spôsobe, ako sa systém do tohto usporiadania dostal. Entalpia chemickej sústavy sa dá experimentálne zistiť pri jej spálení v kalorimetre. Celková hodnota H závisí od dvoch veličín U a pV. U (vnútorná energia; J, kJ) je stavová veličina, ktorá je výsledkom pohybu a priestorového usporiadania všetkých atómov v sústave. pV (vonkajšia energia; J, kJ) je energia, ktorá má svoj pôvod v priestore, ktrý zaujíma. V priebehu chemickej reakcie dochádza k zmene entalpie sústavy, pri zmene obidvoch veličín a teda hodnotu H a zmenu jej hodnoty vypočítame ako: H = U + pV ∆H = ∆U + p∆V Zmena U je výsledkom zániku pôvodných a vzniku nových väzieb medzi atómami a tiež zmien v ich priestorovom usporiadaní. Zmena V znamená zmena objemu sústavy, platí, ak sa reakcie zúčastnia plyny. Chemickú reakciu si môžeme predstaviť ako premenu substrátov na produkty a teda prechod z počiatočného stavu 1 (H 1 ) do stavu konečného 2 (H 2 ). Tento prechod sa vyznačuje zmenou entalpie: ∆H = H 2 – H 1 V priebehu reakcie môžu nastať dva prípady: 1) H 2 <H 1 , potom ∆H<0. Tepelný obsah substrátov v reakcií je vyšší ako tepelný obsah produktov, uvoľní sa reakčné teplo, rekcia je exotermická 2) H 2 >H 1 , potom ∆H>0. Tepelný obsah substrátov v reakcií je nižší ako tepelný obsah produktov, teplo treba dodávať, reakcia je endotermická Experimentálne sa zmena entalpie dá zmerať, ak príslušnú reakciu uskutočníme v kalorimetri. Celkový tepelný obsah sústavy sa môže premeniť na iný druh energie alebo konať prácu (1. Termodynamický zákon), ale nie bezo zvyšku (2. Termodynamický zákon). Pre organizmus je dôležitá tá časť entalpie, ktorá sa môže premeniť na inú formu energie. Táto časť entalpie je stavová veličina, ktorú nazývame Gibbsova energia alebo voľná energia G [J, kJ]. Zvyšok tepelného obsahu sa dá premeniť na teplo. Tento zvyšok je vyjadrený súčinom TS, kde T je absolútna teplota [K] a S je stavová veličina entropia [J/K]. Gibbsovú energiu potom môžeme vyjadriť ako: G = H – TS Entropia je zvláštna stavová veličina, má vzťah k miere neusporiadanosti systému, čím vyššia je neusporiadanosť systému, tým väčšia je jeho entropia. Vďaka tomuto sa môžeme na entropiu pozerať aj ako na mieru pravdepodobnosti určitého usporiadania systému, čím väčšia je neusporiadanosť sústavy, tím viac je možností pre jej uskutočnenie, a teda je väčšia pravdepodobnosť na jej uskutočnenie. Entropia je zároveň aj mierou informácie, čím je systém usporiadanejší (má menšiu entropiu), tým viac informácií je v ňom obsadené. Reakcie, pri ktorých dochádza k vzrastu entropie (∆S>0), prebiehajú smerom k väčšej neusporiadanosti systému, prebiehajú vždy samovoľne. Naopak vytváranie usporiadaných systémov, prebieha je v smere znižovania entropie, vyžaduje dodanie energie a neprebieha teda samovoľne. Na entropii taktiež záleží aj veľkosť využiteľnej energie, čím menšia je entropia sústavy, tým väčšie množstvo voľnej energie je obsiahnuté v sústave. Organizmu prinášajú najväčšie množstvo využiteľnej energie štruktúrne zložité látky (a teda látky s malou entropiou) – polysacharidy, bielkoviny, lipidy. Pri syntéze týchto látok je naopak spotrebované veľké množstvo energie. Pri chemickej premene sa mení obsah voľnej energie reagujúcich látok zmenou dvoch stavových veličín – entalpie a entropie: ∆G = ∆H - T∆S Analogicky ako pri zmene entalpie, sledujeme zmeny Gibbsovej energie medzi konečným stavom G 2 a počiatočným stavom G 1 systému: ∆G = G 2 – G 1 Uvažujeme teda o troch prípadoch: 1)G 2 <G 1 , tak ∆G<0. Voľná energia substrátov je väčšia ako voľná energia produktov, počas reakcie sa energia uvoľní, ide o exergonický dej. Uvoľnená energia sa môže zmeniť na užitočnú prácu alebo na iný druh energie (v bunkách napr. na biosyntézu ATP) V organizme majú tento charakter katabolické reakcie, ktoré postupnou degradáciou štruktúrne zložitých živín uvoľňujú využiteľnú energiu. 2)G 2 >G 1 , tak ∆G>0. Nastáva opačná situácia, volľná energia substrátu je nižšia ako produktov, reakcia je endergonická, ∆G je mierou energie, ktorú je treba do reakcie dodať. Príkladom sú anabolické deje v organizme, zahŕňajúce biosyntézu látok a budovanie potrebných štruktúr, aktívny transport cez membránu proti koncentračnému spádu a mechanickú prácu (napr. svalová kontrakcia) 3)∆G=O. Tento vzťah je považovaný za kritérium rovnováhy, všetky deje sú vratné a teda nedochádza k zmene energetického obsahu sústavy. Gibbsová energia je stavová veličina, ktorá hodnotí energetické premeny. Jej zmena odpovedá rozdielu ∆G medzi počiatočným a konečným stavom a nezáleží na spôsobe uskutočnenia tejto zmeny. Ak je celková ∆G vzťahujúca sa na metabolickú dráhu (sústava následných reakcií) negatívna, tak je priebeh celého deja samovoľný: ∆G 1 + ∆G 2 +...∆G n = ∆G celková < 0 Priebeh endergonických dejov je umožnený zložením s exergonickými dejmi (vždy cez spoločný medziprodukt). Ako príklad môže slúžiť uskutočňovanie endergonických dejov zložením s hydrolýzou ATP, ktorá je exergonická. Energia uvoľnená pri hydrolýze ATP je dôsledkom toho, že štruktúry hydrolytických produktov (ADP a P i v H 2 O) sú energeticky o veľa viac stabilnejšie ako sústava ATP a voda. Vďaka spojením reakcie s hydrolýzou ATP sa môže uskutočniť fosforylácia substrátov v priebehu metabolických dejov. Energetický rozdiel medzi hydrolytickým štiepením ATP a prenosom fosfátu na substrát je uložený vo zvýšenom energetickom obsahu vzniknutého fosforylovaného substrátu v porovnaní s nefosforylovaným substrátom. Táto energia umožňuje zapojenie fosforylovaného substrátu do metabolických premien. Na zmene Gibbsovej energie v priebehu chemickej reakcie sa podieľajú dva faktory – zmena štandardnej Gibbsovej energie ∆G 0 , ktorá charakterizuje danú reakciu prebiehajúcu za štandardných podmienok; a zmena koncentračného členu, ktorého hodnota môže výslednú zmenu Gibbsovej energie výrazne ovplyvniť. Zmenu Gibbsovej energie môžeme vypočítať podľa rovnice: ∆퐺= ∆퐺 0 +푅푇푙푛 [ 퐶 ] [퐷] [ 퐴 ] [퐵] , kde ∆G je aktuálna hodnota zmeny Gibbsovej energie; ∆G 0 = zmena štandardnej Gibbsovej energie (pri štandardných podmienkach, tj. T = 298K = 25°C, c (reaktantov) = 1mol/l, pH = 0; pre pH = 7 sa označuje ako ∆G 0I ); R = univerzálna plynová konštanta; T = absolútna teplota; [A],[B],[C],[D] = látkové koncentrácie reaktantov. Ak je systém v rovnováhe, tak ∆G=0, koncentrácia reaktantov je konštantná a pre ∆G 0 platí: ∆G 0 = -RTlnK Pre zisťovanie ∆G 0 je potrebné stanoviť rovnovážnu konštantu danej reakcie. Čím je rovnovážna konštanta danej reakcie vyššia (čím vyššia je koncentrácia produktov), tým je za štandardných podmienok ∆G 0 zápornejšie a tým viac energie sa pri reakcií uvoľní. Reakcia bude prakticky nevratná. Z rovnice pre výpočet Gibbslovej energie však vyplýva, že aktuálne ∆G (či reakcia bude prebiehať samovoľne alebo nie) závií nielen od ∆G 0 , ale aj na aktuálnych koncentráciách reaktantov. Reakcia bude prebiehať samovoľne, sa bude aktuálna koncentrácia produktov v reakcií udržiavať nízka (napr. kontinuálnym odoberaním produktov v následnej reakcií metabolickej dráhy). V tomto prípade bude hodnota pomeru aktuálnych koncentrácií produktov a substrátov menšia ako 1 a hodnota ∆G bude záporná, reakcia bude exergonická a bude prebiehať samovoľne. Ak za zmenených fyziologických podmienok nebude produkt ďalej odčerpávaný do príslušnej metabolickej dráhy, koncentračné pomery sa obrátia a reakcia môže samovoľne prebiehať opačným smerom. Ide teda o reguláciu biochemických dejov podľa energetických potrieb. I/6. Chemická rovnováha, Guldbergův-Waagův zákon. Kinetika a energetika následných a vratných reakcí, aplikace v enzymologii Kinetika chemických reakcií študuje ich rýchlosť a faktory, ktoré túto rýchlosť ovplyvňujú. Premenu zlúčeniny v priebehu chemických reakcií je možné zapísať všeobecne ako: SUBSTRÁTY (reaktanty) → PRODUKTY Ak substráty A a B sa premieňajú na produkty C a D, tak má všeobecná rovnica tvar: A + B → C + D Prechodným „medziproduktom“ je tzv. aktivovaný komplex (tranzitný stav), ktorý je charakterizovaný najvyšším energetickým obsahom. Pôvodné väzby v ňom sa ešte úplne nerozpadli a nové ešte úplne nevznikli. Aktivovaný komplex sa môže premeniť späť na substráty alebo z neho môžu vzniknúť produkty. Ak si znázorníme graficky priebeh chemickej reakcie (graf vedľa), môžeme sledovať jej energetickú bilanciu. Ak je energetický obsah substrátov väčší než energetický obsah produktov (E produkty < E substráty ), tak ∆E = E produkty - E substráty < 0; energia sa v priebehu reakcie uvoľní (prípad A). Ak je však energetický obsah substrátov menší ako energetický obsah produktov (E produkty > E substráty ), tak ∆E = E produkty - E substráty > 0; energia musí byť v priebehu reakcie dodávaná (prípad B). Energetická bariera, ktorá musí byť počas reakcie prekonaná sa nazýva aktivačná energia E A , ktorej vrchol predstavuje energetický obsah aktivovaného komplexu. Rýchlosť chemickej reakcie môžeme definovať všeobecne ako úbytok koncentrácie substrátov alebo ako prírastok koncentrácie produktov za určitý čas: 푣=− ∆푐 ( 푠푢푏푠푡푟á푡 ) ∆푡 = ∆푐 (푝푟표푑푢푘푡) ∆푡 v - rýchlosť reakcie; t – čas. Rýchlosť chemickej reakcie má jednotku mol.s -1 . Rýchlosť reakcie vieme vyjadriť aj pomocou rýchlostnej rovnice: v = k.[A].[B] , kde [A],[B] – látkové koncentrácie substrátov, k – rýchlostná konštanta (rýchlosť chemickej reakcie pri jednotkovej koncentrácií substrátov – c = 1 mol/l) K významným kinetickým parametrom chemických reakcií patrí reakčný poriadok (reakční řád), ktorý odpovedá súčtu exponentov koncentrácií substrátov v rýchlostnej rovnici (v jednoduchých prípadoch sa exponenty rovnajú stechiometrickým koeficientom substrátov v reakcií). Všeobecne však exponenty treba zistiť experimentálne. Ak sú v reakcií stechiometrické koeficienty oboch substrátov rovné 1, tak aj ich exponenty v rýchlostnej rovnici sa budú rovnať 1 a v tomto prípade pôjde o reakciu druhého poriadku. Pre reakcie nižších poriadkov existujú samostatné jednoduché vzťahy medzi reakčnou rýchlosťou a koncentráciou substrátov. Reakcie prvého poriadku popisujú napr. premenu substrátu A na produkt B (A→B) alebo rozpad substrátu A na produkty B a C (A→B + C). Rýchlosť tejto reakcie je priamo úmerná koncentrácií substrátu: v = k.[A] Reakcie nultého poriadku majú rýchlosť reakcie nezávislú na koncentrácií substrátu: v = konštanta Enzýmovo katalyzované reakcie sa popisujú kombináciou reakcií prvého a nultého poriadku. Na začiatku, pokiaľ nie je enzým substrátom nasýtený, popisujeme priebeh reakcie kinetikou prvého poriadku. Po nasýtení enzýmu substrátom sa stáva rýchlosť nezávislou na koncentrácií substrátov a vyhovuje kinetike nultého poriadku . Prírastok produktov v čase je lineárny a rýchlosť je konštantná. Empiricky bolo zistené, že zvýšenie teploty reakcie o 10°C zvýši jej rýchlosť dvakrát až trikrát. Dá sa to vysvetliť pomocou Arrheniovej rovnice: 푘=퐴푒− 퐸 퐴 푅푇 , kde k – rýchlostná konštanta, A – frekvenčný faktor charakteristický pre danú reakciu, E A - aktivačná energia, R – univerzálna plynová konštanta, T – absolútna teplota, e – Eulerovo číslo (základ prirodzených logaritmov) Z uvedenej rovnice vidíme, že rast teploty reakcie zvyšuje hodnotu rýchlostnej konštanty a teda aj rýchlosť reakcie (pri určitej aktivačnej energii). Z Arrheniovej rovnice tiež vyplýva, že vysoká aktivačná energia znižuje rýchlostnú konštantu reakcie a taktiež jej rýchlosť (za stálej teploty). Aktivačná energia môže byť znížená účinkom katalyzátorov, ktoré vedú reakciu iným reakčným mechanizmom a rozdelia energetickú bariéru na menšie, ľahšie prekonateľné časti. Katalyzátor K zreaguje so substrátom za vzniku medziproduktu, z ktorého sa jeho nasledovnou reakciou opäť uvoľní za vzniku produktu B: A + K → AK → K + B Veľmi výkonnými katalyzátormi v biologických systémoch sú enzýmy, ktorých najvýznamnejšou vlastnosťou je ich špecifickosť (substrátová, reakčná a stereochemická). Zákonitosti chemickej kinetiky majú význam v biochemickej a medicínskej praxi. Využitím vzťahu pre výpočet reakčnej rýchlosti môžeme v biochemickom laboratóriu stanoviť aktivitu diagnosticky významných enzýmov v krvi, prípadne enzýmovými metódami stanoviť koncentráciu dôležitých metabolitov v sére (glukóza, kyselina močová, močovina). Rovnaké kinetické zákonitosti platia aj pre úbytok liekov v organizme a v spojení s IT technológiou je možné určiť optimálne dávkovanie liekov vhodné pre jednotlivých pacientov. V organizme sa veľmi často jednotlivé chemické reakcie spájajú do metabolických dráh, ktoré sú lineárne alebo cyklické. Produkt jednej čiastkovej reakcie sa bezprostredne stáva substrátom nasledujúcej reakcie. Reakcie s touto charakteristikou sú označované ako následné reakcie: Takáto sústava reakcií usporiadaná napr. do metabolickej dráhy sa vyznačuje dôležitými kinetickými a energetickými charakteristikami, ktoré sú v biochémií veľmi významné. Rýchlosť celej sústavy reakcií (metabolickej dráhy) odpovedá rýchlosti najpomalšieho kroku. Takéto reakčné kroky predstavujú miesta možnej regulácie metabolickej dráhy. Enzýmy katalyzujúce tieto reakcie sa nazývajú kľúčové a podliehajú regulácií prostredníctvom znižovania a zvyšovania svojej aktivity v závislosti na fyziologických podmienkach. Väčšina chemických reakcií je vratná. V priebehu reakcie sa postupne zvyšuje koncentrácia produktov a po dosiahnutí určitej hodnoty začne reakcia prebiehať merateľnou rýchlosťou opačným smerom: Časom sa rýchlosti reakcií v obidvoch smeroch vyrovnajú a sústava sa dostane do stavu dynamickej rovnováhy, reakcia prebieha oboma smermi rovnakou rýchlosťou, t.j. v 1 = v 2 , koncentrácie sa v reakcií nemenia. Pre rýchlosť reakcie v 1 a v 2 platí vzťah: v 1 = k 1 [A][B] a v 2 = k 2 [C][D]. Za podmienok chemickej rovnováhy sa dá povedať, že k 1 [A][B]= k 2 [C][D], z čoho vyplýva: 푘 1 푘 2 = [퐶] 푟 [퐷] 푟 [퐴] 푟 [퐵] 푟 =퐾 Ako K označujeme rovnovážnu konštantu. Ide o funkciu teploty, lebo obe k 1 aj k 2 závisia na teplote, ale iným spôsobom, lebo popisujú rôzne reakcie. Látkové koncentrácie v tomto prípade označujeme ako rovnovážne ([A] r ). Ich exponenty v jednoduchých prípadoch odpovedajú v jednoduchých prípadoch stechiometrickým koeficientom ako pri rýchlostnej rovnici. Uvedený vzťah sa nazýva zákon o chemickej rovnováhe alebo Guldberov-Waagov zákon a patrí medzi najdôležitejšie prírodné zákony. Dá sa slovne interpretovať ako: čím je vyššia hodnota rovnovážnej konštanty, tým je v reakcií dosiahnuté vyššej koncentrácie produktov. Podľa zákona akcie a reakcie môžeme chemickú rovnováhu ovplyvniť zmenou koncentrácie produktov (alebo susbstrátov), teploty a tlaku. Pre organizmus je najdôležitejšia zmena koncentrácie produktov. Ak je reakcia súčasťou sústavy následných reakcií, potom je vždy produkt čiastkovej reakcie odčerpávaný ako substrát nasledujúcej reakcie. Dôsledkom je reakcia ďalšieho množstva predchádzajúceho reaktantu, tak aby sa doplnil úbytok rovnovážnej koncentrácie produktu. Ak vstupuje do rovnovážneho deja katalyzátor, neovplyvňuje sa poloha rovnováhy (hodnota rovnovážnej konštanty), ale iba rýchlosť, akou je rovnováha dosiahnutá. Príkladom narušenia dosiahnutej rovnováhy odoberaním produktu je jedna z kľúčových reakcií glykolýzy – premena fruktóza-1,6- biosfosfátu na glyceraldehyd-3.fosfát a jeho izomér dihydroxyacetónfosfát. Obe zlúčeniny sú v rovnováhe, ktorá je posunutá smerom k vzniku dihydroxyacetónfosfátu. Glyceraldehyd-3-fosfát vstupuje do glykolýzy a je zo svojho izméru tvorený rýchlosťou odpovedajúcou požiadavkám na rýchlosť glykolýzy. Príkladom využitia zákona o chemickej rovnováhe by mohli byť elektrolytická disociácia (viac v otázke I/9) a súčin rozpustnosti (otázka I/15). I/7. Základní separačně detekční metodiky pro makromolekuly (elektroforéza, chromatografie, vysolování) a jejich využití v klinické praxi Elektroforézou sme schopní separovať bielkoviny a iné elektricky nabité makromolekuly. Existuje mnoho typov elektroforézy, rozdeľujeme ich najmä podľa použitého média. Počas elektroforézy sa makromolekuly pohybujú v elektrickom poli a ich rýchlosť pohybu závisí na troch faktoroch: ich veľkosti, tvare a náboji. CAF-elektroforéza (cellulose acetate foil) sa používa na rozdelenie plazmatických proteínov, ide o celkom jednoduchú metódu. Pri tejto metóde sa plazmatické bielkoviny rozdelia postupne do piatich frakcií (ide o albumíny, α 1 -, α 2 -, β 1 -, β 2 - a γ- globulíny). Je to zapríčinené tým, že vďaka mierne zásaditému pH sú ionizované a pohybujú sa smerom k anóde rýchlosťou závislou na negativite ich náboja. Po rozdelení proteínov sú nafarbené rôznymi farbivami a môžu byť kvantitatívne ohodnotené pomocou denzitometrie. Veľmi často používaná je SDS- PAGE elektroforéza (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel elektrophoresis). Pri tejto metóde rozdeľujeme bielkoviny na základe ich hmotnosti. To docielime pridaním dodecylsulfátu sodného a esteru kysliny sírovej s laurylalkoholom (dodecylalkohol). SDS je silný detergent s amfipatickými vlastnosťami, ktorý rozdelí oligomérne bielkoviny na ich podjednotky a denaturuje ich. Na docielenie úplnej denaturácie, pridávame thioly, ktoré štiepia disulfidové mostíky v bielkovinách. Na rozpletený peptidový reťazec sa naviažu SDS molekuly (cca 0,4g SDS/g bielkoviny) a dodajú im silný záporný náboj. Následne prebehne elektorforéza na vertikálne postavenom géle, pozostávajúceho z polymerizovaného akrylamidu, ktorá oddelí jednotlivé proteíny. Zafarbením sa proteíny zvýraznia. DNA elektroforéza je technicky jednoduchšia ako elektroforéza proteínov. Viac o elektroforéze DNA je napísané v otázke IV/29. Chromatografia je separačná metóda, ktorej podstatou je rozdelenie zložiek zmesi medzi dvomi fázami, pohyblivou (mobilnou) a nepohyblivou (stabilnou), ktoré majú rôzne vlastnosti (napr. polaritu). Spolu s mobilnou fázou sa pohybujú aj vzorky. Delenie vzorky je založené na rôznej interakcií zložiek s mobilnou a stacionárnou fázou. Zložky, ktoré interagujú viac so stacionárnou fázou sa pohybujú pomalšie a sú dlhšie zadržiavané ako zložky, ktoré interagujú so stacionárnou fázou menej. Na tomto princípe dochádza k rozdeleniu zložiek zmesi. Existuje veľa rôznych druhov chromatografie. Chromatografia na tenkej vrstve alebo TLC chromatografia (thin-layer chromatography) je významná analytická metóda pre rýchle rozdelenie lipidov a iných malých molekúl ako napr. aminokyselín, nukleotidov, vitamínov a liečiv. Analyzovaná vzorka je nanesená na doštičku zo skla, hliníka alebo plastu, ktorá je pokrytá vrstvičkou silikagélu (upravený SiO 2 ) alebo iným materiálom. Doštička je následne ponorená do chromatografickej vane, ktorá obsahuje určitý roztok (hexán, acetón, kyselina mravčia alebo ich kombinácie). Pomocou kapilárnych síl sa začne roztok pohybovať smerom hore po doštičke. Rýchlosť pohybu analyzovaných látok je určená interakciou medzi mobilnou (hydrofilný roztok) a stacionárnou (hydrofóbny silikagél) fázou. Ak dosiahne roztok vrcholu, chromatografia sa ukončí. Po odparení roztoku, oddelené látky môžeme zvýrazniť pomocou vhodných farbív alebo napr. pomocou UV-svetla. Pohyb látky v TLC systéme vyjadruje jej retardačný faktor (R B ). Neznámu látku v systéme vieme určiť porovnaním R B s referenčnou látkou. Gélová permeačná chromatografia (alebo tiež nesprávne gélová filtrácia) rozdeľuje bielkoviny podľa ich veľkosti a tvaru. Táto metóda prebieha v chromatografickej kolone, ktorá je naplnená gélovými časticami polymérneho materiálu o veľkosti 10-500 μm. Vnútro týchto častíc je prederavené kanálikmi s určenými veľkosťami. Zmes proteínov je naliata do horného konca kolóny a eluent (mobilná fáza) z nej vyteká po pridaní eluačného činidla do kolóny. Veľké proteíny nie sú schopné prechádzať cez častice a preto prechádzajú kolónou najrýchlejšie. Stredné a malé proteíny prechádzajú časticami a preto sú pri prechode viac alebo menej oneskorené. Bielkoviny potom môžeme oddeliť zo zmesi bez prítomnosti eluentu. Eluačný objem proteínov závisí hlavne na ich molekulovej hmotnosti. Iónomeničová chromatografia využíva kolóny naplnené iónomeničom s naviazanými kladnými alebo zápornými nábojmi tak, aby zadržovali makromolekuly s opačnou polaritou. Väzba medzi makromolekulou náplňou kolóny závisí na pH a iónovej sile roztoku, ktorý kolónou preteká. Afinitná chromatografia je založená na kovalentnej väzbe molekúl obsahu kolóny a konkrétnej makromolekuly počas oddeľovania. Špecificky naviazané v kolóne sa potom dajú oddeliť pomocou zmeny pH alebo koncentrácie soľného roztoku, ktorým sa kolóna premýva. Následne sa získajú konkrétne makromolekuly. Vysoľovanie je separačná metóda proteínov, ktorá využíva ich nižšej rozpustnosti v prostredí vysoko koncentrovaných solí. Rozpustnosť proteínov závisí na koncentrácií solí v médiu (jeho iónová sila). Ich rozpustnosť vzrastá s rastom iónovej sily roztoku, lebo viac a viac hydrofilných anorganických iónov sa viaže na povrch proteínu, čím sa zabraňuje agregácií proteínov (vsoľovanie). Pri veľmi vysokých iónových silách, vyťahujú soli z proteínov hydratovanú vodu, čím dôjde ich následnej agregácií a vyzrážaniu (vysoľovanie). Ak používame soli ako napr. sulfid amónny, môžeme rozdeliť bielkoviny zo zmesi na základe ich rozdielnej rozpustnosti. I/8. Spektrofotometrie, princip a využití v klinické biochemii V biochemických analýzach sa využíva fakt, že množstvo látok je schopné pohltiť elektromagnetické žiarenie vo viditeľnej alebo UV časti spektra. Miera, akou látka pohlcuje svetlo rôznych vlnových dĺžok závisí na štruktúre zlúčeniny. Množstvo svetla určitej vlnovej dĺžky, ktoré pohltí napr. látka rozpustená v roztoku závisí na koncentrácií látky. Meranie absorbcie svetla vzorkou označujeme ako fotometria (pre jednu alebo niekoľko konkrétnych vlnových dĺžok) a spektrofotometria (ak ju meriame v určitom súvislom rozsahu vlnových dĺžok svetla – spektrum). Spektrofotometria je veľmi dôležitou technikou v biochémii, využíva sa pri experimentoch s izoláciou DNA, RNA a bielkovín, pri meraní množstva, koncentrácie, čistoty, enzýmovej aktivity a iných vlastností analytu. Využíva sa napr. pri meraní celkového množstva bielkovín v plazme, obsahu hemoglobínu v krvi (Drapkinova metóda),... Veľa látok obsahuje valenčný elektrón, ktorý môže byť excitovaný do vyššej energetickej hladiny pomocou elektromagnetického žiarenia. Táto látka absorbuje žiarenie o určitej vlnovej dĺžke s energiou fotónov odpovedajúcou energií oboch energetických hladín. Ak absorbované žiarenie leží vo viditeľnej časti spektra, bude túto látku ľudské oko považovať za farebnú (bude mať farbu doplnkovú k farbe absorbovaného svetla). Predpovedať farbu látky na základe jej chemickej štruktúry je ťažké a ani nie je možné na základe absorbovaného svetla odvodiť zloženie látky. Vo všeobecnosti rozoznávame tri typy látok, ktoré sú často farebné: 1. Látky, ktoré obsahujú systém konjugovaných dvojitých väzieb a ich molekula je asymetrická. Systém konjugovaných dvojitých väzieb môže existovať v dvoch rezonančných stavoch, ktoré sú energeticky rovnocenné. Prítomnosť asymetrického substituentu spôsobí, že sa energia oboch stavov bude líšiť. Rozdiel medzi energiami často odpovedá energií fotónu z viditeľnej časti spektra. Zástupcami takýchto látok môžu byť farbivá s polymetínovýcm reťazcom (-CH=CH-CH=CH-) alebo azofarbivá (-N=N-). Podobne sa chovajú aj látky s aromatickými či heterocyklickými štruktúrami viazanými na spoločný centrálny atóm (napr. trifenylmetánové farbivá). 2. Často krát d a f valenčné elektróny podmieňujú farbu látky. Tieto elektróny sú prítomné v koordinačných väzbách komplexných zlúčenín. Napr. bezvodný CuSO 4 je bezfarebný, ale jeho pentahydrát CuSO 4 .5H 2 O a aj jeho vodný roztok má svetlomodrú farbu. V oboch prípadoch meď vstupuje do komplexu s vodou [Cu(H 2 O) 4 ] 2+ . Taktiež farebné bývajú aj komplexy ďalších prechodných prvkov (Fe, Cr, Mn, Ni, Co,...), komplexne viazaný kov je aj v bielkovinových pigmentoch hemoglobíne a cytochrómoch. 3. Farebné bývajú aj ióny, ktoré obsahujú prechodný kov s vysokým oxidačným číslom (napr. MnO 4 - , Cr 2 O 7 2- ,...) Množstvo svetla určitej vlnovej dĺžky, ktoré prešlo vzorkou, popisuje veličina transmitancia, ktorá je definovaná ako: 푇= 퐼 퐼 0 , kde T – transmitancia, I –intenzita svetla, ktoré prešlo vzorkou, I 0 – intenzita svetla, ktoré do vzorky vstúpilo. Je nepraktické merať presne dve intenzity, lebo okrem vlastnosťami vzorky sú ovplyvnené aj absorpciou a odrazom svetla na stenách kyvety a v optike fotometru, prostredím, v ktorom prebieha meranie, etc. Preto väčšinou meriame transmitanciu relatívne vzhľadom na slepú vzorku. Najprv sa zmeria intenzita svetla, prechádzajúca slepou vzorkou (roztok, ktorý obsahuje všetky zložky, okrem stanovovanej farebnej látky. Potom za rovnakých podmienok zmeriame intenzitu svetla prechádzajúceho neznámou vzorkou. Transmitanciu potom definujeme vzťahom: 푇= 퐼 푉 퐼 퐵 , kde I V –intenzita svetla, ktoré prešlo vzorkou, I B – intenzita svetla, ktoré prešlo slepou vzorkou. Ak meriame transmitanciu týmto spôsobom, nemusíme uvažovať nešpecifické straty intenzity svetla. Intenzita svetla, ktoré prechádza slepou vzorkou sa považuje za 100% (transmitancia slepej vzorky je 100%) a transmitancia vzorky absorbujúcej svetlo danej vlnovej dĺžky je vždy menšia ako 100%. Transmitancia roztoku s farebnou látkou závisí na vlastnostiach absorbujúcej látky, vlnovej dĺžke prechádzajúceho svetla, množstve absorbujúcej látky (koncentrácia v roztoku) a hrúbke kyvety. Za predpokladu použitia monochromatického svetla si môžeme vyjadriť závislosť transmitancie na týchto podmienkach ako: T = 10 -ε.l.c , kde ε – molárny dekadický absorbčný koeficient (špecifický pre danú látku), l – optická dĺžka kyvety, c – látková koncentrácia absorbujúcej látky. Matematickými úpravami si môžeme transmitanciu vyjadriť ako: -logT = ε.l.c, na základe čoho sa definuje absorbancia a optická hustota. Absorbancia, bezrozmerná veličina používaná v spektrofotometrii, udáva množstvo svetla pohltené vzorkou. Absorbanciu definujeme na základe transmitancie ako: A = -logT. Z definície transmitancie tiež vyplýva vzťah: A = ε.l.c. Tento vzťah nazývame ako Lambert-Beerov zákon, ktorý vyjadruje, že absorbancia je priamo úmerná koncentrácií absorbujúcej látky. Z predošlých rovníc je zrejmé, že nulovú absorbanciu bude mať vzorka, ktorá nepohltí žiadne svetlo, absorbancia 1 znamená, že vzorkou prešla práve jedna desatina svetla, pri absorbancii 2 jedna stotina vstupujúceho svetla, etc. Záporná hodnota absorbancie znamená, že vzorkou prechádza viac svetla než slepou vzorkou, môže tento výsledok vzniknúť hrubou chybou merania alebo nesprávnym postupom pokusu. Na meranie absorbancie a transmitancie sa používajú fotometre a spektrofotometre. Fotometer meria pri jednej alebo niekoľkých presne definovaných vlnových dĺžkach monochromatického svetla. Spektrofotometer je technicky dokonalejší a zložitejší prístroj, ktorý umožňuje vlnovú dĺžku monochromatického svetla ľubovoľne nastaviť alebo merať časť absorpčného spektra v určitom úseku vlnových dĺžok. Principiálne sa fotomer a spektrofotometer skladá zo zdroja svetla, monochromátora, oddielu pre vzorku a detektora. Ako zdroj svetla sa používajú vhodné žiarovky alebo výbojky. Žiarovky poskytujú žiarenie spojitého spektra vo viditeľnej a infračervenej oblasti, no nedajú sa použiť na meranie v UV oblasti. Ako zdroje UV žiarenia sa používajú väčšinou vodíkové a deuteriové výbojky. Polychromatické svetlo zo zdroja prechádza nasledovne monochromátorom. Najjednoduchší a najlacnejší monochromátor získame zaradením vhodného interferenčného filtru do optickej dráhy. Dostupné sú filtre pre prakticky všetky vlnové dĺžky UV a viditeľnej oblasti. Rozlišujeme niekoľko druhov filtrov, ktorých vhodnou kombináciou sa zostaví filter požadovaných vlastností. Low-pass filtre prepúšťajú svetlo vlnových dĺžok kratších ako je medzná hodnota (cut-off). High-pass filtre naopak prepúšťajú iba svetlo, ktoré má väčšiu vlnovú dĺžku ako je hraničná vlnová dĺžka filtra. Pásmové filtre prepúšťajú určitý rozsah vlnových dĺžok. Pretože hranice nebývajú veľmi ostré, uvádza sa ako dolná a horná medza spravidla taká vlnová dĺžka, pre ktorú má filter päťdesiatpercentnú transmitanciu v porovnaní s vlnovou dĺžkou, ktorú prepúšťa najlepšie. Niekedy sa tiež uvádza stredná vlnová dĺžka, ktorú filter prepúšťa a šírka pásma. Väčšinou ako monochromátor sa používa optická mriežka, ktorej nakláňaním je možné plynulo meniť vlnovú dĺžku. Rozsah vlnových dĺžok, ktoré z monochromátoru vychádzajú určuje štrbina, ktorá sa dá nastaviť alebo už je pevne nastavená. Čím je štrbina širšia, tým väčšia je intenzita vychádzajúceho svetla (môže byť však ovplyvnená špecifickosť merania). Naopak, ak je štrbina užšia, zaistí sa presnejšie dodržanie požadovanej vlnovej dĺžky, ale intenzita svetla bude menšia a zhorší sa odstup signálu od šumu. Vzniknuté monochromatické svetlo prechádza vzorkou. Väčšinou ide o roztoky, ktoré sa plnia do štandardných kyviet s optickou dráhou 1cm. Kyvety sa v prístroji umiestňujú do kyvetátoru, ktorý zaisťuje ich presnú polohu, môže byť temperovaný a niekedy obsahuje aj magnetickú miešačku, pomocou ktorej sa po vložení miešadla do kyvety premiešať jej obsah počas merania. Často je možné do kyvetátoru založiť viac kyviet naraz, ktoré sú potom automaticky vsunuté do optickej dráhy. Svetlo vychádzajúce zo vzorky dopadá na detektor, väčšinou fotodiodu alebo iný fotoelektrický prvok. Intenzita sa vyhodnocuje pomocou systému prevodníkov, zrovná sa s intenzitou svetla prechádzajúceho slepou vzorkou a tak sa získa absorbancia. Presnosť meraní ovplyvňuje integračný čas (doba, počas ktorej sa meria absorbancia). Čím je dlhšia, tým presnejší bude výsledok merania, ak však nie je absorbujúca látka fotocitlivá (ak nedôjde po dlhšom osvite k vyblednutiu vzorky). Nevýhodou dlhého integračného času je samozrejme tiež predlžovanie doby merania, čo je podstatné najmä pri spracovaní veľkého množstva vzoriek, pri meraní pri veľkom množstve vlnových dĺžok (meranie spektier) alebo pri spracovaní vzoriek, ktoré sa v čase menia (kinetické merania). Okrem tzv. jednopaprskových fotometrov, v ktorých sa najprv meria slepá vzorka a potom sa do rovnakej optickej dráhy vkladá meraná vzorka, sa používajú aj tzv. dvojpaprskové fotometre, ktoré sú vybavené dvoma detektormi a umožňujú merať slepú aj meranú vzorku súčasne v dvoch optických dráhach. I/9. Elektrolytická disociace, disociační konstanta, silné a slabé elektrolyty, příklady z biochemie Elektrolytická disociácia nastáva, keď pôsobením polárneho rozpúšťadla (najčastejšie vody) sú niektoré rozpustené látky štiepené na anióny a katióny. Zlúčeniny schopné elektrolytickej disociácie sa nazývajú elektrolyty, ide o napr. iónové zlúčeniny – soli, alkalické hydroxidy,... Ich kryštálová mriežka sa pôsobením vody rozpadne a vzniknuté ióny prejdú samovoľne do roztoku. Taktiež niektoré polárne zlúčeniny sa pôsobením vody rozpadajú na ióny (napr. HCl, karboxylové kyseliny), iné však vo vode nedisociujú (glukóza, močovina,...). Ak sú elektrolyty v roztoku úplne disociované, nazývame ich silné elektrolyty (napr. soli, HCl, alkalické hydroxidy,...). Ako slabé elektrolyty označujeme látky, ktoré po rozpustení stále ostávajú vo forme molekúl a iba malá časť je disociovaná na ióny (napr. karboxylové kyseliny). V roztoku sa ustáli rovnováha medzi nedisociovanými molekulami látky (AB) a disociovanými iónmi (B + , A - ). Táto rovnováha sa nazýva disociačná rovnováha a kvantitatívne sa dá vyjadriť disociačnou (alebo tiež ionizačnou) konštantou K, ktorá má tvar: AB ↔ B + + A - K – disociačná konštanta; 퐾= [퐵 + ]. [ 퐴 − ] [ 퐴퐵 ] [ 퐵 + ] , [ 퐴 − ] , [ 퐴퐵 ] – koncentrácie iónov a molekúl Hodnota disociačnej konštanty vypovedá o sile elektrolytu. Silný elektrolyt má hodnotu disociačnej konštanty vyššiu ako 10 -2 , stredný je v rozmedzí od 10 -2 do 10 -4 a slabý elektrolyt má menej ako 10 -4 . Pomer disociovanej a nedisociovanej časti v roztoku sa tiež môže kvantitatívne vyjadriť pomocou disociačného stupňa α a u slabých elektrolytov dosahuje hodnotu max. α = 10%. To znamená, že predpokladáme, že v roztoku slabého elektrolytu je prevaha pôvodnej látky. Disociačný stupeň vyjadrujeme: 훼= 푐 0 −푐 푐 0 <1, kde c 0 je pôvodná koncentrácia elektrolytu a c je koncentrácia nedisociovaných molekúl Ióny v organizme plnia mnoho funkcií, v elektroneutrálnom prostredí sa chovajú ako samostatné častice. I/10. Brönstedova teorie kyselin a zásad, rovnováha v protolytických reakcích, příklady z biochemie. Atóm vodíku, ktorý je zbavený svojho elektrónu nazývame protón (H + ). Jeho význam v ľudskom organizme je veľký. Jeho koncentrácia sa v rôznych častiach organizmu líši, napr. v žalúdku je prostredie kyslé, pankreatická šťava je slabo zásaditá a krv je takmer neutrálna. Koncentrácia protónov ovplyvňuje napr. aktivitu enzýmov, zasahuje do redoxných dejov, disociácia protónu z hemoglobínu má dôležitú pri výmene krvných plynov, transport protónov vnútornú mitochondriálnu membránu umožňuje biosyntézu ATP. Protóny majú význam v tzv. protolytických reakciách, kde dochádza k výmene jedného protónu medzi konjugovaným párom kyseliny a zásady. Aby sme si zadefinovali, čo je kyselina a čo zásada, využívame teórie kyselín a zásad. Významné sú tri. Podľa Arrheniovej teórie kyselín a zásad je kyselina látka schopná vo vodnom prostredí odštiepovať vodíkový katión H + (protón) a zásada je schopná odštiepovať hydroxydový anión OH - . Druhá teória je Brőnstedova teória kyslín a zásad, podľa ktorej je kyselina látka schopná odštiepovať protón (donor protónu, HA) a zásada je zase látka schopná tento protón prijať (akceptor protónu, B). Táto teória neplatí nutne vo vodnom prostredí, môže platiť napr. pri plynných kyselinách a zásadách (reakcia HCl a amoniaku). Všeobecne reakciu kyseliny so zásadou zapíšeme ako: HA ↔ H + + A - B + H + ↔ BH + Dvojice častíc HA a A - , rovnako ako B a BH + sa líšia iba o jeden protón a nazývame ich konjugované páry, kde HA je kyselina a A - je jej konjugovaná zásada a BH + je konjugovaná kyselina k bázy B. Niektoré látky sa počas protolytických reakcií správajú ako amfolyty, teda látky, ktoré sú schopné protón prijať aj odštiepiť (viac otázka I/10). Tretia teória je Lewisova a zahrňuje ako kyseliny a zásady aj látky, ktoré nie sú schopné odštiepovať protón. Podľa tejto teórie je kyselina látka schopná viazať voľný elektrónový pár a zásada je schopná ho poskytnúť. Na protolytické reakcie sa dá aplikovať zákon o chemickej rovnováhe a získať tak hodnoty disociačných konštánt kyselín a zásad (K D ) ako rovnovážne konštanty odpovedajúcich reakcií. Aby sme mohli porovnávať hodnoty konštánt, používame ako druhý reaktant v týchto reakciách vodu. Všeobecne sa disociácia kyseliny vo vode zapisuje ako: HA + H 2 O ↔ H 3 O + + A - Analogicky pre bázu: B + H 2 O ↔ BH + + OH - Z uvedených rovníc si vieme vyjadriť príslušné rovnovážne konštanty pre disociácie kysliny a bázy analogicky vo vzťahu pre chemickú rovnováhu: 퐾 퐷 = [ 퐻 3 푂 + ] [퐴 − ] [ 퐻퐴 ] [퐻 2 푂] 퐾 퐷 = [ 퐵퐻 + ] [푂퐻 − ] [ 퐵 ] [퐻 2 푂] Koncentrácia vody môže byť konštantná, vzhľadom k jej veľkému nadbytku a môžeme ju zahrnúť do rovnovážnej konštanty a vzniknú nám nové konštanty, ktoré nazývame disociačné konštanty kyseliny K A alebo zásady K B vo vode: 퐾 퐴 = [ 퐻 3 푂 + ] [퐴 − ] [ 퐻퐴 ] 퐾 퐵 = [ 퐵퐻 + ] [푂퐻 − ] [ 퐵 ] Disociačné konštanty sú mierou sily kyselín a zásad vo vodných roztokoch a teda platí, že čím je vyššia hodnota disociačnej konštanty, tým je kyselina alebo zásada silnejšia. Pri viacsýtnych kyselinách je definovaných toľko disociačných konštánt, koľko protónov môže kyslina postupne odštiepiť, veľkosť konštánt postupne klesá. Napr. kyselina uhličitá je silnejšou kyselinou pri disociácií do prvého stupňa (K A = 3.10 -7 ) než pri disociácií do druhého stupňa (K A = 4.10 -11 ). Ak pridáme do roztoku H 3 O + ióny (okyslíme roztok), potlačíme disociáciu kyseliny , pretože porušíme rovnováhu zvýšením koncentrácie protónov a systém ju musí obnoviť zvýšením koncentrácie nedisociovaných molekúl kyseliny. Naopak odobratie H 3 O + iónov (alkalizácia) podporí disociáciu kyseliny, aby sa doplnili odobrané ióny. I/11. Iontový součin vody, pH a jeho význam v medicíně. K výmene protónu môže dôjsť aj medzi dvomi molekulami vody, kde jedna molekula vody vystupuje ako kyselina a druhá ako zásada: H 2 O ↔ OH - + H + H 2 O + H + ↔ H 3 O - Rovnice sa dajú spojiť: H 2 O + H 2 O ↔ H 3 O + + OH - Tento proces sa nazýva autoprotolýza vody a jej rovnovážnu konštantu vyjadríme ako: 퐾 퐷 = [ 퐻 3 푂 + ] [푂퐻 − ] [퐻 2 푂] 2 Druhú mocninu látkovej koncentrácie vody môžeme považovať za konštantnú a spojiť ju s rovnovážnou konštantou do novej konštanty K W , ktorú nazývame iónový súčin vody: K W = [H 3 O + ].[OH - ] = 10 -14 (pri 25°C). Iónový súčin vody je konštanta, ktorá musí byť dodržaná vždy pri strete H 3 O + a OH - iónov. Platí teda ako pre čistú vodu, tak aj pre každý vodný roztok bez ohľadu na vlastnostiach rozpustenej látky. Z rovnice pre K W sa dá vypočítať, že v čistej vode (neutrálnom prostredí), kde [H 3 O + ] = [OH - ] sú tieto koncentrácie pri 25°C rovné 10 -7 mol/l. Pre kyslé prostredie teda platí, že [H 3 O + ]>10 -7 mol/l a pre zásadité zase [H 3 O + ]<10 -7 mol/l. Z praktických dôvodov sa nepočíta sa s mocninami so zápornými exponenciálmi a preto bol zavedený vodíkový exponent alebo pH. Ide o záporný dekadický logaritmus aktivity H 3 O + iónov (a=c.γ). Z praktických dôvodov sa pH berie ako záporný dekadický logaritmus koncentrácie H 3 O + iónov: pH = -log[H 3 O + ] Z tohto vzťahu môžeme odvodiť, že [H 3 O + ]=10 -pH . Pre vodné roztoky sa hodnoty pH pohybujú v rozmedzí 0-14. Hodnota pH nás informuje o momentálnej koncentrácií protónov v prostredí, v ktorom je pH merané a teda udáva mieru aktuálnej acidity prostredia. Látková koncentrácia všetkých oddisociovaných protónov z roztoku sa nazýva celková acidita a stanovuje sa alkalimetrickou titráciou. Na podobnom princípe ako pH sa používajú aj iné veličiny ako pOH, pK A , pK B a pK W . Pre pK A platí, že čím vyššia hodnota, tým je kyselina slabšia a naopak. Pomocou jednoduchého vzťahu vieme zistiť aj pH zásaditých roztokov: pK w = pH + pOH =14. Dôležitý je aj vzťah medzi pK A a pK B konjugovaných párov. Vyjadríme si ho z výrazov pre disociačné konštanty kyseliny HA a jej konjugovanej bázy A - , ak dosadíme do výrazu pre K B miesto všeobecnej bázy B, konjugovanú bázu A - a potom platí: [ 퐴 − ] = [ 퐻퐴 ] [푂퐻 − ] 퐾 퐵 Výraz dosadíme do vzťahu pre K A a získame: 퐾 퐴 = [ 퐻 3 푂 + ] [푂퐻 − ] 퐾 퐵 Ak upravíme rovnicu: K A . K B =[H 3 O + ] [OH - ] = K W Po zlogaritmovaní tohto vzťahu dostaneme dôležitý vzťah pK A + pK B = pK W = 14 Pretože súčet logaritmov disociačných konštánt je 14, platí, že čím je kyselina slabšia, tým je jej konjugovná zásada silnejšia a naopak. Tento výraz sa dá ďalej použiť na výpočet hodnoty pK A kyseliny, ak je známa hodnota pK B bázy a naopak. Napr. hodnota pK B amoniaku pri 25°C je 4,75 (stredne silná zásada), tak vypočítame, že hodnota pK A príslušnej konjugovanej kyseliny NH 4 + sa rovná 9,25 (slabá kyselina). Výpočet pH silných kyselín a zásad vychádza z predpokladu úplnej disociácie kyseliny a zásady. Z koncentrácie silnej kyseliny si vypočítame koncentrácie protónov (u jednosýtnej kyseliny je rovnaká ako jej koncentrácia, u viacsýtnej musíme ju vynásobiť počtom odštiepených protónov) a výsledok prevedieme na záporný dekadický logaritmus. Príklad:[H 2 SO 4 ] = 0,005 mol/l = 5.10 -3 , [H 3 O + ] = 0,01 mol/l = 10 -2 mol/l, pH = 2 V prípade zásady sa z koncentrácie zásady vypočíta koncentrácia OH - iónov a potom pOH a pomocou vzťahu pre pK w dopočítame výsledok. Príklad: [KOH] = 0,01 mol -1 = 10 -2 mol/l, [OH - ] = 0,01 mol -1 = 10 -2 mol/l, pOH = 2, pH = 12 Môžeme tiež vypočítať koncentrácie OH - koncentráciu H 3 O + podľa iónového súčinu vody a potom vypočítame pH silnej zásady. Príklad: [KOH] = 0,01 mol -1 = 10 -2 mol/l, [OH - ] = 0,01 mol -1 = 10 -2 mol/l, [H 3 O + ] =10 -12 mol/l, pH = 12 Výpočet pH slabých kyselín a zásad vychádza zo vzťahu o disociačných konštantách kyseliny a zásady a dvoch zjednodušených predpokladov: 1. Rovnovážne koncentrácie vzniknutých iónov sú rovnaké, u kyseliny [H 3 O + ]=[A - ] 2. Rovnovážnu koncentráciu nedisociovaných molekúl slabej kyseliny je možno položiť rovnou počiatočnou koncentráciou kyseliny Pre výpočet pH slabej kyseliny bol odvodený vzťah: 푝퐻= 1 2 푝퐾 퐴 − 1 2 푙표푔[퐻퐴] Analogicky sa dá odvodiť vzťah pre pOH slabej zásady: 푝퐻= 1 2 푝퐾 퐵 − 1 2 푙표푔[퐵] .Výpočet pH slabej bázy vypočítame analogicky ako u silnej bázy z hodnoty pOH. Zo vzťahov je vidieť, že pH slabých kyselín a zásad závisí od disociačnej konštanty a počiatočnej koncentrácie elektrolytu. I/12. Amfolyty, jejich vlastnosti, příklady z biochemie Amfolyty sú zlúčeniny, ktoré majú charakter súčasne slabej kyseliny aj slabej zásady. Acidobazický charakter reakcie roztoku amfolytu určujú hodnoty disociačných konštánt oboch disociovatelných skupín. Ak bude molekula amfolytu všeobecne HP (napr. proteín), tak platí: Pre kyslú reakciu: HP + H 2 O ↔ P + H 3 O + 퐾 퐴 = [ 퐻 3 푂 + ] . [ 푃 − ] [ 퐻 2 푂 ] . [ 퐻푃 ] Pre zásaditú reakciu: HP + H 2 O ↔ HPH + + OH - 퐾 퐵 = [ 퐻푃퐻 + ] . [ 푂퐻 − ] [ 퐻푃 ] . [ 퐻 2 푂 ] Pridanie roztoku silnej zásady do roztoku amfolytu spôsobí pokles koncentrácie H + , ktoré zreagujú s OH - za vzniku vody. Preto budú disociovať ďalšie doposiaľ nedisociované molekuly amfolytu (HP) a tým sa podporila kyslá disociacia amfolytu. Naopak, pridaním kysliny podporíme podobným spôsobom zásaditú disociaciu. Príkladmi amfolytov sú voda, aminokyseliny, bielkoviny,... Aminokyseliny majú dve disociovatelné skupiny: Zásaditú amino skupinu (pK B ): -NH 2 + H + ↔ NH 3 + Kyslú karboxylovú skupinu (pK A ): -COOH ↔ COO - + H + Hodnota pH, pri ktorej sú disociované obe skupiny, sa nazýva izoelektrický bod (pI) a odpovedá priemernej hodnote pK A a pK B . Je to dôležitá konštanta amfolytu. Molekuly amfolytu sa pri pH=pI v elektrickom poli nepohybujú, roztoky majú najnižšiu viskozitu a rozpustené látky majú najnižšiu rozpustnosť. Pohyblivosť amfolytov ako sú napr. bielkoviny v elektrickom poli, však dosť záleží na pH prostredia a teda hodnota pI bude závisieť na pH a iónovej sile pufrov. Preto bol zavedený tzv. izoionický bod, ktorým sa rozumie pH, pri ktorom sa počet kladných nábojov amfolytu rovná počtu záporných nábojov a udáva ho pH polyamfolytu v roztoku deionizovanej vody. Všeobecne pH izoelektrického bodu môžeme vypočítať pomocou vzťahu, ktorý vychádza z disociačných konštánt amfolytu: pI = ½ (pK A + pK W – pK B ) I/13. Pufry, výpočet pH, význam v organismu V organizme je fyziologické pH krvnej plazmy a extracelulárnej tekutiny približne 7,4 (±0,04). Ľudský organizmus si musí toto pH udržiavať vo fyziologickom rozsahu, lebo aj malá zmena koncentrácie protónov znamená život ohrozujúci stav. Táto fyziologická hodnota 7,4 pri teplote 37°C odpovedá slabo zásaditému pH (neutrálne pH pri tejto teplote má hodnotu 6,8). K zmenám koncentrácie protónov v organizme dochádza prirodzene v priebehu metabolických pochodov. Napr. karboxylové kyseliny sú častými produktmi metabolických dejov a pri fyziologickom pH sú tieto kyseliny disociované. Ďalším zdrojom H + iónov je disociácia H 2 CO 3 , ktorá vzniká rozpúšťaním CO 2 pri dekarboxyláciách, taktiež disociácie kyseliny sírovej, ako produktu oxidácie sírnych aminokyselín a tiež kyslina fosforečná, ktorá sa odštiepuje z nukleových kyslín, nukleotidov a fosfolipidov. Organizmus musí mať vybudované systémy, ktorými týmto výkyvom pH dokáže zabrániť a teda musia mať schopnosť produkovať protóny v prípade nedostatku a naopak znižovať ich koncentráciu v prípade nadbytku. Vodíkové katióny sa môžu v roztoku neutralizovať pomocou OH - iónov na veľmi málo disociovanú vodu. Koncentráciu protónov môžeme tiež znížiť reakciou s aniónom slabej kyseliny (konjugovanou zásadou) za vzniku slabej málo disociovanej kyseliny, ktorá zníži koncentráciu protónov v roztoku. Systémy, ktoré udržiavajú pH prostredia organizmu v relatívnej stálej hodnote, nazývame pufry (tĺmivé systémy). Ide o roztoky slabej kyseliny a jej silnej konjugovanej zásady (anión slabej kysliny), napr. hydrogénuhličitanovový pufr je tvorený slabou kyselinou uhličitou a hydrogenuhličitanovým aniónom. Pri vzostupe pH oddisociuje slabá kyselina protóny a pri poklese pH sú nadbytočné katióny odobraté reakciou s aniónom slabej kyseliny (konjugovanou bázou). HA → H + + A - (vzostup H + ) H + + A - → HA (pokles H + ) V obidovoch prípadoch sa pH roztoku pufru výrazne nezmení. Analogicky pracuje aj pufr, ktorého základom je slabšia báza. Výpočet pH kyslého pufru vychádza z výrazu pre disociačnú konštantu kyseliny, kde [HA] a [A - ] alebo [BH + ] a [B] nie sú rovnovážne koncentrácie, ale zvolené koncentrácie. Výsledná [H 3 O + ] je priamo úmerná hodnote pomeru koncentrácií zložiek konjugovaného páru: [ 퐻 3 푂 + ] = 퐾 퐴 [퐻퐴] [퐴 − ] Vyjadrením tohto vzťahu pomocou záporných dekadických logaritmov bola odvodená Heendersonova-Hasselbachova rovnica: 푝퐻=푝퐾 퐴 +log [퐴 − ] [퐻퐴] . Z tohto vzťahu vidíme, že pH pufru je určené pK A slabej kysliny a pomerom koncentrácií oboch zložiek pufru. Zriedením sa pH pufru nezmení (pomer koncentrácií ostáva rovnaký), pri pomere koncentrácií zložiek pufru 1:1 je pH rovné hodnote pK A . Tím, že pH pufru je závislé na koncentrácií oboch zložiek, tak až pri desaťnásobnej zmene pomeru koncentrácií zložiek sa mení pH roztoku o jednu jednotku. Z rovnice si tiež môžeme vypočítať pH pufru podľa zvolených zložiek a tiež je možné vypočítať pomer koncentrácií zložiek potrebných k príprave pufru s požadovaným pH. Ďalšou dôležitou praktickou veličinou je kapacita pufru β, ktorá nám hovorí o schopnosti daného pufru tlmiť výkyvy pH. Definujeme ju ako počet mólov protónov, ktoré musia byť k pufru pridané alebo z neho odobrané, aby sa pH pufru zmenilo o jednotku. Kapacita pufru závisí priamo úmerne na koncentrácií pufru (súčinu koncentrácií oboch zložiek) a pre každú koncentráciu pufru ja najvyššia pri pH=pK A . Kapacitu pufru vypočítame ako 훽= ∆퐶 퐵 ∆푝퐻 = − ∆퐶 퐴 ∆푝퐻 K pufračnej kapacite telových tekutín a intracelulárneho prostredia prispievajú nízkomolekulové aj vysokomolekulové tĺmivé systémy. Najdôležitejším nízkomolekulovým pufrom je hydrogénuhličitanový pufr, ktorý tvorí kyselina uhličitá a hydrogenuhličitanový anión (HCO 3 - /H 2 CO 3 ). Ďalší je fosfátový pufr (HPO 4 2- /H 2 PO 4 - ), jeho podiel je však malý vzhľadom k nízkej koncentrácií fosfátov v krvi (0,8 – 1,5 mmol/l), významnejší je v moči. Dominantný pufr v moči je pufr tvorený amónnym katiónom NH 4 + a amoniakom NH 3 . Ďalší nízkomolekulový pufr tvorí karboxylátový anión a príslušná slabá karboxylová kyselina. Hlavným vysokomolekulovým pufrom sú bielkoviny (aj hemoglobín) so svojimi kyslými a zásaditými skupinami v postrannom reťazci. (viac o pufroch v tele v otázke III/10). I/14. Oxidace a redukce, oxidoredukční potenciál, závislost na koncentraci reaktantů a pH, příklady z biochemie Oxidačnoredukčné (alebo redoxné) reakcie sú založené na výmene elektrónov medzi reakčnými partnermi. Ide o analogické reakcie s protolytickými reakciami, pri ktorých si reakční partneri vymieňajú protón. Na rozdiel od protolytických reakcií, kde sa vždy vymieňa iba jeden protón, v redoxných reakciách si môžu naraz vymieňať aj viac elektrónov. Redukcia je proces, kde redukovaná zlúčenina elektróny prijíma a naopak oxidácia je proces, keď oxidovaná látka stráca elektróny. Redukčné činidlo je donorom elektrónov a v priebehu deja sa oxiduje a oxidačné činidlo je akceptorom elektrónov a v reakcií sa redukuje. Zn ↔ Zn 2+ + 2e - Táto reakcia je zľava doprava oxidáciou a v opačnom smere ide o redukciu. Všeobecne sa redoxný dej dá zapísať v tejto forme: Red ↔ Ox + ze - , kde Red je redukovaná forma látky s viac elektrónmi, Ox je oxidovaná forma látky s menším počtom elektrónov a z je počet vymenených eletrónov . Obidve formy látky, ktoré sa líšia iba z počtom elektrónov, tvoria redoxný pár Ox/Red, ktorý je analógiou ku konjugovanému páru z protolytických rekcií (vo vyššie uvedenej reakcií je redoxný pár Zn 2+ /Zn). V priebehu redoxných reakcií dochádza k výmene elektrónov medzi dvoma reakčnými partnermi a teda medzi dvoma redoxnými pármi: Red 1 + Ox 2 ↔ Ox 1 + Red 2 Organické zlúčeniny v priebehu väčšiny redukcií získavajú atómy vodíku (teda elektróny aj protóny) a ide teda o hydrogenácie. Opakom tejto rekcie je dehydregenácia, kedy zlúčenina stráca atómy vodíku (väčšinou sa prenášajú dva atómy) a teda sa oxiduje – príklad nižšie. Všeobecne sa tieto rekcie dajú vyjadriť: Red ↔ Ox + 2H + + 2e - V týchto reakciách tvorí redoxný pár hydrogenovaná a dehydrogenovaná forma látky. Hydrogenácia a dehydrogenácia sú príkladmi redoxných reakcií, kde sa zúčastňujú protóny a teda ich priebeh závisí na pH reakcie. Redoxné páry charakterizujeme oxidoredukčným (redoxným) potenciálom E[V]. Jeho hodnota je výsledkom rovnováhy medzi schopnosťou redukovanej formy redoxného páru sa oxidovať a a schopnosťou oxidovanej formy sa redukovať. Takúto rovnováhu docielime v elektrochemickom poločlánku tvoreného z roztoku oboch foriem redoxného páru a indiferentnej elektródy z platiny. Elektróny z platy zredukujú oxidovanú formu a naopak redukovaná forma predáva svoje elektróny platine a pritom sa oxiduje. Čím ľahšie prijíma oxidovaná forma redoxného páru elektróny, tým silnejšie je oxidačné činidlo a tím je pozitívnejší redoxný potenciál redoxného páru. Kvantitatívne sa redoxný potenciál vyjadruje Nerstonovou rovnicou: 퐸=퐸 0 + 푅푇 푧퐹 푙푛 [ 푂푥 ] [ 푅푒푑 ] . Táto rovnica sa však dá prepočítať na dekadický logaritmus pomocou prepočítavacieho faktora 2,303: 퐸=퐸 0 +2,303 푅푇 푧퐹 푙표푔 [ 푂푥 ] [ 푅푒푑 ] E-aktuálny redoxný potenciál, E 0 -štandardný redoxný potenciál, R-univerzálna plynová koštanta (R = 8,31 J·K -1 ·mol -1 ), T-teplota v K, z-počet vymenených elektrónov, F-Faradayova konštanta (F=96485,34 C.mol -1 ) Štandardný redoxný potenciál E 0 je redoxný potenciál za štandartných podmienok ( teplota 298K alebo 25°C a koncentrácie reaktantov 1mol/l). Nernstova rovnica je analogická s rovnicou na výpočet pH pufrov, kde disociačná konštanta charakterizuje konjugovaný pár ako E 0 charakterizuje redoxný pár. Ďalej k aktuálnemu E prispieva aj logaritmus pomeru látkových množstiev oboch zložiek (analogicky so vzorcom na výpočet pH pufrou). Analogický tvar má aj rovnica pre zmenu Gibbsovej energie v priebehu chemickej reakcie, pretože obe vzťahy vychádzajú zo zákona o chemických rovnováhach. Redoxný potenciál určitých redoxných párov závisí na hodnote pH, pre ne platí Nernstova rovnica pre dvojelektrónový prenos v tvare: 퐸=퐸 0 +2,303 푅푇 푧퐹 푙표푔 [ 푂푥 ] [퐻 3 푂 + ] 2 [ 푅푒푑 ] . Z tohto vzorca vyplýva, že v kyslejšom prostredí je oxidovaná forma redoxného páru je silnejším oxidačným činidlom s dôsledkami aj v organizme. Tiež dokazuje, že môžeme merať pH roztoku pomocou zmeny redoxného potenciálu, použijeme roztok redoxného páru, ktorého redoxný potenciál závisí na hodnote pH. Redoxný potenciál nemôžme merať absolutne, dajú sa získať iba relatívne hodnoty merania rozdielov redoxných potenciálov dvoch redoxných párov spojených do chemického článku. Aby bolo možné zrovnať namerané hodnoty, bol zvolený ako porovnávací redoxný systém H + /½H 2 . Referenčný pár H + /½H 2 je tvorený štandardnou vodíkovou elektródou, ktorá má definované a reprodukovateľné usporiadanie. Prebieha v nej táto reakcia: ½H 2 ↔ H + + e - Redoxný potenciál tejto štandardnej vodíkovej elektródy, a to aktuálny E a štandardný E 0 , bol pre každú teplotu stanovený ako rovný nule (E = E 0 = 0). Získané hodnoty štandardných redoxných potenciálov rôznych redoxných párov nadobúdajú na tejto vodíkovej stupnici hodnoty v rozmedzí od -3V až do +3V. Pre redoxné páry významné v biochemických dejoch sa miesto štandardného redoxného potenciálu E 0 , ktorý je stanovený pre [H 3 O + ] = 1 mol/l, používa veličina E 0I , stanovená pre pH = 7. V redoxných reakciách sa ustáli rovnováha, ktorú môžeme podľa Guldberg-Waagovho zákona popísať rovnovážnou konštantou: Red 1 + Ox 2 ↔ Ox 1 + Red 2 퐾= [ 푂푥 1 ] [푅푒푑 2 ] [ 푅푒푑 1 ] [푂푥 2 ] Pre rovnováhu v redoxných reakciách platí, že E 1 sa rovná E 2 a po dosadení E z Nernstovej rovnice pre obe systémy 1a 2 vyplýva vzťah pre výpočet rovnovážnej konštanty: RTlnK = zF (E 2 0 – E 1 0 ) = zF ∆E 0 Tento vzťah môžeme slovne interpretovať ako: Čím väčší je rozdiel štandardných redoxných potenciál dvoch redoxných párov, tým väčšiu hodnotu bude mať rovnovážna konštanta a tým viac bude rovnováha posunutá v smere vzniku produktov. Využitím vzťahu medzi rovnovážnou konštantou a zmenou štandardnej Gibbsovej energie, môžeme hodnotiť samovoľnosť redoxných reakcií: ∆G 0 = -RTlnK = -zF (E 2 0 – E 1 0 ) =- zF ∆E 0 ; všeobecne: ∆G = zF ∆E Redoxná reakcia prebieha za štandardných podmienok samovoľne v zmysle oxidácie látky 1, ak je E 2 0 väčšie ako E 1 0 , pretože v tomto usporiadaní ide o exergonickú reakciu (∆G 0 <0). Inými slovami sa dá povedať, že ak má donor elektrónov zápornejší redoxný potenciál než akceptor, ide tok elektrónov samovoľne z redukovanej látky 1 na oxidovanú látku 2, oxidácia prebieha samovoľne a energia sa v priebehu reakcie uvoľňuje. To platí nielen pre dvojicu redoxných párov, ale aj pre sériu redoxných systémov, ktoré sú usporiadané podľa stúpajúceho redoxného potenciálu (napr. dýchací reťazec). Ako už bolo konštatované, aktuálny redoxný potenciál E závisí nielen na E 0 , ale aj na koncentráciách reaktantov. Zásadnou zmenou koncentrácie zúčastnených látok teda môžeme obrátiť za aktuálnych reakčných podmienok smer spontánnosti reakcie. Redoxné reakcie v organizme sú úzko spojené so základnými metabolickými procesmi. Redukcie sú dôležité reakčné kroky (napr. pri biosyntéze mastných kyselín a cholesterolu z acetyl.koenzýmu-A –anabolický proces) Naopak, katabolické procesy sú charakterizované mnohými oxidačnými reakciami, ktoré umožňujú vznik ATP, najdôležitejšieho prenášača energie v organizme. Oxidačné činidlá sú všeobecne toxické látky, pretože môžu napr. oxidovať železnatý ión na železitý v hemoglobíne a zmeniť ho tak na nefunkčný methemoglobín. Veľmi citlivé na oxidačné činidlá sú – SH skupiny v postranných reťazcoch bielkovín. Vznikajú tak disulfidické mostíky, ktoré spájajú proteínové reťazce navzájom na úplne náhodných miestach, zmenia ich štruktúru a tak znížia alebo zničia biologickú aktivitu poškodeného proteínu. I/15. Srážecí reakce, součin rozpustnosti, tvorba komplexu, koordinační sloučeniny, příklady a jejich význam v biochemii a medicíně. Zrážacie reakcie sú ty typické tým, že v nich reagujú dobre rozpustné látky (disociované) vo vode a ako produkt vzniká látka, ktorá je vo vode prakticky nerozpustná a veľmi často vzniká vo forme tuhej látky. Takýto produkt sa nazýva zrazenina a v iónových rovniciach ho zapisujeme tak, že za vzorec látky pridáme symbol ↓. Zrážaciu reakciu môžeme zapísať: 1)klasickým zápisom CuSO 4 + 2KOH → Cu(OH) 2 + K 2 SO 4 2)iónovou rovnicou Cu 2+ + SO 4 2- + 2K + + 2OH - → Cu(OH) 2 ↓ + 2K + + SO 4 2- 3)skrátenou iónovou rovnicou Cu 2+ + 2OH - → Cu(OH) 2 ↓ Zrážacie reakcie majú takmer vždy charakter buď protolytickej alebo redoxnej reakcie, ale kvôli svojmu častému výskytu v dejoch a svojej dôležitosti ich vyčleňujeme ako samostatný typ reakcií. Zrážacie reakcie sa využívajú ako analytické metódy pre stanovenie určitých iónov. Príkladom je argentometria, pri ktorej stanovujeme napr. Cl - , Br - , I - , CN - alebo SCN - a ako odmerné činidlo používame AgNO 3 . Vzniknutá zrazenina z reakcie je v určitej rovnováhe s iónmi, ktoré sú disociované v roztoku. Túto rovnováhu medzi iónmi a nedisociovanou látkou môžeme vyjadriť rovnicou: 퐾= [ 퐴 + ] [퐵 − ] [퐴퐵] Pre danú látku je konštanta charakteristická a je závislá na teplote. Ak zvýšime teplotu, časť látky sa rozdelí na ióny a prejde do roztoku. Naopak znižovaním teploty zvýši podiel zrazeniny a látka bude menej rozpustná. Existujú však aj výnimky kedy sa rozpustnosť látky s teplotou znižuje (napr. Na 2 CO 3 ). Ak uvažujeme veľmi málo rozpustnú látku, môžeme zahrnúť nedisociovaný podiel [AB] zahrnúť do konštanty K a dostaneme zjednodušenú konštantu K S , ktorú nazývame súčin rozpustnosti. Súčin rozpustnosti udáva mieru rozpustnosti látky pri danej teplote. Vypočítame ho ako: K.[AB] = K S = [A + ].[B - ] Číselná hodnota K S nám teda udáva veľkosť súčinu molárnych koncentrácií jednotlivých iónov danej látky, pri ktorých sa začnú ióny spájať do nedisociovaných molekúl a látka sa začne vylučovať z roztoku. Hodnoty súčinu rozpustnosti sú veľmi nízke a pohybujú sa rádovo okolo 10 -5 (CaSO 4 ), ale môžu nadobúdať aj extrémnych hodnôt 10 -52 (HgS). K mineralizácii kostí dochádza pri prekročení súčinu rozpustnosti pre Ca 3 (PO 4 ) 2 [K S =10 -26 ]. Pretože koncentrácia vápenatých a fosforečnanových iónov v plazme sa blíži hodnotám súčinu rozpustnosti, je časť vápniku viazaná v neionizovanej forme na albumín, aby sa predišlo nežiaducej kalcifikácii. Miestnym prekročením súčinu rozpustnosti príslušných iónov môže tiež dôjsť k vzniku oxalátových, fosforečnanových a uhličitanových ľadvinových a močových kameňov. Rovnakú príčinu má aj vznik mineralizovaných útvarov po akútnom zápale K – disociačná konštanta [A + ],[B - ] – molárne koncentrácie disociovaných iónov [AB] – molárna koncentrácia zrazeniny pankreasu v jeho okolí, ktoré sú tvorené vápenatými soľami mastných kyselín (voľné mastné kyseliny vznikajú vplyvom lipolytických enzýmov, ktoré sa uvoľnia z buniek pankreasu počas zápalového procesu). Zvláštnym typom reakcií sú tzv. koordinačné alebo komplexotvorné reakcie. Dochádza pri nich k prenosu celých skupín atómov a vzniku koordinačných zlúčenín alebo komplexov. Príkladom takejto reakcie môže byť: CuSO 4 + 4 H 2 O →[Cu(H 2 O) 4 ]SO 4 Koordinačné zlúčeniny sú zvláštnou skupinou látok. Ide o zlúčeniny alebo ióny, kde sa k centrálnemu atómu, ktorý je akceptorom elektrónových párov, viažu ďalšie atómy alebo atómové skupiny (ligandy), ktoré sú donormi elektrónových párov. Počet ligandov prevyšuje oxidačné číslo centrálneho iónu. Centrálny atóm charakterizuje koordinačné číslo (väčšinou 2, 4, 6), ktoré je dané počtom väzieb ligandov k nemu viazaných (teda donorových atómov). Ak ligand obsahuje viac donorových atómov, môže byť viazaný k jednému centrálnemu iónu viacerými koordinačnými väzbami, čím vznikajú komplexné zlúčeniny známe ako cheláty. Na príklad ide tetrapyrrolové komplexy s centrálnymi iónmi Fe, Co, Mg,...a sú súčasťou hemoglobínu, cytochromov, chlorofylu alebo vitamínu B 12 . Elektróny do koordinačnej väzby sú poskytované dusíkovými atómami pyrrolov svojimi elektrónovými pármi. Ligandy môžu byť katióny (NO + - nitrozyl) , anióny (Cl - , CN - , OH - ,...) alebo neutrálne molekuly (H 2 O, NH 3 , CO,...). Prechodné prvky majú schopnosť tvoriť silné koordinačné zlúčeniny, vďaka usporiadaniu ich elektrónového obalu. Ióny prechodných prvkov majú neúplne obsadené hladiny d a elektróny sú v nich čiastočne alebo úplne nespárené (napr. Cr 3+ má tri, Mn 2+ má päť, Fe 2+ má štyri,...).Vďaka ligandom, ktoré dodávajú elektróny do väzby, sa môžu elektróny centrálneho atómu párovať a vytvárať väzby. Po vzniku väzieb kov v komplexe zmení svoje vlastnosti a je viazaný pevnejšie. Vďaka tomu sa vyžívajú cheláty pri vylučovaní ťažkých kovov z organizmu pri otravách (napr. 20% roztok ethylendiamintetraoctanu disodnovápenatého – soľ od EDTA – vzorec vedľa). Táto látka je dobre rozpustná vo vode a je schopná zameniť viazaný vápnik za ťažký kov (Pb, Cd, Mn, Sr,...). Vzniknutá látka je rozpustná a organizmus ju nemetabolizuje a tak sa vylučuje močom, dlhodobo však poškodzuje ľadviny a krvotvorbu. Pri otravách Mg, Ba, Fe sa musí využiť iné chelatačné činidlo. Niektoré cheláty sa využívajú v analytickej chémii. Komplexné zlúčeniny sú väčšinou vo vode rozpustné, menej disociované a vzhľadom ku koordinačným väzbám sa od pôvodných látok líšia farbou aj rozpustnosťou. I/16. Chemické vlastnosti hlavních biogenních prvků Biogénne prvky sú také, ktoré sú nevyhnutné pre existenciu života. Obzvlášť dôležitá je skupina šiestich prvkov (C, H, O, N, S, P), ktoré sú nutné pre stavbu základných biomolekúl (hlavne proteínov, nukleových kyslín, sacharidov a lipidov). Okrem týchto sa v organizme viažu v menších množstvách alebo sa vyskytujú vo vnútornom prostredí v iónovej forme ďalšie prvky (K, Na, Ca, F, Cl, I, Fe). Uhlík (C) je hlavným stavebným prvkom všetkých organických zlúčenín. V elementárnej forme je nereaktívny a má viacero modifikácií (grafit, diamant, fullerén). Uhlík s elektropozitívnejšími prvkami tvorí zlúčeniny, ktoré sa nazývajú karbidy (uhlík je tu anión), ktoré sú veľmi tvrdé, pevné a majú vysokú teplotu topenia. Uhlík s kyslíkom vytvára významné oxidy a to oxid uhoľnatý (CO) a oxid uhličitý (CO 2 ). Oxid uhličitý je konečným produktom oxidácie organických zlúčenín v organizme a mimo neho. Vo vyšších koncentráciách vo vzduchu bráni prenosu kyslíku v krvi. Je ťažší ako vzduch a vytláča kyslík do horných vrstiev a potom je pre človek nedostupný, takto CO 2 spôsobuje udusenie z nedostatku kyslíka vo vdychovanom vzduchu. S vodou tvorí slabú a nestálu kyselinu uhličitú (H 2 CO 3 ). Je nestála a samovoľne sa rozkladá na CO 2 a H 2 O. Využíva sa v organizme na udržiavanie stálej hladiny pH v hydrogénuhličitanovom (bikarbonátovom) pufrovom systéme (H 2 CO 3 /HCO 3 - ). Kyselina tiež vytvára dva typy solí – uhličitany a hydrogénuhličitany. Hydrogénuhličitan sodný (jedlá sóda) sa využíva na zníženie kyslosti žalúdočnej šťavy. Všetky uhličitany reagujú s kyselinami za vzniku slabej kyseliny uhličitej. Analogicky uhlík so sírou vytvára toxický sirouhlík (CS 2 ). Je to bezfarebná kvapalina, nerozpustná vo vode a využíva sa ako nepolárne rozpúšťadlo. Ďalšou významnou slabou kyslinou uhlíku je kyanovodík (HCN). Pre svoju vysokú toxicitu pre ľudský organizmus budú kyanovodík a jeho soli spolu s oxidom uhoľnatým uvedené v otázke I/19. Vodík (H) je najmenší a najľahší prvok, obsahuje jeden protón a jeden elektrón a vyskytuje sa v troch izotopoch (protium, deuterium a tretium). Voľný sa vyskytuje len v malom množstve aviazaný je najviac vo vode a organických zlúčeninách. Vodík je plynný prvok a ako ostatné, tiež vytvára dvojatómové molekuly H 2 . Atomárny vodík je veľmi reaktívny a zlučuje sa v exotermickej reakcií na molekulárny vodík, ktorý je stabilný. Vodík so skoro všetkými prvkami (okrem vzácnych plynov) vytvára hydridy. V kovalentných zlúčeninách je vodík čiastočne nositeľom kladného náboja a vo vodnom roztoku sa odštiepuje ako katión H + (protón). Protóny nie sú schopné samostatnej existencie a vo vode sa hydratujú na H 3 O + (oxóniové katióny). Medzi molekulami, v ktorých je vodík naviazaný k silne elektronegatívnemu prvku (F, O, N), vznikajú slabé vodíkové väzby (mostíky). Dôležitou reakciou je prudká oxidácia s kyslíkom (horenie), kde vzniká voda a uvoľní sa veľké množstvo energie (tepla). Podobná, ale prísne riadená reakcia je aeróbna oxidácia v mitochondriách, z ktorej postupne uvoľňovaná energia z dýchacieho reťazca sa viaže v ATP. Najvýznamnejšou zlúčeninou vodíka je voda (viac otázka I/2). Kyslík (O) je veľmi reaktívny bezfarebný plyn. O kyslíku sa viac hovorí v otázke I/17. Dusík (N) je ďalší plynný prvok, je to najviac zastúpený plyn vo vzduchu. Vytvára dvojatómové molekuly N 2 , ktoré sú vďaka trojitej väzbe takmer inertné (atómový je však reaktívny). Dusík sa dá ľahko skvapalniť, vďaka nízkej teplote varu (cca - 200°C), čo sa využíva v hlbokom zmrazovaní biologického materiálu a v kožnom lekárstve (vypaľovanie bradavíc). Zlúčenina dusíku s vodíkom sa nazýva amoniak (NH 3 ), je to plyn a vo vode sa chová ako slabá zásada. Dráždi sliznice a je silno toxický pre CNS. V organizme vzniká deamináciou aminokyselín a musí byť okamžite odstraňovaný. Vďaka voľnému elektrónovému páru na dusíku prijíma amoniak protón a vzniká z neho katión NH 4 + (konjugovaný pár NH 3 /NH 4 + ). Voľný elektrónový pár tiež umožňuje tvorbu komplexných zlúčenín s prechodnými prvkami. S kyselinami vytvára dobre rozpustné amónne soli. Dusík s kyslíkom vtvárajú päť rôznych oxidov. Oxid dusný (N 2 O, rajský plyn) je inertný plyn a v zmesi s kyslíkom sa požíva ako krátkodobé anestetikum. Oxid dusnatý (NO) ľahko so vzdušným kyslíkom oxiduje na oxid dusičitý. V organizme vzniká oxidáciou arginínu a plní úlohu neurotransmiteru. V bunke má krátky polčas (asi 4s), spustí sériu enzymatických reakcií, ktoré vyvolajú vazokonstrikciu hladkých svalov a potom sa rýchlo zoxiduje. Molekula NO dokáže uvoľniť cievne spazmy v liečbe srdcových chorôb nitroglycerínom (substrát pre vznik NO).Zvýšená tvorba NO a ďalšie reakcie, ktoré vedú k relaxácií hladkých svalov majú rozhodujúcu úlohu pri erekcií a liečby impotencie. Oxid dusitý (N 2 O 3 ) je nestabilný a ľahko disproporcuje na oxid dusný a oxid dusičitý. Oxid dusičitý (NO 2 ) je silné oxidačné činidlo a je veľmi toxický pre organizmus. Oxid dusičný (N 2 O 5 ) je veľmi reaktívna, nestála kvapalina. Oxidy dusíka v ovzduší dráždia dýchacie cesty, vyvolávajú kašeľ až edém pľúc. Ich fotolýzou (najmä NO 2 ) môže vzniknúť nebezpečný fotooxidačný smog. Z kyslíkatých kyslín sú významné kyselina dusitá a dusičná. Voľná kyselina dusitá (HNO 2 ) je nestála. Tvorí soli, dusitany, ktoré sú veľmi toxické pre organizmus. Ich pôsobením dochádza k oxidácií Fe 2+ na Fe 3+ v hemoglobíne a tak k výrobe methemoglobínu, ktorý nie je schopný viazať a prenášať kyslík. Reakcia je nebezpečná u kojencov, lebo fetálny hemoglobín je citlivejší na oxidáciu než dospelý hemoglobín. Ďalej sú dusitany nebezpečné kvôli ich reakcií so sekundárnymi amínmi a vzniku nitrosamínov, ktoré sú karcinogénne a mutagénne a veľmi poškodzujú hepatocyty. Kyselina dusičná (HNO 3 ) je silná, reaktívna kyslina so silnými oxidačnými vlastnosťami. Vytvára soli, dusičnany, ktoré sú vo vode veľmi rozpustné. Ľahko tak kontaminujú pitnú vodu (hnojenie pôdy) a často aj potraviny. Dusičnany sú pre organizmus toxické, lebo ich črevné baktérie redukujú na dusitany. Síra (S) je žltá pevná látka, nerozpustná vo vode, ale rozpustná v nepolárnych rozpúšťadlách, je zlý vodič a vyskytuje sa vo viacerých kryštalických a amorfných modifikáciách. Elementárna síra má baktericídne účinky a preto sa využíva v dermatológií. Významná bezkyslíkatá zlúčenina síry je sulfán (H 2 S), jej roztok je slabá kyslina, ktorá tvorí dva typy solí – sulfidy a hydrogénsulfidy. Sulfán je veľmi toxická látka (viac otázka I/16). Z kyslíkatých zlúčenín sú významné oxidy – oxid siričitý a sírový a kyseliny – kyselina siričitá a sírová. Oxid siričitý (SO 2 ) vzniká hlavne pri spaľovaní neaktívneho uhlia a silne znečisťuje ovzdušie. Ako súčasť smogu má dráždivé účinky na horné dýchacie cesty, vyvoláva dusivý kašeľ a zápalové zmeny dýchacích ciest. Vo vyššej časti atmosféry sa oxiduje na oxid sírový, ktorý dáva vznik slabému roztoku kyseliny sírovej, ktorá sa vracia na zem v podobe kyslých dažďov. Oxid siričitý je dobre rozpustný vo vode a tvorí slabú nestálu kyselinu siričitú (H 2 SO 3 ), ktorej soli, siričitany, ľahko oxidujú vo vodnom roztoku na sírany. Oxid sírový je silné oxidačné činidlo, mimoriadne silne pohlcuje vodu (hygroskopické účinky), s ktorou sa zlučuje na kyselinu sírovú (H 2 SO 4 ). Koncentrovaná kyselina sírová je silné oxidačné činidlo, ale nemá vlastnosti silnej kyseliny. Zriedená kyselina sírová je silnou kyslinou a je schopná ľahko oddisociovať protóny. Tvorí dva typy solí – sírany a hydrogénsírany. Síranové anióny sa v čreve málo vstrebávajú, viažu na seba vodu a pôsobia ako laxatíva (síran horečnatý a sodný). Síran bárnatý je nerozpustný vo vode ani kyselinách, pohlcuje röntgenové a preto sa používa ako kontrastná látka v rádiológií. V organizme je síra významná najmä v –SH skupine aminokyselín, peptidov a proteínov. Kyselina sírová tvorí dôležité estery heteropolysacharidov a podieľa sa na detoxikácií organizmu tvorbou rozpustných esterov cudzorodých látok a už nepotrebných metabolitov. Sulfónové kyseliny sú veľmi silné organické kysliny so sulfónovou skupinou (-SO 3 H) viazanou priamo na uhlíkový atóm (viac otázka I/21). Sulfonamidy s funkčnou skupinou –SO 2 NH 2 majú antibakteriálne účinky a slúžia ako lieky. Fosfor (P) má tri hlavné modifikácie: čierny, červený (stále, netoxické, nerozpustné vo vode ani tukoch) a biely fosfor (P 4 , veľmi reaktívny, samozápalný na vzduchu, vysoko toxický a dobre rozpustný v tukoch). Zo zlúčenín fosforu je najvýznamnejšia kyselina trihydrogénfosforečná (H 3 PO 4 ), ktorá je stredne silná kyselina tvorí tri rady solí: dihydrogénfosforečnany, hydrogénfosforečnany a fosforečnany. Vápenaté a horečnaté fosfáty sú dôležitou súčasťou kostného tkaniva, fosfátové anióny vytvárajú pufrový systém (H 2 PO 4 - /HPO 4 2- ) v moči a krvnej plazme. Kyselina fosforečná tvorí s cukrami, lipidmi, nukleozidmy a inými biomolekulami významné estery a anhydridy pre život. Draslík (K) patrí medzi alkalické kovy. Ide o strieborný, lesklý mäkký neušľachtilý kov, s vysokou reaktivitou (uchováva sa inertnom prostredí, napr. petrolej), má silné redukčné schopnosti, na vzduchu oxiduje a je dobrým vodičom. S vodou reaguje búrlivo za vzniku hydroxidu draselného (KOH), ktorý je dobre rozpustný vo vode a dáva vznik silne zásaditému roztoku. S kyselinami vytvára draselné soli, ktoré sú tiež veľmi rozpustné. Draselný katión (K + ) je hlavným intracelulárnym katiónom (koncentrácia intracelulárne je 135-150 mmol/l, koncentrácia extracelulárne je okolo 5 mmol/l), kde je asi 98% jeho celkového množstva, v bunke je väčšinou naviazaný na proteíny alebo sacharidy. Extracelulárne je obsiahnutých asi len 2% K + . Uplatňuje sa hlavne pri membránovom potenciále – prenos nervového vzruchu, dráždivosť svalov. Sodík (Na) má podobné chemické vlastnosti ako draslík a s vodou prudko reaguje za vzniku hydroxidu sodného a vodíku. Hydroxid sodný (NaOH) je dobre rozpustný vo vode, vo vode kompletne disociuje za vzniku silne zásaditého roztoku. S kyselinami vznikajú veľmi dobré rozpustné sodné soli. Sodný katión (Na + ) je hlavný extracelulárny katión (koncentrácia extracelulárne je 145 mmol/l a intracelulárne 5-10 mmol/l), v exracelulárnej tekutine sa nachádza asi 50% jeho množstva, ďalších 40% je viazaných v kostiach a v intracelulárnej tekutine je zvyšných 10%. Zúčastňuje sa na vzniku kľudového membránového potenciálu a hlavne akčného potenciálu. Vplyvom vysokej koncentrácie v extracelulárnej tekutine sa najviac podieľa na jej osmolalite. Vápnik (Ca) patrí medzi kovy alkalických zemín a má podobné vlastnosti ako sodík a draslík. S vodou poskytuje hydroxid vápenatý Ca(OH) 2 , ktorého roztok reaguje zásadito. Medzi nerozpustné vápenaté soli patria fosfát, uhličitan, fluorid, síran a šťaveľan. V tele sa veľká časť vápniku nachádza uložená v kostiach a zuboch vo forme hydroxyapatitu, fluoridu a uhličitanu. V kostiach dochádza neustále k ich remodelácií a vápnik tu slúži ako pohotová zásoba. Zvyšný vápnik sa nachádza v extracelulárnej tekutine (koncentrácia extracelulárne 2-4 mmol/l, intracelulárne 4-10 mmol/l) viónovej forme a čiastočne je viazaný v rozpustných komplexoch s kyselinou citrónovou a mliečnou, časť je viazaná na bielkoviny. Metabolizmus vápniku úzko súvisí s metabolizmom fosfátov. Vzostup koncentrácie fosfátov môže viesť k poklesu ionizovaného vápniku, lebo sa tvorí nerozpustný fosforečnan vápenatý. Fyziologicky aktívny je iba ionizovaný Ca 2+ , ktorý znižuje nervosvalovú dráždivosť, je nevyhnutný pre svalovú kontrakciu a hemokoaguláciu. Pre prípravu nezrážanlivej krvi využívame tvorby rozpustných vápenatých komplexov napr. s citrátom alebo nerozpustných solí so šťaveľanom alebo fluoridom. Vápenatý katión potom nemôže plniť funkciu aktivátoru pri zrážaní krvi. Pri alergických reakciách sa využíva intravenózna aplikácia Ca 2+ k zníženiu priepustnosti membrán a kapilárnych stien. Nerozpustné soli, predovšetkým šťaveľan vápenatý, môžu byť súčasťou ľadvinových kameňov. Fluór (F) je zelenožltý plyn, ktorý má najvyššiu hodnotu elektronegativity a je teda najreaktívnejším prvkom. Jeho zlúčenina s vodíkom, fluorovodík, je veľmi toxická, spôsobuje poleptanie slizníc a znižuje koncentráciu Ca 2+ . Fluór je významný v organizme pre mineralizáciu kostí, urychľovaním premeny apatitu na fluórapatit. Je nevyhnutný pre správyn vývoj zubov, pôsobí na ich ochranu pred zubným kazom (preto sú pasty fluórizované). Nedostatok fluóru v potrave sa kompenzuje podávaním fluoridu sodného (NaF), ktorého množstvo však musíme dôsledne kontrolovať, lebo fluoridový anión F - tvorí veľmi ochotne nerozpustný fluorid vápenatý. Túto vlastnosť však využívame pri získaní nezrážanlivej krvi, napr. pri príprave fluoridovej plazmy. Nadbytok fluoridových iónov je pre organizmus veľmi toxický, otrava sa lieči hlavne podaním vápenatých alebo horečnatých solí. Fluoridové ióny sú nebezpečné, lebo sa metabolizujú na kyselinu fluóroctovú a následne kyselinu fluórcitrónovú, ktorá je inhibítorom citrátového cyklu. Anión F - má účinok aj na niektoré enzýmy, napr. inhibuje cholinesterázu alebo enolázu, katalyzujúcu dehydratáciu 2-fosfoglycerátu za tvorby fosfoenolpyruvátu, čím zastavuje glykolýzu. Táto inhibícia sa používa na zastavanie prebiehajúcej glykolýzy vo vzorke krvi pri stanovení glukózy. Chlór (Cl) je vysoko reaktívny žltozelený plyn, ktorý tvorí dvojatómové molekuly Cl 2 . Je elektronegtívny, ťažší ako vzduch, silne toxický (dráždi a leptá sliznice dýchacích ciest a spojivky), má baktericídne účinky a používa sa ako dezinfekčný prostriedok pri úprave pitnej vody. S vodíkom tvorí toxický plynný chlorovodík (HCl), ktorý sa vo vode rozpúšťa na kyselinu chlorovodíkovú. Jej najvýznamnejšia soľ, chlorid sodný (NaCl), je zdrojom chloridového aniónu pre organizmus. Vodný roztok NaCl o koncentrácií 0,15 mol/l je izotonický roztok s krvnou plazmou a využíva sa ako fyziologický roztok. Žalúdočná sliznica je schopná produkovať HCl vo vysokej koncentrácií (až 0,1 mol/l), čo zaručuje kyslé prostredie žalúdku, potrebné na priebeh proteolýzy. Chloridový anión (Cl - ) je hlavným extracelulárnym aniónom (koncentrácia extracelulárne je 120 mmol/l, intracelulárne 5 mmol/l) a podieľa sa z veľkej časti na osmolalite plazmy. Reakciou Cl - s peroxidom vodíka vo fagocytujúcich bunkách vzniká reaktívna kyselina chlórna, ktorá sa zapojuje do radikálových reakcií. Voľné kyslíkaté kyseliny chlóru sú nestále a ich sila stúpa s oxidačným číslom. Ich soli, chlorečnany a chloristany, sú silné oxidačné činidla. Jód (I) je fialovočierna tuhá kryštalická látka, ktorá na vzduchu sublimuje. Etanolový roztok jódu s prídavkom jodidu draselného sa používa na vonkajšiu dezinfekciu. Rádioaktívny izotop jódu sa viazaný v rôznych zlúčeninách sa používa v scintigrafií štítnej žľazy. Jodidy, ktoré sa rezorbujú z potravy, sú následne naviazané na bielkoviny štítnej žľazy, oxidované na jód a využívané k syntéze hormónov štítnej žľazy. Nedostatok jódu vedie k poruchám činnosti štítnej žľazy. Jódovaná kuchynská soľ je v našich podmienkach hlavným zdrojom jódu pre organizmus. Železo (Fe) je pomerne reaktívny kov s oxidačnými číslami +II a +III. Obe ióny sa zúčastňujú radikálových reakcií. Železnaté zlúčeniny sa ľahko oxidujú na železité. Ióny Fe 2+ a Fe 3+ tvoria komplexné zlúčeniny, v organizmu je časť železa viazaná v tetrapyrrolových komplexoch. V hemoglobíne a myoglobíne sa nachádza výhradne železo s oxidačným číslom +II, no v cytochrómoch sa uplatňujú Fe 2+ aj Fe 3+ , lebo sa podieľajú na prenose elektrónov. Železo sa vstrebáva vo forme Fe 2+ a je ihneď oxidované. V krvi sa prenáša Fe 3+ viazané na molekulu bielkoviny transferrínu a v tkanivách sa ukladá vo väzbe na bielkovinu ferritin. Organizmus touto oxidáciou bráni reakcií Fe 2+ so vznikajúcim peroxidom vodíka a tím aj tvorbe reaktívneho hydroxylového radikálu. Predávkovaním prijímaných železnatých zlúčenín môžu byť poškodené hepatálne funkcie a môže dôjsť k zlyhaniu ľadvín. I/17. Kyslík a jeho anorganické sloučeniny, reaktivita, vlastnosti. Kyslík (O) je prvkom IV.A skupiny, ide o plynný bezfarebný prvok. Atomárny kyslík je veľmi reaktívny prvok a je za normálnej teploty schopný reagovať s takmer všetkými prvkami. Dvojatómová molekula O 2 je relatívne stála, aj keď obsahuje dva nepárové elektróny (ktoré však majú rovnaký spin). Kyslík má po fluóre druhú najvyššiu hodnotu elektronegativity (3,5), má veľkú afinitu k elektrónom a preto reaguje ako silné oxidačné činidlo. V medicíne sa elementárny kyslík využíva v dýchacích prístrojoch vo vyššej koncentrácií ako je vo vzduchu, ale vždy sa vyskytuje v zmesi s niektorými vzácnymi plynmi a jeho parciálny tlak je presne nastavený. Okrem dvojatómovej molekuly tvorí kyslík aj trojatómové molekuly ozónu O 3 . Ozón vzniká dodaním energie voľnému kyslíku, ktorý sa rozštiepi na atomárny kyslík a ten zreaguje s ďalšími molekulami kyslíku na O 3 . Ozón je extrémne reaktívny a nestabilný, pôsobí ako oxidačné činidlo, štiepi dvojité väzby v organických zlúčeninách a je pre organizmus toxický. Vo vyšších koncentráciách ho nájdeme len vo vyšších vrstvách atmosféry, kde plní dôležitú funkciu filtru nežiaduceho UV žiarenia, ktoré pohlcuje a zabraňuje jeho škodlivému vplyvu na organizmy. Vrstvu ozónu znižujú reakcie s oxidmi dusíku a freónmi (fluórchlórderiváty uhľovodíkov). Kyslík vo väčšine svojich zlúčenín má oxidačné číslo –II. S takmer všetkými prvkami tvorí najrozmanitejšiu a najrozsiahlejšiu skupinu kyslíkatých zlúčenín a to oxidy. V závislosti od prvkov s ktorými sa oxid vytvoril (kyselinotvorné, zásadotvorné alebo amfotérne) môžu oxidy tvoriť s vodou kyseliny, hydroxidy alebo s ňou nereagovať (CO, NO). Reakciou s vodíkom vzniká pre život najvýznamnejší oxid –voda (viac otázka I/2). V soliach, ktoré sú vedľajšími produktmi neutralizácie, si kyslík stále zachováva oxidačné číslo –II. Okrem oxidov, kyslík tiež tvorí zlúčeniny, v ktorých sa vyskytuje v oxidačnom čísle –I, peroxidy. Peroxidy, ktoré sú tvorené kyslíkom a prvkom prvých dvoch hlavných skupín sú pomerne nestabilné, uvoľňujú kyslík a reagujú ako oxidačné činidlá. Najvýznamnejší je peroxid vodíka (H 2 O 2 ), ktorý sa ako najčastejšie 3% roztok používa na dezinfekciu povrchových rán. V organizme vzniknutý H 2 O 2 je nevyhnutný pre oxidáciu jodidov na elementárny jód, ktorý potrebuje štítna žľaza na syntézu hormónov. Nadbytočné množstvo H 2 O 2 sa okamžite odstraňuje predovšetkým enzymaticky katalyzovanými reakciami. I/18. Peroxidace lipidů. Peroxidácia (auto-oxidácia) lipidov, ktoré sú vystavené kyslíku spôsobuje skazenie jedla, ale v organizme tiež spôsobuje poškodenie tkanív, zápalové ochorenia, aterosklerózu, napomáha starnutiu a má aj karcinogénne účinky. Škodlivé účinky spôsobujú voľné radikály (ROO * , RO * , * OH), ktoré vznikajú tvorby peroxidu z mastných kyselín obsahujúcich dvojité väzby oddelené metylénom, tj. také, ktoré sa nachádzajú v prirodzene sa vyskytujúcich polynenasýtených mastných kyselinách. Peroxidácia lipidov je reťazová reakcia, ktorá je nepretržitým zdrojom voľných radikálov, ktoré vyvolávajú ďalšiu peroxidáciu, čo môže mať potenciálne devastujúci účinok. Celý proces sa dá znázorniť takto: 1. Inicácia ROOH + kov (n) → ROO * + kov (n-1) + H + 2. Propagácia R * + O 2 → ROO * ROO * + RH → ROOH + R * .... 3. Terminácia ROO * + ROO * → ROOR + O 2 ROO * + R * → ROOR R * + R * → RR Aby sa predišlo a bola kontrolovaná peroxidácia lipidov, využívajú sa v organizme a v prírode antioxidanty (viac v otázke II/38). I/19. Toxikologicky významné prvky, mechanismus působení vybraných toxických sloučenin (CO, KCN, HCN, H2S, těžké kovy) Arzén (As) a jeho vlastnosti boli dávno známe a využívané ešte pred naším letopočtom. Je silno toxický a preto je jeho použitie dnes veľmi obmedzené. Spaľovaním nekvalitného hnedého uhlia vzniká oxid arzenitý, ktorý sa adsorbuje na jemný popolček, ktorý sa môže buď vdýchnuť alebo kontaminovať pôdu a vodu. Oveľa viac toxické sú arzeničné zlúčeniny než arzenité. Arzeničné zlúčeniny nahrádzajú niektorých dôležitých zlúčeninách v organizme fosfáty a tak inhibujú metabolické cesty, napr. metabolizmus glukózy. Arzenité zlúčeniny sa využívajú ako súčasť pesticídov, insekticídov, vinárskych postrekov a návnad proti hlodavcom. Rezorbované arzenité zlúčeniny vyvolávajú hlboký rozvrat substrátovej fosforylácie v glykolýze – vzniká 1-arzeno-3-fosfoglycerát miesto 1,3-bisfosfoglycerátu a vzniká teplo miesto ATP. Arzenitany blokujú citrátový cyklus na úrovni 2-oxoglutarátdehydogenázy. Ďalej blokujú sulfhydrylové skupiny enzýmov, napr. pri cholindehydrogenáze. Otrava vdychovaním arzenitých zlúčenín sa prejavuje kašľom, dusením a celkovým ochabnutím (podobne sa prejavuje aj použitie organoarzenitých bojových látok). Akútna otrava po požití sa prejaví najprv v tráviacej sústave a následne poruchami CNS. Pri chronickej otrave vznikajú zmeny na koži a slizniciach, neurologické poruchy a poruchy krvotvorby. Arzén ma karcinogénne účinky, hromadí sa v koži a vlasoch. Ako antidotum sa môže použiť napr. oxid horečnatý (za tvorby rozpustného arzenitanu horečnatého ) alebo BAL (British anti-lewisite alebo 2,3-dimerkaptopropanol), ktorý viaže arzén do stabilného komplexu so svojimi –SH skupinami, využíva sa väčšia afinita As 3+ k –SH skupinám antidota ako –SH skupinám enzýmov. Báryum (Ba) sa využíva ako súčasť nerozpustného síranu bárnateho v rádiológií ako kontrastná látka (nerozpúšťa ho voda ani silné kyseliny). Bárnate ióny disociované z rozpustných zlúčenín sú toxické a spôsobujú spazmy hladkého svalstva. Ako antidotum sa využíva síran sodný, z ktorého vzniká nerozpustný síran bárnatý. Berýlium (Be) sa do organizmu môže dostať vdýchnutím prachu berýlnych zlúčenín, ktorý vzniká spaľovaním uhlia a môže vyvolať zmeny na pľúcach, ktoré vedú až k rakovine pľúc. Ďalej sú nebezpečné pre väčšinu tkanív aj berýlnaté ióny disociované z rozpustných solí. Berýlnaté katióny sa vstrebávajú, viažu na bielkoviny a transportujú sa do celého organizmu. Vytesňujú esenciálne prvky, ako napr. horčík a tak inaktivujú enzýmy, ktoré potrebujú k svojej funkcií horčík. Berýlium pôsobí na chromozómy deliacich buniek, vytesňuje ióny horčíka a poškodzuje syntézu RNA. Kadmium (Cd) má uplatnenie v priemysle ako stabilizátor plastických hmôt, v zliatinách k výrobe batérií , elektród alebo pigmentov do farieb. Zdrojom znečistenia ovzdušia kadmiom je spaľovanie hnedého uhlia. Kadmium sa do vody, pôdy a ďalej do potravín dostáva zo severoafrických superfosfátov s obsahom kadmia, ktoré sa požívajú ako hnojivá. Za zdroj kadmia môžeme považovať aj tabákové výrobky. Kadmiové ióny negatívne ovplyvňujú metabolizmus železa, medi a zinku, vyvolávajú zmeny krvného obrazu, poruchy činnosti srdca a pečene. Kadmium konkuruje vápniku a preto spomaľuje rast kostí a pôsobí na ich mineralizáciu. V plazme sa viaže na plazmatické proteíny a v tele sa ukladá prevažne do ľadvín, sleziny a pečene. Vysoká koncentrácia kademnatých iónov vo varlatách vedie k ich deštrukcií a vyvoláva tzv. chemickú kastráciu. Kadmium prestupuje placentárnou bariérou a vyvoláva vývojové vady plodu a môže vyvolať až spontánny potrat. Ako antidota sa používajú zlúčeniny s –SH skupinou( ako napr. D-cysteín, 2,3-dimerkaptopropanol) alebo chelatačné činidlá (napr. etyléndiamintetraoctan disodnovápenatý). Lítium (Li) a konkrétne jeho zlúčeniny (uhličitan, síran, octan, aspartan) sa používajú v psychiatrii na liečbu maniodepresívnej psychózy. Salicylan a citronan lítny sa používajú k liečbe dny, lebo bránia chorobnému ukladaniu nerozpustnej kyseliny močovej tvorobou rozpustného močanu (urátu) lítneho. Ako podporná liečba dny sa odporúča pitie minerálnych vôd s vysokou koncentráciou lítia (Vincentka, Zaječická, Mlýnský pramen – CZ; Sulinka, Cígeľka – SK), čo ale zvyšuje jeho koncentráciu v krvi. Lítny katión je toxický a teda je potrebná kontrola jeho koncentrácie v krvi počas liečby. Lítne ióny sa ľahko vstrebávajú a a transportujú sa do celého organizmu, naviažu sa na plazmatické bielkoviny a poškodzujú štítnu žľazu, kardiovaskulárny a nervový systém. Olovo (Pb) je jeden z najrozšírenejších ťažkých kovov a má veľké využitie. Olovom môže byť kontaminované ovzdušie, voda aj potrava. Olovo sa kyslými dažďami vymýva zo zlúčenín v pôde a dostáva sa do vody, ktorú kontaminuje. Zvýšená koncentrácia olova v pitnej vode nastáva tam, kde sa upravená voda (chlórovaná, s kyslým pH) stále rozvádza oloveným potrubím. Olovo sa v organizme vstrebáva najmä pľúcami a tráviacou sústavou. Viaže sa membránu erytrocytov a spôsobuje ich rozpad, čím vyvoláva anémiu a ďalej inhibuje enzýmy pri biosyntéze hemu. Dlhodobým kontaktom sa olovo ukladá v kostiach, poškodzuje nervový systém, ľadviny a činnosť srdca. Organické zlúčeniny olova poškodzujú CNS. Toxické tetraetylolovo sa používalo vo výrobe benzínu, no teraz je obmedzené výrobou bezolovnatého benzínu. Ortuť (Hg) je kvapalný kovový prvok nerozpustný vo vode. V tráviacom systéme sa nevstrebáva a má často laxatívn účinky. Výpary ortuti prenikajú do organizmu pľúcami (súčasne ich aj poškodzujú) alebo kožou a ďalej prenikajú do krvného obehu. Elementárna ortuť je rozpustná v tukoch a preto poškodzuje CNS. S kovmi tvorí ortuť amalgámy, ktoré sú významné v stomatológií. Tvorba amalgámov sa tiež využíva pri likvidácií kvapalnej ortuti (posypanie ortuti zinkom). Závažnejšie je znečistenie prostredia vo vode rozpustnými soľami ortuti (väčšina solí ortuti sú vo vode nerozpustné). Odpady z priemyslu kontaminujú pôdu a vodu a ortutnaté katióny sa dostávajú do potravy. Nebezpečné je aj kontaminované mäso morských rýb a to hlavne alkylortutnatými zlúčeninami, ktoré sú rozpustné vo vode aj v tukoch. Ortutnaté ióny v organizme poškodzujú ľadviny a nervovú sústavu, inaktivujú enzýmy väzbou na thiolové skupiny bielkovinovej časti enzýmu. Schopnosť viazať sa na –SH skupinu sa využíva aj pri detoxikácií ortuti podaním mlieka alebo vaječného bielka. Tálium (Tl) je vysoko toxický a karcinogénny kovový prvok (podobné vlastnosti majú aj jeho zlúčeniny). Jeho zlúčeniny sú veľmi dobre rozpustné vo vode. Nebezpečný je kontakt s kožou, ale tiež sa do organizmu môže dostať cez tráviacu sústavu alebo vdýchnutím, ďalej sa šíri do prakticky všetkých tkanív v tele. Tálium má veľmi podobné vlastnosti ako draslík, v tele mu konkuruje a zastavuje veľa bunkových procesov, v ktorých pôsobí draslík. Akútna otrava táliom spôsobuje tráviace problémy, zatiaľ čo chronická otrava spôsobuje nervové ťažkosti. Pri akútnej otrave sa v prvých hodinách prejavuje bolesť brucha, nevoľnosť a zvracanie. V priebehu pár dní nastáva poškodenie periférnych nervov (senzitívna neuropatia), najmä na chodidlách a dlaniach, ktorých prejavom sú kŕče, zmätenosť, halucinácie až bezvedomie. Neskôr nastupujú neuropsychiatrické problémy ako úzkosť, zmätenosť, delírium, halucinácie, agresivita, zmena osobnosti, apatia a tiež poruchy videnia. Chronická otrava sa prejavuje únavou, bolesťami hlavy, depresiami, nechutenstvom, vypadávaním vlasov v neskorších štádiách a poruchou zraku. Otrava táliom zanecháva u preživších neurologické alebo zrakové dôsledky. Zlato (Au) sa vyznačuje svojim typickým žltým sfarbením, ide o vzácny kov, využíva sa v klenotníctve, stomatológií, pozlacovaní kovov, etc. Čisté zlato nie je toxické a zriedkavo sa dokonca používa ako aditívum do drahých jedál a nápojov. Toxické sú však ióny zlata, ktoré sa dostávajú do tela pomocou solí zlata a potom pôsobia toxicitu pre pečeň, pľúca a ľadviny. Organokovové zlúčeniny zlata sa využívajú ako antireumatikum, no sú však značne toxické. Striebro (Ag) sa využíva v medicíne pre svoje antiseptické a baktericídne účinky a v rádiológií pri vzniku snímkov. Strieborné soli sú však toxické, dráždivé a leptavé. Chronická otrava striebrom (argýria) spôsobuje usádzanie strieborných iónov v orgánoch, slizniciach a v koži. Vanád (V) je veľmi toxický prvok. Vdychovaním jeho zlúčenín sa poškodzujú pľúca: Vanád v organizme poškodzuje pečeň, ľadviny, tráviacu sústavu, CNS a cievy. Otrava sa prejavuje bledosťou, zelenočerveným sfarbením jazyka, kŕčovitým kašľom a trasom rúk. Oxid uhoľnatý (CO) vzniká spaľovaním pri nedostatku kyslíku. Je toxický a vo vyšších koncentráciách spôsobuje bezvedomie až smrť. Reverzibilne sa viaže na hemoglobín 250x silnejšie ako kyslík, vzniká tak karbonylhemoglobín, ktorý znižuje schopnosť prenosu kyslíka. Pri liečbe sa využíva vyššieho parciálneho tlaku kyslíku, ktorý vytláča CO z karbonylhemoglobínu. Kyanovodík (HCN) a jeho soli, kyanidy (najznámejší je KCN), sú veľmi toxické a sú veľmi rýchlo pôsobiace jedy, ktoré najskôr poškodzujú nervové tkanivo. Kyanidový anión (CN - ) má veľkú afinitu k Fe 3+ a reaguje s Fe 3+ iónmi cytochromoxidázy dýchacieho reťazca v mitochondriách a blokuje tak prenos elektrónov na kyslík. Existuje viacero spôsobov liečby otravy kyanidom. Jeden spôsob liečby spočíva vo zvýšení koncentrácie Fe 3+ v inej zlúčenine ako cytochrómoxidáze, účinná je oxidácia Fe 2+ v hemoglobíne na Fe 3+ methemoglobínu, po ktorej vzniká kyanmethemoglobín. Ďalší spôsob je enzýmovo katalyzovaná premena CN - v mitochondriách za prítomnosti síry na rodanidový anión (SCN - ), ktorý sa rýchlo vylučuje močom. Koncentrácia okamžite využiteľnej síry v tejto reakcií sa zvyšuje intravenóznym podávaním thiosíranu sodného, ktorý sa touto reakciou mení na siričitan sodný. Sulfán (H 2 S) je toxický plyn, ktorý pri vdýchnutí poškodzuje dýchacie cesty a dráždi oči. Vo vyšších koncentráciách spôsobuje bezvedomie a ochrnutie dýchacieho centra. Vstrebáva sa pľúcami a v krvi sa rýchlo oxiduje až na sírany. Väzbou na hemoglobín tvorí sulfhemoglobín, ktorý nie je schopný prenášať kyslík, čo spôsobuje nedostatok kyslíku (hypoxiu). Taktiež spôsobuje inaktiváciu metaloenzýmov, kvôli svojej veľkej afinite ku kovom. I/20. Biologický a metabolický význam stopových prvků Stopové prvky sú významné pre správne fungovanie životných pochodov v stopovom množstve. Medzi stopové prvky môžeme zaradiť Mg, Cr, Co, Mn, Cu, Mo, Se, Zn, ale aj Al, Si, Ni. Väčšina esenciálnych stopových prvkov plní funkciu v metaloenzýmoch alebo metaloproteinoch. Horčík (Mg) sa nachádza v II.A skupine (kovy alkalických zemín), ide o mäkký reaktívny kov. Horečnaté zlúčeniny sa využívajú ako laxatíva (MgSO 4 ) alebo antacida (Mg 3 (PO 4 ) 2 , MgO 2 ), lebo ich roztoky reagujú slabo zásadito. Horečnaté katióny sa do organizmu dopĺňajú najmä pomocou rozpusteného chloridu horečnatého. Viac ako polovica množstva horčíku v organizme je uložená vo forme fosfátov v kostiach, okolo 2% v extracelulárnej tekutine a zvyšok v intracelulárnej tekutine, hlavne vo svaloch. Väčšina horčíku v plazme je ionizovaná na Mg 2+ a časť je viazaná na bielkoviny (hlavne albumín). Horečnatý katión je kofaktorom mnohých enzýmov, hlavne kináz, ktoré využívajú ATP k fosforiláciam. Znižuje nervovosvalovú dráždivosť a podporuje fibrinolýzu. Nezastupiteľnú funkciu má u rastlín ako centrálny ión v molekule chlorofylu. Chróm (Cr) je na vzduchu stály kov, preto sa využíva na ochranu kovových predmetov a tiež k výrobe odolných zliatin na výrobu endoprotéz a chirurgického náradia. V zlúčeninách sa vyskytuje v oxidačnom čísle +3 a +6.Chroman a dichroman draselný sú silné oxidačné činidla, ktorých redukciou vznikajú chromité zlúčeniny. Tento redoxný systém sa prejavuje výraznou zmenou farby príslušných roztokov a to tak, že zlúčeniny s Cr 6+ sú žltooranžové a zlúčeniny s Cr 3+ sú zelené. Chromitý katión zasahuje v organizmu do metabolizmu tukov a sacharidov, pôsobí ako antioxidant a znižuje lipoperoxidáciu. Ovplyvňuje účinok inzulínu a zvyšuje prienik glukózy do buniek. Chrómový katión je pre organizmus naopak toxický a je to silný mutagén a karcinogén a zvyšuje lipoperoxidáciu, lokálne dráždi kožu a v proteínových komplexoch vyvoláva alergické reakcie. Kobalt (Co) je prvkom triády železa, ale je o veľa menej reaktívny ako železo. V jednoduchých zlúčeninách má oxidačné číslo +2 a v komplexoch väčšinou +3. Kobalt je významný ako centrálny ión v komplexe vitamínu B 12 (kyanokobalaminu), ktorý je potrebný pre viaceré metabolické procesy ako napr. krvotvorbu. Mangán (Mn) môže mať v zlúčeninách oxidačné čísla od +1 do +7, no najdôležitejšie sú zlúčeniny s oxidačnými číslami +2,+4 a +7. Manganistan draselný je silné oxidačné činidlo a podľa podmienok reakcie sa jeho katión Mn 7+ redukuje na Mn 4+ alebo Mn 2+ . Vo veľmi malých koncentráciách (asi 1‰) sa využíva ako dezinfekčné (hypermangan) a deodoračné činidlo. Manganatý katión aktivuje enzýmy uplatňujúce sa pri syntéze glykosaminoglykanov a cholesterolu a je súčasťou superoxiddismutázy. Rezorpcia manganatých iónov v tenkom čreve je znižovaná prítomnosťou Fe 2+ . Meď (Cu) je kov načervenalej farby, v zlúčeninách môže mať oxidačné číslo +1 alebo +2. Meďnaté zlúčeniny sa používajú v prípravkoch na ochranu rastlín. Meďnatý katión tvorí veľmi dobre rozpustné komplexné zlúčeniny, ktoré sa využívajú ako oxidačné činidlá pri dôkazoch látok schopných oxidácie (napr. glukózy). Meď z potravy sa rezorbuje v čreve, viaže sa na albumín a v hepare je zabudovaná do bielkoviny ceruloplazmínu a jeho prostredníctvom sa dostáva do tkanív. Meďnaté katióny sú dôležitou súčasťou metaloenzýmov, ktoré pôsobia antioxidačne (napr. superoxiddismutasy) alebo sú významné v metabolizme katecholaminov (tyrosináza, dopamin-β-hydroxyláza) a metabolizme pojiva. Redoxné vlastnosti medi využívajú enzýmy dýchacieho reťazca. Katión Cu 2+ môže byť redukovaný na Cu + a zúčastniť sa podobne ako Fe 3+ Fentonovej reakcie a tým aj tvorby reaktívneho hydroxylového radikálu. Molybden (Mo) je dôležitý pri syntéze kyseliny močovej, kde sa nachádza v enzýme xanthinoxidáza, ktorý katalyzuje odbúravanie purínových báz. V dôsledku nedostatku molybdenu sa znižuje tvorba kyseliny močovej a zvyšuje koncentrácia xanthínu, ktorý je jej prekurzorom. Molybden sa vstrebáva vo forme molybdenanového aniónu a bežný prísun potravou pokrýva jeho spotrebu. Selén (Se) patrí medzi chalkogény (6.A skupina) a má podobné vlastnosti ako síra. Vstrebáva sa v tenkom čreve viazaný v aminokyselinách selenocysteínu a selenomethioninu Selenocystein sa zabudovává do bielkovín a má svoj špecifický triplet v DNA (UCA) a svoju transferovú RNA. Selén tvorí súčasť antioxydačných metaloenzýmov ako napr. glutathionperoxidáza, ktorá katalyzuje štiepenie peroxidu vodíka a iných hydroperoxydov. Nedostatok selénu zvyšuje riziko kancerogenézy, porúch funkcie štítnej žľazy a rozvoj aterosklerózy. Akútna otrava selénom sa prejaví nadmerným vylučovaním dimetylselénu dychom a potom (zápach po cesnaku). Zinok (Zn) je nepostradateľný pre rast rastlín a vývoj živočíchov, ale pri vyšších koncentráciách je životu nebezoečný. Zinkový prach a pary chloridu zinočnatého poškodzujú hlavne dýchací systém a biele krvinky. Akútna otrava zinkom sa prejaví zvracaním a hnačkou. Zvýšený príjem zinku znižuje resorpciu medi a vedie k jej nedostatku, toto platí aj naopak. Zinočnatý katión sa vstrebáva v tenkom čreve a viaže sa na albumín. Množstvo vstrebaného Zn 2+ znižuje okrem resorpcie medi aj resorpciu kademnatých, olovnatých a ortuťnatých iónov. Zinočnatý katión je súčasťou mnohých enzýmov, je potrebný pre bunkovú imunitu a delenie buniek, je nevyhnutný pre tvorbu väziva, hojenie rán a spermatogenézu. Ako súčasť molekuly inzulínu podporuje vstup glukózy do buniek. Hliník (Au) sa uplatňuje v priemysle, letectve, stavebníctve, ale aj výrobe predmetov bežnej spotreby. Kumulácia hlinitých iónov v povrchových a spodných vodách a následne aj v potravinách sa stáva problémom. Je uvoľňovaný z hornín pôsobením kyslých dažďov. Podobne sa uvoľňuje z hliníkového riadu do kyslých jedál. Organizmus tiež prijíma veľké množstvo hlinitých iónov vdychovaním. Do súvislosti s Al 3+ sú dávané zmeny bielkovín v neurónoch, poruchy nervového vzruchu a inhibícia určitých enzýmov (napr. cholinesterázy) a sú typické pre vznik a priebeh Alzheimerovej choroby. Hlinité zlúčeniny ako hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý alebo hydroxyhlinitan horečnatý sa používajú v medicíne ako antacida pre svoj slabo zásaditý charakter. Kremík (Si) má vplyv na vývoj kostí. Jeho najrozšírenejšími zlúčeninami sú oxid kremičitý a kremičitany. Ich prach znečisťuje ovzdušie a pri vdychovaní môže dôjsť k chronickému ochoreniu pľúc silikóze. Hydratovaný kremičitan horečnatý (tzv. azbest) má karcinogénne účinky a preto je jeho používanie zakázané. Nikel (Ni) sa používa v zliatinách na výrobu mincí a batérii. Kožný kontakt vyvoláva alergické zápalové reakcie kože. Zvýšený prísun nikelnatých zlúčenín v potrave tieto prejavy ešte prehĺbi. Karcinogénne účinky majú predovšetkým oxidy a sulfidy nikelnaté a výpary tetrakarbonylniklu (Ni(CO) 4 ). Nepolárna molekula Ni(CO) 4 preniká membránami a v plazme sa viaže na albumín. Nikel zasahuje v organizme do metabolizmu glukózy. I/21. Struktura organických sloučenin, izomerie, příklady z metabolických drah Základnou skupinou organických zlúčenín, od ktorej sa odvodzujú všetky ďalšie organické zlúčeniny sa nazývajú uhľovodíky. Ide o obrovskú skupinu látok, ktoré pozostávajú z atómov uhlíka a vodíka pospájaných rôznymi spôsobmi v rôznom počte a pomere. Uhľovodíky sa navzájom líšia predovšetkým druhom reťazca (acyklický, cyklický, rozvetvený, nerozvetvený) a druhom väzieb (nasýtené, nenasýtené, aromatické). Deriváty uhľovodíkov vznikajú substitúciou vodíkov v reťazci iným atómom alebo funkčnou skupinou. Uhľovodíkový reťazec ovplyvňuje chovanie funkčnej skupiny v deriváte a naopak. Najviac ovplyvnené sú skupiny na aromatickom cykle. Vlastnosti organickej molekuly ovplyvňuje aj jej tvar. Tvar molekuly ovplyvňuje polaritu, fyzikálne vlastnosti, reaktivitu a dokonca aj biologickú aktivitu. Izoméry sú molekuly, ktoré majú rovnaký sumárny vzorec (rovnaké atómy v rovnakom počte), ale líšia sa od seba štruktúrne. Ak sa dve izoméry od seba líšia spôsobom usporiadania (spojenia) atómov v molekule, ide o konštitučné izoméry (kyselina citrónová a izocitrónová). Ak sa atómy líšia priestorovým usporiadaním substituentov vzhľadom k väzbe alebo ak je izoméria viazaná na prítomnosť chirálneho centra v molekule, hovoríme o stereoizoméroch. Ak sa stereoizoméry navzájom chovajú ako predmet a obraz v zrkadle, ide o enetioméry. Konštitučné izoméry rozdeľujeme na polohové, reťazové, skupinové a tautoméry. Polohové izoméry sa navzájom líšia polohou substituentu alebo dvojitej väzby. Reťazové izoméry majú rôznu stavbu alebo vetvenie bočného reťazca alebo rovnakú funkčnú skupinu. Skupinové izoméry sa navzájom líšia svojou funkčnou skupinou, majú medzi sebou najväčšie rozdiely fyzikálno-chemických vlastností (aldehydy a étery). Tautoméry sa navzájom líšia polohou dvojitej väzby a atómu vodíka, rozoznávame oxo-enol formu (vzhľadom ku skupinám kyslíku; -OH ↔ =O), ďalej laktám-laktím, amid-imín, amín-imín formy (vzhľadom ku skupinám dusíku). Tautomérne formy sú navzájom v dynamickom ekvilíbriu, tj. že medzi sebou plynule prechádzajú, takže ide o totožné látky. Cis-trans izoméry (E/Z) vznikajú na dvojitej väzbe. Substiuenty na dvojitej väzbe nemôžu voľne rotovať a nastávajú tak dve možné orientácie skupín okolo dvojitej väzby. Ak dve funkčné skupiny ležia voči sebe na rôznych stranách dvojitej väzby, nazývame to polohou trans- alebo E-. Ak sú však viazané na jednej strane dvojitej väzby, ide o polohu cis- alebo Z-. Napr. v kyseline fumárovej ležia karboxylové skupiny v polohe trans- a v jej izmoére – kyseline maleínovej ležia skupiny v polohe cis-. Cis-trans (geometické) izoméry sa od seba líšia predovšetkým v svojich chemických a fyzikálnych vlastnostiach, ako napr. bode varu alebo hodnotách pK A . Ich vzájomná premena je možná iba prostredníctvom chemických reakcií. Veľmi významná je cis-trans izoméria v metabolizme lipidov. Prirodzene vyskytujúce sa mastné kyseliny obsahujú v svojej molekule dvojité väzby v konformácií cis-, zatiaľ, čo medziprodukty β- oxidácie obsahujú dvojité väzby iba v polohe trans-. Konforméry sú izoméry, ktoré vznikajú rotáciou okolo väzieb umožňujúcich voľnú rotáciu (napr. jednoduché väzby C-C). Aj malé molekuly môžu v roztokoch nadobúdať rôzne konformácie. Konforméry kyseliny jantárovej majú podobné usporiadanie atómov ako kyselina fumárová a maleiínová. V roztoku sa nachádzajú rôzne konformácie jednej látky, pričom najčastejšie sa vyskytujú analógie trans-izomérov (funkčné skupiny na rôznych stranách), lebo sú výhodnejšie. Uzavretím organickej molekuly do cyklickej formy sa naruší voľná rotácia okolo väzby a nastáva kruhové pnutie. U týchto zlúčenín dochádza k rôznym priestorovým konformáciám cyklov (napr. cyklohexán má formy vaničkovú, twist a židličkovú formu). Biologicky aktívne makromolekuly bielkovín a nukleových kyselín obsahujú tisíce voľne otáčajúcich sa väzieb a preto môžu zaujímať obrovské množstvo rôznych konformérov. Aj tak ich však nachádzame spravidla v jedenej dobre definovanej (natívnej) konformácií, ktorá je stabilizovaná interakciami vo vnútri molekuly. Ak dôjde ku strate natívnej konformácie počas denaturácie, zmení sa aj biologická aktivita moleukuly. Ďalší typ izomérie nastáva, ak obsahuje molekula chirálne centrum alebo je celá chirálna. Chiralita vedie k tomu, že sa látky navzájom chovajú ako predmet a jeho obraz v zrkadle a nedajú sa natočiť tak, aby boli zhodné (zrkadlové alebo optické izoméry). Hlavnou príčinou chirality je existencia asymetrického atómu uhlíka (nasýtený atóm uhlíku, ktorý má na sebe naviazané štyri rôzne substituenty). Zlúčenina tak môže existovať v dvoch podobách (enantioméroch) s rôznou konfiguráciou. Enantioméry sa väčšinou označujú ako L a D (prípadne R a S). Zmes oboch enantiomérov v pomere 50:50 sa nazýva racemická zmes (racemát). K zakresleniu chirálneho centra vo vzorci sa používajú tzv. Fisherové projekcie. Enentioméry majú veľmi podobné chemické vlastnosti a chemickými metodámi sa dajú ťažko rozlíšiť. K ich rozlíšeniu sa využíva fakt, že enantioméry stáčajú rovinu polarizovaného svetla rôznym smerom – optická aktivita. Pravotočivý enantiomér kyseliny mliečnej – kyselina L-mliečna sa nachádza v svaloch a krvi živočíchov, zatiaľ čo ľavotočivá kyselina D-mliečná je tvorená mikroorganizmami a nájdeme ju napr. v mliečných výrobkoch. Rôzne enantioméry môžu mať rôzne biologické účinky. Napr. racemát ibuprofénu má neskorší nástup účinku ako R-ibuprofén; rôzne enantioméry talidomidu majú účinky buď ako liek proti nevoľnosti alebo ako teratogén; enantiomér ketamínu je anestetikum a druhá forma je halucinogénna. Rôzne enantioméry voňavých látok môžu mať rôznu vôňu. I/22. Halogen- a nitroderiváty uhlovodíků, příklady toxikologicky a lékařsky významných sloučenin Halogénderiváty vznikajú nahradením jedného alebo viac vodíkov halogénom v uhľovodíkovom reťazci. Sú väčšinou veľmi reaktívne, vďaka polarite väzby, a sú často priemyslovo využívané. Ide o skoro bezfarbé látky, nerozpustné vo vode, ale rozpustné v alkoholoch a éteroch, najnižšie členy homologického radu sú plyny. V reakciách sa uplatňuje heterolytické štiepenie väzby uhlíku s halogénom a reaktivita halogénderivátov stúpa smerom od fluóru k jódu (stúpa polarizovateľnosť halogénu). Aromatické deriváty nie sú tak reaktívne, lebo polarizovateľnosť väzby halogénu na aromatickom jadre je nižšia. V organizme sa prirodzene vyskytujú len zriedka, napr. jódové deriváty tyrozínu fungujú ako hormóny štítnej žľazy. Určité lipofilné halogénderiváty s rôznym počtom a druhom naviazaných halogénov, obmedzenou reaktivitou a bez nežiadúceho účinku na štítnu žľazu sa ako narkotiká. Stabilizujúce účinky majú väčšinou naviazané atómy fluóru, ktoré sú tiež najmenej toxické (napr. halotan-1,1,1-trifluor-2-brom-2-chloretan). V minulosti bol ako narkotikum používaný chloroform (CHCl 3 ), ktorý sa už kvôli toxicite nepoužíva. Chloramfenikol je antibiotikum so širokým spektrom účinku, je ľahko dostupný a je základom celej rady ďalších farmakologicky účinných derivátov. Veľká časť halogénderivátov je toxická, ale sú stále využívané v rôznych odboroch (napr. rozpúšťadla, insekticídy, etc.) Medzi halogénderiváty patria tiež nebezpečné polychlórované bifenyly (PCB) a veľmi toxické polychlórované dibenzodioxíny (PCDD). Väčšina zlúčenín odvodených od dioxínu sú veľkou záťažou pre životné prostredie, lebo sú stále, majú dlhý polčas rozpadu (asi 10 rokov) a ťažko sa likvidujú (spaľovanie pri teplotách nad 750°C). Zdravotné komplikácie spôsobuje už i malé množstvo týchto látok. Do tela prenikajú vdychovaním, priamym kontaktom a kontaminovanou potravou. Sú málo rozpustné vo vode, ale dobre rozpustné v tukoch, čo umožňuje ich vstrebávanie a ukladanie v organizme. Najtoxickejším zástupcom skupiny dioxínov je 2,3,6,7-tetrachlír-dibenzodioxín (TCDD, vzorec vedľa). Vzniká nedodržaním správnej výrobnej teploty pri výrobe herbicídov z trichlorfenolátu sodného. Nitroderiváty vznikajú nahradením jedného alebo viac vodíkov nitroskupinou (-NO 2 ) na uhľovodíkovom reťazci. Vznikajú reakciou alifatických uhľovodíkov so zriedenou kyselinou dusičnou alebo nitráciou aromatických uhľovodíkov pomocou nitračnej zmesi. Tieto látky sú toxické, majú žltú farbu, nepríjemný zápach a sú nerozpustné vo vode. V prírode sa až na vzácne výnimky nevyskytujú. Nitrobenzén je základná zlúčenina pre syntézu anilínu a iných derivátov, ktoré z neho redukciou vznikajú. Produkt redukcie nitrobenzénu závisí od pH prostredia. Pri kyslom pH vzniká anilín, pri zásaditom pH vzniká fenylhydroxamin a pri neutrálnom pH vzniká najprv nitrosobenzén, ďalej azobenzén až nakoniec vznikne hydrazobenzén. Nitráciou toluénu vzniká 2,4,6,-trinitrotoluen, ktorý sa využíva ako výbušnina, ktorá sa označuje ako tritol alebo TNT. Podobná zlúčenina, 2,4,6-trinitrofenol alebo kyselina pikrová (TNP) a jej soli sa využívajú tiež ako trhaviny, no má aj význam v špeciálnych histologických technikách. Nitroglycerín je trojnásobný ester glycerolu a kyseliny dusičnej, je hlavnou zložkou dynamitu, je značne toxický už v malom množstve, ale tiež pôsobí ako vazodilatátor a preto sa požíva ako liek na srdcové problémy (napr. arytmie, angina pectoris, zástava srdca,...). Trichlornitrometán alebo tiež chlórpikrín sa používal ako bojová zbraň. I/23. Sirné deriváty uhlovodíků, příklady lékařsky významných sloučenin Sírne deriváty sú látky, kde je na miesto vodíka v uhľovodíkovom reťazci naviazaná síra. Síra vytvára podobné deriváty ako kyslík, ale je v nich menej elektronegatívna. Patria sem thioly s funkčnou skupinou –SH, ktoré sú obdobou alkoholov a fenolov, sulfidy (R-S-R) ako obdoba éterov, disulfidy (R-S-S-R) ako obdoba peroxidov a sulfonové kyseliny (-SO 3 H). Thioly, alebo tiež thioalkoholy a thiofenoly, sú silnejšie kyseliny ako alkoholy a fenoly, majú nepríjemný zápach. Vytvárajú soli (thioláty) s alkalickými, ale aj ťažkými kovmi. Využíva sa to pri liečbe otráv ťažkými kovmi (napr. 2,3- dithiopropanol, reakcia nižšie). Nevýhodou je, že thiolové zlúčeniny vedia tieto soli vytvárať aj s napr. bielkovinami, ktoré sú pre organizmus dôležité a tým obmedzuje ich funkciu. Thioly sa nachádzajú aj črevných plynoch, kde vznikajú mikrobiálnym rozkladom bielkovín, ktoré obsahujú sírne aminokyseliny. CH 2 -OH CH 2 -OH CH-SH + Hg 2+ → CH-S +2H + Hg CH 2 -SH CH 2 -S Disulfidy vznikajú dehydrogenáciou dvoch molekúl thiolov. Táto redoxná reakcia je vratná a dôležitá pre štruktúru bielkovín, vznikajú takto pevné disulfidové mostíky (-S-S-) vo vnútri jednej alebo viacerých molekúl peptidov. Rovnakým spôsobom sa prejavuje toxicita oxidačných činidiel. Sulfidy alebo thioétery majú menej nepríjemný zápach ako thioly. Technologicky významné sú dimetylsulfid, ktorý vzniká ako odpad pri výrobe celulózy alebo bis(2-chloretylsulfid), takzvaný yperit, ktorý sa používal ako bojová látka v 1. Sv. vojne. Ide o olejovitú látku nerozpustnú vo vode, zapáchajúca po horčici, ktorá spôsobuje začervenanie, podráždenie až nekrózy na koži. Biologicky významným sulfidom je aminokyselina methionín, ktorý je súčasťou prakticky všetkých bielkovín. Sulfonové kyseliny sú konečným produktom oxidácie thiolov, aromatické vznikajú sulfonáciou. Sú to kryštalické látky, dobre rozpustné vo vode, väčsinou hygroskopické a sú silnými kyselinami skoro ako H 2 SO 4 . Využívajú sa pri príprave antibakteriálnych látok, sulfonamidov (skupina –SO 2 NH 2 ), ktoré sa odvádzajú od kyseliny 4-aminobenzensulfonovej (sulfanilovej). Ide o antagonistu prekurzoru kysliny listovej(PABA), ktorý ho vytesňuje z enzýmov a tým zabraňuje syntéze kyseline listovej a rastu baktérii. Organizmus ďalej využíva taurín (kyselinu 2-aminoethanslufonovú) ako súčasť konjugovaných žlčových kyselín. Taurín (N 2 H-CH 2 -CH 2 -SO 3 H) vzniká oxydáciou a dekarboxyláciou cystínu. I/24. Aminy, význam v biochemii Amíny sú biologicky najvýznamnejšie dusíkaté deriváty uhľovodíkov. V svojej molekule môžu viazať rôzny počet aminoskupín, ale väčšinou jenu až dve. Amíny môžeme podľa počtu uhľovodíkových zvyškov viazaných na dusíkový atóm deliť na primárne (R-NH 2 aminoskupina), sekundárne (R 2 -NH iminoskupina) a terciárne (R 3 -N). Chemické vlastnosti amínov sú podmienené hlavne voľný elektrónový pár na dusíku, ktorý podmieňuje bázické vlastnosti a môže sa na neho naviazať ďalší uhľovodíkový zvyšok a vznikne tetraalkylamónny alebo tetraarylamónny katión ako napr. v molekule acetylcholínu (vzorec vedľa). Vďaka aminoskupine sú molekuly polárne a rozpustné vo vode, s kyselinami reagujú amíny na amóniové soli (schéma nižšie). Reakcia s kys. dusitou majú rôzne produkty podľa typu amínu, dôležitá je reakcia so sekundárnymi amínmi za vzniku nitrosamínov, ktoré sú karcinogénne a mutagénne. Primárne amíny reagujú s aromatickými aldehydmi za vzniku imínov (Schiffové bázy). Táto reakcia je dôležitá pri prenose aminoskupiny v organizme (transaminácia a deaminácia; schéma nižšie). Primárna aminoskupina sa nachádza v skoro všetkých kódovaných aminokyselinách (okrem prolínu, kde sa nachádza iminoskupina). Dekarboxyláciou týchto aminokyselín vznikajú rôzne amíny, niektoré sú označované ako biogénne amíny, ktoré sú pre organizmus nezastupiteľné (napr. z tyrozínu vzniká tyramin, z ktorého vznikajú ďalšie amíny ako dopamín, adrenalín, noradrenalín). Amíny sú najdôležitejšie organické zásady so silným fyziologickým účinkom. Niektoré biogénne amíny (histamín z histidínu a serotonín z triptofánu) sú súčasťou jedu včiel, os a sršní, ktorých bodnutie spôsobuje človeku bolestivú reakciu. V zložených lipidoch majú funkciu polárnej časti molekuly niektoré hydroxyamíny ako napr. ethanolamin (kolamin) alebo cholin (kvartérna amóniová zlúčenina). Ester cholínu a kyseliny octovej (acetylcholín) je dôležitý neurotransmiter. Rozkladom bielkovín a nasledovnou dekarboxiláciou vznikajú z ornitínu a lyzínu diamíny putrescin H 2 N-(CH 2 ) 4 -NH 2 a kadaverin H 2 N-(CH 2 ) 5 -NH 2 , ktoré podmieňujú zápach rozkladajúceho sa mäsa. I/25. Alkoholy, fenoly, aldehydy a ketony, uplatnění v metabolismu. Látky používané jako dezinfekční prostředky, mechanismus jejich účinku. Hydroxyderiváty sú veľmi rozšírené v prírode. Ak je hydroxylová skupiny naviazaná na uhlík alifatického alebo alicyklického uhľovodíku, ide o alkohol. Ak je však naviazaná priamo na aromatické jadro, jedná sa o fenol. V jednej zlúčenine môže byť rôzny počet hydroxylových skupín na rôznych uhlíkoch. Alkoholy s hydroxylovou skupinou naviazanou na uhlík dvojitej (enoly) alebo trojitej väzby sú nestále. Hydroxyskupina spôsobuje polaritu derivátu. Rozdiely elektronegativít medzi uhlíkom, kyslíkom a vodíkom umožňuje posun elektrónov a tým aj polarizáciu väzieb, preto vodík hydroxylovej skupiny môže tvoriť vodíkové mostíky s elektronegatívnejšími atómami kyslíku a dusíku. Alkoholy aj fenoly sú slabé kyseliny a sú schopné tvoriť soli. Alkoholy sú podľa počtu hydroxylových skupín jednofunkčné alebo viacfunkčné. Podľa substúcie na uhlíku, na ktorý je viazaná hydroxyskupina sa rozdeľujú na primárne, sekundárne alebo terciárne alkoholy. Dehydratáciou (odštiepením molekuly vody) jednej molekuly alkoholu vznikajú nenasýtené alkoholy, dehydratáciou dvoch molekúl vznikajú étery. Najdôležitejšou reakciou alkoholov je oxidácia (dehydrogenácia). Primárne alkoholy sa oxidujú na aldehyd, sekundárne na ketóny a terciárne nepodliehajú oxidácií. V organizme sú oxidácie alkoholov katalyzované dehydrogenázami. Ďalšou biochemicky významnou reakciou alkoholov je esterifikácia. Reakciou alkohov s anorganickými alebo organickými kyselinami vznikajú estery a voda. Esterifikácia je vratná reakcia a v opačnom smere beží hydrolýza esteru za vzniku alkoholu a kyseliny. CH 3 -CH 2 -NH 2 + HCl → CH 3 -CH 2 -N + H 3 Cl - etylamín kys.chlorovodíková etylamóniumchlorid Metanol (CH3-OH) je najjednoduchší primárny alkohol a pre organizmus je toxický. K otravám dochádza väčšinou pri zámenách za etanol. Metabolity jeho odbúravania poškodzujú najmä zrakový aparát, môžu spôsobiť úplnú slepotu až smrť. Ako antidotum sa používa etanol, ktorého metabolizmus je podobný metabolizmu metanolu. Spomaľuje oxidáciu metanolu a znižuje tak koncentrácie toxických produktov (formaldehydu a kyseliny mravčej). Etanol (CH 3 -CH 2 -OH) je významné rozpúšťalo, miesiace sa neobmedzene s vodou a aj väčšinou organických rozpúšťadiel. Jeho oxidáciou vzniká acetaldehyd. Bežne sa pripravuje etanolovým kvasením cukrov a je obsiahnutý v rôznych množstvách v alkoholických nápojoch. Má excitačné až narkotické účinky, väčšie množstvo poškodzuje pečeň a nervový systém, otrava končí až smrťou. Etylénglyol (etán-1,2-diol; OH-CH 2 -CH 2 -OH) patrí medzi alkoholy s dvoma hydroxyskupinami. Využíva sa ako rozpúšťadlo a ako súčasť nemrznúcich zmesí. Má tlmivý účinok na CNS, poškodzuje ľadviny, lebo produktom jeho metabolizmu je toxická kyselina šťaveľová. K otravám dochádza pri zámene za etanol. Glycerol (propán-1,2,3-triol) je najjednoduchší alkohol s tromi hydroxyskupinami. Je základom mnohých biologicky významných zlúčenín. Jeho čiastočnou oxidáciou vzniká glyceraldehyd alebo dihydroxyacetón, dehydratáciou (napr. prepaľovanie tukov) vzniká nenasýtený alkohol akroleín. Úplne esterifikovaný glycerol kyselinou dusičnou (1,2,3- trinitroglycerol; glycerol-trinitrát; nitroglycerol) je významný ako liek na srdcové ochorenia, vo vyšších dávkach je však toxický. Prudkým zahriatím môže explodovať, upravený sa používa ako dynamit. Z viacfunkčných alkoholov sú dôležité najmä cyklické alkoholy, ktoré vznikli redukciou monosacharidov (napr. inozitoly). Sfingozín (sfingenín) je biochemicky významný alkohol s nenasýteným reťazcom . Ide o aminodiol, ktorý v molekule obsahuje jednu primárnu a jednu sekundárnu hydroxylovú skupinu. Je základom skupiny lipidov, v ktorej je mastná kyselina viazaná na aminoskupinu amidovou väzbou a na primárnu hydroxyskupinu sa väčšinou viaže glykozidovou väzbou sacharidová zložka alebo je táto skupina esterifikovaná kyselinou fosforečnou. Fenoly majú hydroxylovú skupinu naviazanú priamo na uhlík aromatického cyklu. Majú vlastnosti podobné alkoholom. Vďaka vplyvu aromatického jadra na hydroxylovú skupinu sú fenoly silnejšími kyselinami ako alkoholy a voda. Ak je na aromatické jadro ešte naviazaná silno elektronegatívna funkčná skupina odťahujúca elektróny, kyslosť fenolu narastá (napr. trinitrofenol alebo kyselina pikrová). Fenolovú hydroxyskupinu obsahujú viacera biologicky významné látky, ako napr. aminokyselina tyrozín, hormóny tyroxín a estradiol, kyselina salicylová, etc. Hydroxybenzén je najjednoduchší fenol, je toxický a má silné leptavé účinky (už v koncentráciách nad 1%; v koncentráciách nad 10% spôsobuje ťažké nekrózy). K celkovej otrave môže dôjsť pri poliatí veľkej časti tela alebo inhaláciou pár. Má baktericídne účinky, ale pre svoje nebezpečné vlastnosti sa už nevyužíva v dezinfekčných prostriedkoch. Krezoly sú polohové izoméry hydroxytoluénu a majú významné baktericídne účinky, ktoré sa využívajú v dezinfekčných prostriedkoch. Dvojfunkčné fenoly vytvárajú polohové izoméry, ktoré sa líšia vzájomnou polohou hydroxylových skupín. 1,2 a 1,4-dihydroxybenzény sa ľahko oxidujú na chinóny, ktoré sa dajú redukciou ľahko previesť naspäť na príslušné benzéndioly. Tento redoxný systém má veľký význam pri biologických oxidáciach (napr. koenzým Q má chinoidnú štruktúru 1,4- benzochinónu) . Étery majú na obe valenčné miesta naviazaný uhľovodíkový zvyšok (R-O- R).Významné sú étery s krátkymi reťazcami alebo cyklické étery. Pretože ich molekuly nevytvárajú medzi sebou vodíkové mostíky, ide o celkom prchavé látky s nízkymi teplotami varu. Pri práci s nimi je potrebné byť veľmi opatrný, lebo ich pary prudko horia. Na vzduchu a na svetle vytvárajú výbušné peroxidy. Sú v podstate nepolárne a využívajú sa ako dobré nepolárne rozpúšťadlá. Dietyléter (H 5 C 2 -O-C 2 H 5 ) je výborné nepolárne rozpúšťadlo a narkotickými účinkami. Využíva sa v kombinácií s inými látkami ako inhalačné anestetikum pre celkové narkózy. Éter určený pre narkózy sa musí dôkladne skladovať v tmavých fľašiach bez prístupu kyslíku a musí byť stabilizovaný proti vzniku peroxidov. Karbonylové zlúčeniny obsahujú v svojej molekule dvojväzbovú karbonylovú skupinu (=O). Ak je k tejto väzbe naviazaný jeden vodík a jeden uhľovodíkový zvyšok, ide o aldehyd, naviazaním dvoch uhľovodíkových zvyškov vzniká ketón. Aldehydová skupina sa teda môže vyskytovať iba na konci reťazca, ketónová skupina sa však môže viazať iba do vnútra reťazca. Chemické vlastnosti karbonylových zlúčenín sú výrazne ovplyvnené prítomnosťou polárnej karbonylovej skupiny. Elektróny na karbonylovej skupine sú posunuté bližšie k elektronegatívnejšiemu kyslíku a tak na uhlíku vzniká čiastkový kladný náboj. Toto rozloženie elektrónov spôsobuje značnú reaktivitu karbonylovej skupiny a umožňuje viazať vodík (slúži ako akceptor) vo vodíkových väzbách. Pri reakciách karbonylových zlúčenín s alkoholmi vznikajú polacetály (hemiacetály), ktoré sa v nadbytku alkoholu za odštiepenia vody môžu meniť na acetály. Vznik polacetálu môže prebehnúť aj vo vnútri jednej molekuly (napr. vnútorné poloacetály monosacharidov s veľmi reaktívnym poloacetálovým hydroxylom). Táto poloacetálová hydroxyskupina môže reagovať s ďalším hydroxylom za vzniku O-glykozidovej (acetál) väzby alebo s aminoskupinou za vzniku N-glykozidovej väzby. Aldehydy môžeme zaradiť medzi redukčné činidla. Pri reakcií sa sami ľahko oxidujú na karboxylové kyseliny. Aldehydy je možné aj redukovať na príslušný primárny alkohol, aldehydy majú teda oxidačné aj redukčné vlastnosti. Aromatické aldehydy reagujú sa primárnymi amínmi za vzniku imínu (Schiffovej bázy). Táto reakcia je významná pri prenose aminoskupiny v organizme (transaminácia a deaminácia). Formaldehyd (metanal, HCOH) má malú molekulu a preto nemôže tvoriť vodíkové mostíky. Ide o plyn dobre rozpustný vo vode. Používa sa k dezinfekciám, fixovaniu tkanív, výrobe anatomických preparátov, ale aj ako surovina pri výrobe plášťou, živíc a lepidiel. Dráždi nosnú sliznicu, horné dýchacie cesty a oči. Po inhalácií pľúcami sa vstrebáva a prevažne sa oxiduje na kyselinu mravčiu, ktorá v organizme spôsobuje ťažkú acidózu. Pre organizmus je toxický voľný formaldehyd, viazaný, najčastejšie na kyselinu tetrahydrolistovú sa účastní prenosu jednouhlíkatých zvyškov pri biochemicky významných syntézach. Malondialdehyd (HOCCH 2 COH) poškodzuje primárnu štruktúru bielkovín. Zo svojou malou molekulou a dvomi aldehydovými skupinami sa môže viazať na aminokyseliny bielkovín (najmä na lyzín) a spôsobovať tak ich zasieťovanie priečnymi väzbami. V organizme vzniká ako produkt oxidatívneho poškodenia polenových mastných kyselín voľnými radikálmi (proces popísaný v otázke I/15). Je často stanovovaný ako ukazovateľ peroxidácie lipidov v organizme. Ketóny sa môžu redukovať na sekundárne alkoholy, ale na rozdiel od aldehydov sa nemôžu oxidovať (nemajú redukčné vlastnosti), oxidácia nie je možná bez štiepenia reťazca. Acetón (propán-2-ón, CH 3 COCH 3 ) je najjednoduchší ketón s veľkým biologickým významom. V organizme vzniká spontánnou dekarboxyláciou kyseliny acetoctovej (CH 3 COCH 2 COOH). Pri poruche metabolizmu (diabetes mellitus, hladovanie) vzniká v organizme vo väčšej miere, vylučuje sa močom a pľúcami (je ho cítiť v dychu). Acetón je dôležité rozpúšťadlo (napr. náterových hmôt – odlakovač). Zmes jeho pár so vzduchom ľahko horí a vybuchuje. Dezinfekčné prostriedky sú schopné usmrcovať mikroorganizmy a teda sa požívajú k dezinfekcií. Ich účinok je málo selektívny a väčšinou okrem toxického účinku na mikroorganizmy, poškodzujú často aj bunky hostiteľského organizmu. Rozlišujeme dezinficiencia, ktoré sa používajú v neživom prostredí a antiseptika, ktoré sa používajú lokálne, napr. na povrchu tkaniva. Dezinfekčné činidlá majú obmedzené spektrum účinnosti a ich účinnosť závisí na koncentrácií, dobe expozície, teplote, etc. Alkoholy dezinfekčne pôsobia predovšetkým porušením bunkovej membrány baktérií a denaturáciou bielkovín. Etanol pôsobí antibakteriálne pri koncentrácií 60-70%, v nižších a vyšších koncentráciách je menej účinný. Na povrchovú dezinfekciu pokožky sa používa tiež 70% izopropanol. Fenoly majú silné denaturačné účinky a používali na dezinfekcie povrchu, dnes sa využívajú ich deriváty (hlavne chlórne). Aldehydy sa rýchlo viažu na bielkoviny (za vzniku Schiffových bázy) a denaturujú ich, účinný je najmä formaldehyd a glutaraldehyd. Veľa dezinfekčných prostriedkov funguje na základe oxidačného pôsobenia ich zložiek, ktoré poškodzujú bunkové membrány, proteíny a nukleové kyseliny baktérií. Peroxid vodíka vo forme 3% roztoku uvoľňuje pri kontakte s tkanivom elementárny kyslík, ktorý má silné dezinfekčné účinky. Taktiež silné antiseptické účinky má aj manganistan draselný, kyselina peroxyoctová, jód a chlór a jeho zlúčeniny. Tenzidy majú detergančné vlastnosti, ktoré odstraňujú z povrchu nečistoty, vrátane baktérií. Rozdeľujeme ich na aniónové aktívne tenzidy (napr. mydlá), ktoré majú slabý dezinfekčný účinok a katiónové aktívne tenzidy, ktoré majú veľký dezinfekčný účinok v podobe permeabilizácie bakteriálnej membrány (napr. kvartérne amóniové soli). Ďalej antibakteriálne pôsobia, najmä denaturovaním bielkovín, aj ťažké kovy (ortuť, striebro) a kyseliny (boritá, salicylová, etc.). I/26. Karboxylové kyseliny, funkční a substituční deriváty karboxylových kyselin, uplatnění v biochemii Karboxylové kyseliny sú dôležitá skupina organických látok so zásadným biochemickým významom. V prírode sa väčšinou nachádzajú vo forme solí a iných derivátov, iba malá časť sa vyskytuje vo forme voľných kyselín. Typické pre karboxylové kyseliny je, že v svojej molekule obsahujú jednu alebo viac jednoväzbových karboxylových skupín –COOH, ktorá je umiestnená na konci uhlíkového reťazca. Väčší počet karboxylových skupín v molekule zvyšuje rozpustnosť kyseliny vo vode v dôsledku tvorby intermolekulárnych vodíkových mostíkov karboxylových kyslín s molekulami vody. Naopak vyššie karboxylové kyseliny s dlhým reťazcom (napr. vyššie mastné kyseliny) sú vo vode nerozpustné v dôsledku hydrofóbnosti dlhého uhľovodíkového reťazca. Silná polarita karboxylovej skupiny umožňuje jednak tvorbu vodíkových mostíkov a za druhé dovoľuje v polárnych rozpúšťadlách odštiepovať H + . Karboxylové kyseliny sú pomerne slabé kyseliny a teda sa dajú uvoľniť z ich solí pôsobením silných kyselín. Na disociáciu karboxylovej kyseliny má vplyv uhľovodíkový reťazec a jeho ďalšie substitúcie. Za určitých podmienok môžu karboxylové kyseliny podliehať dekarboxylácií, čo je v metabolizme využívaný jednoduchý spôsob skracovania uhlíkového reťazca o jeden uhlík (odštiepenie CO 2 z molekuly, rovnica vedľa). Ide napr. o spontánna dekarboxylácia kyseliny acetoctovej za vzniku acetónu a CO 2 , dekarboxylácia aspartátu za vzniku β-alanínu, dekarboxylácia pri premenách aminokyselín na biogénne amíny, deje v Krebsovom cykle,.. Karboxylové kyseliny môžu vznikať oxidáciou aldehydov, alebo úplnou oxidáciou primárnych alkoholov. Pri neutralizácií tvoria soli, sodné a draselné soli sú rozpustné, no vápenaté soli sú väčšinou nerozpustné. Substitúciou na karboxylovej skupine vznikajú funkčné deriváty karboxylových kyselín a zámenou na uhlíkovom reťazci sa tvoria substitučné deriváty. Kyselina mravčia (HCOOH) je najjednoduchšia karboxylová kyselina a od ostatných sa líši svojimi redukčnými vlastnosťami, lebo môže reagovať aj ako hydroxyaldehyd (HOCOH). Je to najsilnejšia karboxylová kyselina, lebo nemá žiaden uhlíkový reťazec. Má podobné baktericídne účinky ako formaldehyd. V biochemických reakciách nevystupuje ako voľná, ale v podobe aktívneho formiátu, ktorý je naviazaný na kyselinu tetrahydrolistovú. V prírode sa vyskytuje v jede mravcov a včiel (odkiaľ pochádza aj jej názov). Kyselina octová (CH 3 COOH) vzniká oxidáciou zriedených roztokov etanolu. Uplatňuje sa v potravinárstve (8% roztok je ocot) a chemickom priemysle (koncentrovaná kyselina a aj jej soli). Má tiež biochemický význam v metabolických reakciách, kde ale tiež nevystupuje ako voľná kyselina, ale viazaná tioesterovou väzbou na koenzým A a vystupuje ako aktívny acetát – acetylkoenzým A. Kyselina benzoová (C 6 H 5 COOH, obrázok vedľa) je aromatická kyselina, ktorej kyslosť je zvýšená prítomnosťou aromatického kruhu. Bráni rastu mikroorganizmov, preto sa využíva ako konzervačné činidlo. Pre organizmus je toxická a musí byť detoxikovaná, najčastejšie v pečeni, vytvorením amidovej väzby reakciou karboxylovej skupiny s aminoskupinou glycínu za vzniku kyseliny hippurovej. Dikarboxylové kyseliny obsahujú vo svojej molekule dve funkčné karboxylové skupiny. Vďaka polarite týchto skupín sa zvyšuje aj polarita celej molekuly a taktiež aj jej rozpustnosť vo vode. Kyselina šťaveľová (oxalová HOOC-COOH) je najjednoduchšou dikarboxylovou kyselinou. Ide o pomerne silnu kyselinu, ktorá tvorí dve rady solí. Oxaláty (alebo šťaveľany) sodné a draselné sú dobre rozpustné vo vode, šťaveľan vápenatý je nerozpustný. Kyselina šťaveľová je pre organizmus toxická, lebo s Ca 2+ ľahko tvorí nerozpustný šťaveľan vápenatý a tým teda znižuje koncentráciu Ca 2+ . Zamedzuje tak hemokoagulácií a zvyšuje možnosť vzniku ľadvinových alebo močových kameňov. Kyselina malónová (HOOC-CH 2 -COOH) je tiež pre organizmus toxická. Má podobnú štruktúru ako kyselina jantárová a preto môže kompetitívne inhibovať sukcinátdehydrogenázu, tým blokuje Krebsov cyklus a pôsobí tak hromadenie sukcinátu v tkanivách. Kyselina jantárová (HOOC-CH 2 -CH 2 -COOH) vzniká v priebehu citrátového cyklu vo forme sukcinylkoenzýmu A. Táto forma sa uplatňuje pri syntéze hemu a tvorí sa ako konečný produkt pri odbúravaní niektorých aminokyselín. Trikarboxylové kyseliny, ktoré sú pre metabolizmus dôležité, sú kyselina citrónová a jej polohový izomér kyselina izocitrónová. Kyselina citrónová (vzorec vedľa) je prítomná v rôznych druhoch ovocia, v organizme vzniká kondenzáciou acetylkoenzýmu-A s oxalacetátom v mitochondriách v počiatočnej reakcií Krebsovho cyklu. Je dobre rozpustná vo vode a tvorí tri rady solí. Citrát sodný a draselný sú rozpustné, citrát vápenatý je nerozpustný. Táto vlastnosť sa využíva pri príprave citrátovej krvi a citrátovej plazmy. Pridaním citrátu sodného alebo draselného do odobratej krvi zabránime jej zrážaniu. Biochemicky významné sú aj niektoré nenasýtené karboxylové kyseliny. Podľa usporiadania substituentov na dvojitej väzbe vytvárajú cis- a trans- izoméry, ktoré dávajú molekulám rôzne vlastnosti. Medzi nenasýtené dikarboxylové kyseliny patrí kyselina fumárová (trans-izomér) a kyselina maleínová (cis-izomér, vzorce vedľa). Kyselina fumárová je energeticky chudobnejšia a preto je stálejšia. Vzniká v Krebsovom cykle dehydrogenáciou kyseliny jantárovej. Kyselina olejová (cis-izomér) je bežná nenasýtená monokarboxylová kyselina, ktorá sa nachádza s ďalšími nenasýtenými kyselinami vo veľkom množstve v rastlinných olejoch. Nezastúpiteľnú funkciu v biochemických dejoch v organizme a v štruktúre bunkových a mitochondriálnych membrán majú cis-polyénové (viacnenasýtené) monokarboxylové kyseliny. Niektoré musíme prijímať v potrave, pretože sú esenciálne, napr. kyselina linolová a kyselina linolénová. Kyselina arachidónová môže byť vytvorená v organizme za predpokladu dostatočného príjmu kyseliny linolovej. Tieto nenasýtené kyseliny sú najčastejšie viazané esterovou väzbou na C-2 gylcerole v lipidoch odvodených od kyseliny fosfatidovej. Po hydrolytickom odštiepení slúži napr. k esterifikácií voľného cholesterolu alebo ako substrát pre syntézu látok zo skupiny eikosanoidov. Funkčné deriváty vznikajú náhradou na karboxylovej skupine. Soli karboxylových kyselín sú produktom neutralizačných reakcií. Vodíkový katión karboxylovej skupiny je nahradený iným katiónom. Spätná reakcia (hydrolýza soli) prebieha v malej miere a rovnovážny stav reakcie je posunutý v prospech vzniku vody a soli. Zo solí karboxylových kyselín sa dá karboxylová kyselina uvľniť pôsobením silnej anorganickej kyseliny. Pri slabo alkalickom pH vnútorného prostredia organizmu sú karboxylové kyseliny prítomné vo forme disociovaných solí (R- COO - + X + ). Estery karboxylových kyselín vznikajú reakciou karboxylovej kyseliny s hydroxyderivátmi (najčastejšie alkoholmi). Hydrolýzou esterovej väzby vznikajú opäť kyselina s príslušný hydroxyderivát. Hydrolýza prebieha väčšinou ľahko (esterifikácia je vratná reakcia). V organizme dochádza k hydrolýze esterov (najčastejšie triacylglycerolov) v slabo alkalickom prostredí za vzniku príslušných kyselín a hydroxydroxyderivátu (pri hydrolýze triacylglycerolov ide o glycerol). Estery sú v prírode veľmi rozšírené zlúčeniny. Medzi biologicky významné patria predovšetkým uvedené neutrálne tuky (triacylglyceroly), ktoré nenesú žiaden náboj, sú nepolárne, netvoria vodíkové mostíky a sú nerozpustné vo vode. V organizme musia byť transportované vo väzbe na polárne bielkoviny a nopak slúžia ako nepolárne rozpúšťadlá pre nepolárne látky (niektoré vitamíny a lieky). Medzi estery patria aj významný acetylcholín a rôzne lieky, ako napr. kyselina acetylsalicilová (acylpirín). Amidy obsahujú v polárnu –CONH 2 viazanú priamo na uhlík karboxylovej skupiny namiesto hydroxylovej skupiny, Vykazujú slabo zásadité vlastnosti, sú schopné tvoriť intermolekulárne vodíkové mostíky. Väčšina amidov sú rozpustné vo vode. Prírodné amidy sú peptidy a bielkoviny, dôležité sú tiež amidy aminokyselín – asparagín a glutamín. Zvláštne postavenie v organizme majú amidy kyseliny uhličitej. Monoamid, kyselina karbamová (H 2 NCOOH) nie je schopná samostatnej existencie a rozpadá sa samovoľne na oxid uhličitý a amoniak. Pri syntéze močoviny a pyrimidínov v organizme, ale hraje dôležitú úlohu jej derivát, karbamoylfofát. Niektoré soli kyseliny karbamoej sa využívajú ako lieky, estery majú insekticídne, herbicídne a fungicídne účinky a preto sa využívajú v poľnohospodárstve. Diamín kyseliny uhličitej, močovina (urea, H 2 N-CO-NH 2 )sa chová ako veľmi slabá zásada. Má veľmi polárnu molekulu a preto je veľmi dobre rozpustná vo vode. Močovina je hlavný konečný produkt metabolizmu bielkovín u človeka. Vzniká v pečeni, v ľadvinách prechádza do moči a nasledovne sa vylučuje z tela. Náhradou kyslíku iminoskupinou v močovine vzniká guanidin (iminomočovina). Ide o silnú zásadu, ktorá tiež dáva zásadité vlastnosti aminokyseline arginínu. Biologicky významné sú deriváty guanidínu – kreatín a jeho dehydratovaný produkt kreatinín. Reakciou močoviny s karboxylovými kyselinami vznikajú ureidy (acylderiváty močoviny). Formálne medzi ureidy patrí aj kyselina barbiturová ajej deriváty, aj keď jej syntéza vychádza z esteru kyseliny malónovej. Anhydridy (R-CO-O-CO-R) sú biochemicky dôležité funkčné deriváty karboxylových kyselín. V metabolizme sa často uplatňujú aj zmiešané anhydridy s kyselinou fosforečnou, napr. 1,3-bisfosfoglycerát a pri proteosyntéze „aktivované“ aminokyseliny (pre naviazanie tRNA). K funkčným derivátom karboxylových kyselín môžeme zaradiť ešte nitrily (R-CN) a halogenidy (R-COX). Substitučné deriváty karboxylových kyselín majú v molekule na uhľovodíkovom reťazci okrem karboxylovej skupiny naviazané aj ďalšie funkčné skupiny. Aminokyseliny obsahujú okrem karboxylovej skupiny ešte jednu alebo viac aminoskupín (-NH 2 ), ktoré môžu byť naviazané na akomkoľvek uhlíku reťazca. Táto skupiny udeľuje vždy molekule aminokyseliny vlastnosti amínov a zároveň ovplyvňuje aj chovanie karboxylovej skupiny. Aminokyseliny majú amfotérne vlastnosti, t.j. karboxylová skupina (kyslá) môže odštiepovať protón a aminoskupina (zásaditá) môže protón prijímať. Aminokyseliny sú veľmi polárne zlúčeniny a ich rozpustnosť vo vode závisí na štruktúre uhlíkového reťazca. Najmenšiu rozpustnosť majú v tzv. izoelektrickom bode, tj. pri pH, kedy má molekula nulový celkový náboj (má disociované obe skupiny a počty kladných a záporných nábojov sú vyrovnané). Biologicky významné sú L-izoméry α-aminokyselín (aminoskupinu majú na druhom uhlíku (α-uhlíku), ktorý susedí s karboxylovou skupinou). Ide o geneticky kódované hlavné stavebné prvky peptidov a bielkovín. Dôležité sú aj aromatické aminokyseliny, ktoré majú aminokyselinu naviazanú priamo na aromatické jadro. Základná je kyselina aminobenzoová. Jej izomér kyselina 1,4-aminobenzoovaá (označovaná ako kyselina para-aminobenzoová alebo PABA) tvorí súčasť kyseliny listovej a je dôležitým rastovým faktorom niektorých baktérii. Farmakologicky významné sú jej estery, ktoré sa používajú ako lokálne anestetiká (napr. benzokaín – etylester kysleiny 1,4-aminobenzoovej). Hydroxykyseliny obsahujú v svojej molekule jednu alebo viac hydroxyskupín a majú teda vlastnosti kyselín a aj alkoholov alebo fenolov. Sú súčasťou metabolizmu rastlín aj živočíchov a preto sa vyskytujú v prírode veľmi často. Môžu tvoriť soli, estery s kyselinami aj alkoholmi, môžu byť oxidované (hydroxyskupina) aj redukované (karboxyskupina). Hydroxyskupina zvyšuje kyslosť karboxylovej skupiny. Mnohé hydroxykysliny tvoria ligandy v komplexných zlúčeninách s kovovými iónmi (napr. kyselina mliečna a citrónová v rozpustných komplexoch s Ca 2+ . Veľmi biochemicky dôležitá je kyselina citrónová, ktorá vzniká v organizmu a podľa nej je pomenovaný celý cyklus reakcií (citrátový cyklus). Hydroxyskupina v kyseline citrónovej sa chová ako terciárny alkohol, v priebehu rekcií je ale izomerizovaná na sekundárny alkohol (kyselina izocitrónová) a následne je dehydrogenovaná naoxokyselinu (kyselina oxaljantárová). Ako produkt metabolizmu sacharidov pri svalovej práci (anaerobná glykolýza) vzniká kyselina mliečna. Je to pravotočivá, L-mliečna kyselina, ktorá má rovnakú konfiguráciu ako kódované aminokyseliny. Mliečnym kvasením cukrov vzniká recemát kyseliny mliečnej, ktorý sa pri patologických stavoch môže objaviť v žalúdočnej šťave. Kyselina mliečna, ktorá vznikla vo svaloch sa z veľkej časti odvádza do pečene, kde sa dehydrogenuje na kyselinu pyrohroznovú (sekundárna alkoholová skupina sa oxiduje na oxoskupinu). Ďalšia metabolicky významná hydroxykyselina je kyselina 3-hydroxymaslová. Vzniká hydrogenáciou kyseliny acetooctovej, predovšetkým v pečeni pri nadbytku acetylkoenzýmu A (redukcia oxoskupiny na sekundárny alkohol). Pri niektorých patologických stavoch sa vylučuje v moči. V citrátovom cykle vzniká hydratáciou kyseliny fumárovej kyselina jabĺčna (hydroxyjantárová), ktorá sa ďalej oxiduje na kyselinu oxaloctovú (dehydrogenácia sekundárnej alkoholovej skupiny na oxoskupinu). V glykolýze vzniká kyselina glycerová (2,3-dihydroxypropánová), ktorá môže mať esterifikovanú skupinu na C 2 alebo C 3 kyselinou fosforečnou. Z aromatických hydroxykyselín je v lekárstve dôležitá kyselina salicylová (2- hydroxybenzoová) a hlavne jej deriváty. Dôležité sú kyselina 4-aminosalicilová a ester kyseliny salicylovej, ktorý vzniká esterifikáciou fenolovej hydroxyskupiny kyselinou octovou – kyselina acetylsalicylová alebo acylpirín. Polyhydroxykyseliny vznikajú oxidáciou cukrov – aldóz a ketóz. Dôležité sú kyselina glukurónová (obsahuje esšte aldehydovú skupinu) a kyselina glukónová. Oxokyseliny majú vo svojej molekule okrem karboxylových skupín aj aldehydovú alebo ketónovú skupinu. Obe tieto funkčné skupiny môžu vznikať oxidáciou príslušných alkoholov. Veľmi významná pre metabolizmus je kyselina pyrohroznová, najdôležitejšia ketokyselina. V metabolizme sacharidov je v úzkom vzťahu s kyselinou mliečnou, lebo vzniká jej oxidáciou. Biochemicky je významná kyselina acetoctová. Ide o 3-oxokyselinu (3-oxobutánovú), je to stredne silná a nestála kyselina, ktorá samovoľne dekarboxyluje na acetón. V organizme vzniká pri metabolizme mastných kyselín a vo väčšom množstve sa tvorí napr. pri hladovaní alebo pri dekompenzovanom diabetes mellitus. V Krebsovom cykle sa tvorí dehydrogenáciou kyseliny jablčnej kyselina oxaloctová. Keďže organizmus postrebuje dostatočné množstvo kyseliny oxaloctovej (pre tvorbu kyseliny citrónovej), môže táto kyselina vznikať aj karboxyláciou kyseliny pyrohroznovej. Zapojuje sa aj do transaminácií aminokyselín, vzniká z nej kyselina aparágová. Kyselina 2-oxoglutárová je tiež súčasťou Krebsovho cyklu, ktorá vzniká spontánnou dekarboxyláciou kyseliny oxaljantárovej a zúčastňuje sa taktiež transaminácií za vzniku kyseliny glutámová. I/27. Dusíkaté, kyslíkaté a sirné heterocykly, význam Heterocyklické zlúčeniny sú látky, ktoré majú okrem uhlíkových atómov v cykle viazaný jeden alebo viac iných atómov, najčastejšie ide o kyslík, dusík alebo síru. Podľa typu uhlíkového reťazca (nasýtený/nenasýtený) vytvára heteroatóm formálne rôzne funkčné skupiny, ktorých reaktivita je v heterocykloch odlišná. Heterocyklické zlúčeniny využívajú väčšinou triviálne názvoslovie, ale pozície na cykloch sa musia vždy správne očíslovať. Heterocyklické zlúčeniny môžu byť nasýtené aj nenasýtené. Niektoré päť- alebo šesťčlenné cykly spĺňajú podmienku aromatického charakteru (dokonalo konjugovaný systém šiestich π-elektrónov v planárnom kruhu). Patria sem aj cykly, kde do konjugácie môže vstúpiť aj voľný elektrónový pár, potom majú tieto zlúčeniny vlastnosti aromatických zlúčenín. Aromatický charakter ale oslabuje elektronegativitu heteroatómu, tým, že priťahuje k sebe elektróny. Aromatický charakter klesá v rade tiofén, pyrol, furán, pretože elektronegativita heteroatómov stúpa v smere síra, dusík, kyslík. Dusíkaté heterocykly majú charakter pomerne slabých zásad (rovnako ako iné amíny). Výnimku však tvoria cykly, kde je voľný elektrónový pár zapojený do konjugácie elektrónov v cykle (napr. pyrrol). Vodík viazaný na dusík je schopný sa odštiepiť ako protón a preto je pyrol slabou kyselinou. Naopak v pyridíne viazaný dusík má voľný elektrónový pár a môže prijímať protón, je bázický a môže tvoriť soli s kyselinami. Pyrol a pyridín majú aromatické vlastnosti. Taktiež nasýtené heterocyklické zlúčeniny môžu mať zásaditý charakter, sú schopné prijímať protón a kovalentnou väzbou tvoriť katión a s príslušnou kyselinou tvoriť soľ. Stále sú iba dusíkaté soli (amóniový katión). Päťčlenné heterocykly Hydrogenáciou furánu vzniká tetrahydrofurán, ktorý je základom pre cyklické päťčlenné formy monosacharidov – furanózy. Hydrogenáciou thiofénu vzniká tetrahydrothiofén (thiofán), ktorý je súčasťou biotínu (vitamín). Pyrrol je najdôležitejší päťčlenný heterocyklus, jeho redukciou vzniká postupne hydropyrrol až úplne nenasýtený pyrrolidín. Obe zredukované formy stratili kyslosť pyrrolu a majú vlastnosti sekundárnych amínov (imínov). Od pyrrolidínu sa odvodzuje aminokyselina prolín (iminokyselina). Základnou štruktúrou mnohých dôležitých biologicky významných derivátov je systém štyroch pyrrolov, ktoré sú spojené meténovými mostíkmi buď lineárne alebo v cykle (tetrapyrrol). Vytvára sa tak dokonale konjugovaný systém dvojitých väzieb a celá farebná molekula je často planárna. Jednotlivé typy tetrapyrrolových farbív sa od seba líšia ďalšou substitúciou a sú základnou zložkou hemoglobínu, chlorofylu, vitamínu B 12 , žlčových farbív alebo niektorých enzýmov. Heterocykly s dvoma heteroatómami majú vždy jeden voľný elektrónový pár, môžu viazať protón a majú teda bázické vlastnosti. Imidazol je základom aminokyseliny histidínu a silne zásaditého biogénneho amínu histamínu. Pyrazol a thiazol sú základom pre syntézu niektorých liekov (napr. antipyrín, sulfathiazol). Šesťčlenné heterocykly Hydrogenáciou pyránu vzniká tetrahydropyrán, ktorý je základom cyklických šesťčlenných foriem monosacharidov – pyranózy. Pyridín má zásadité vlastnosti a s kyselinami ľahko tvorí soli (kvartérny amín, katión pyridinium). Od pyridínu sa odvádzajú biologicky významné látky ako napr. kyselina nikotínová a jej amid (nikotínamid, vitamín PP). V organizme vzniká kyselina nikotínová z aminokyseliny triptofánu, deriváty nikotínamidu sú koenzýmy enzýmov dehydrogenáz. Ďalší derivát pyridínu, pyridoxalfosfát, je koenzýmom transamináz a dekarboxyláz. Úplnou dehydrogenáciou pyridínu vzniká sekundárny amín piperidín, ktorý je pomerne silnou zásadou. Je súčasťou niektorých alkaloidov (napr. piperínu v čiernom korení) a analgetík. Šesťčlenný heterocyklus s dvoma heteroatómami dusíku, primidín, a jeho polohový izomér pyrazín majú tiež biologický význam. Pyrimidín je súčasťou vitamínu B 1 . Hlavné pyrimidínové bázy (deriváty pyrimidínu) , uracil (2,4-dioxopyrimidín), tymín (2,4-dioxo-5- metylpyrimidín) a cytozín (2-oxo-4-aminopyrimidín), sú súčasťou nukleozidov a nukleotidov. V nukleozidoch a deoxyribonukleozidoch (uridín, tymidín a cytidín) sa na dusík zásady viaže N-glykozidovou väzbou pentóza (ribóza alebo deoxyribóza). Fosforiláciou hydroxyskupiny príslušnej pentózy nukleozidu (váčšinou na uhlíku C 5 ) sa tvoria nukleotidy. Môže prebehnúť aj ďalšia fosforylácia, vytvoria sa fosfátové anhydridové väzby a vzniknú di- a trifosfáty nukleotidov. Polymerizáciou nukleotidov fosfodiesterovými väzbami vznikajú nukleové kyseliny. Tymín je typickou bázou deoxyribonukleových kyselín (DNA), uracil sa vyskytuje len v ribonukleových kyselinách (RNA) a cytozín sa vyskytuje v DNA aj RNA. Okrem hlavných bází sa môžu v nukleových kyselinách vyskytovať aj minoritné (atypické) bázy (napr. 5-metylcytozín alebo 5-hydroxymetylcytozín). Heterozlúčeniny tvorené dvomi kondenzovanými heterocyklami Purín sa skladá z pyrimidínu a imidazolu. Od tejto základnej štruktúry sa odvodzuje veľa biologicky dôležitých látok. Významné sú najmä hlavné purínové bázy, adenín (6- aminopurín) a guanín (2-amino-6-oxopurín), ktoré sú súčasťou nukleozidov (adenozín a guanozín) a nukleotidov. Adenín aj guanín sa vyskytujú v DNA aj RNA. V RNA sa vyskytujú aj minoritné bázy (napr. N 6 -metyladenín; N 6 ,N 6 - dimetyladenín a N 7 -metylguanín). Okrem voľných nukelotidov (rôzne fosforilovaných) majú význam aj cyklické formy ich monofosfátov. Predovšetkým sa uplatňuje cyklický fosfodiester adonozín- 3 ́-5 ́-monofosfát (cAMP) a guanozín-3 ́- 5 ́-monofosfát (cGMP). Purínové bázy sa pri odbúravaní premieňajú na deriváty purínu – hypoxantín (6-oxopurín), xantín (2,6-dioxopurín) a kyselinu močovú (2,6,8-trioxopurín). Kyselina močová, ktorá je konečným produktom metabolizmu purínových bází, môže podľa pH prostredia existovať v rôznych tautomérnych formách. Dve najčastejšie formy sú laktámová a laktímová. Hydroxyskupiny laktímovej formy môžu odštiepiť protón, preto táto forma vykazuje kyslé vlastnosti. Pretože je kyselina močová vo vode veľmi zle rozpustná, môže sa stať súčasťou močového sedimentu alebo močových kameňov. Rozpustnosť sa zvýši vznikom solí, z ktorých je najrozpustnejší urát lítny. Deriváty xantínu (metylované puríny) sa vyskytujú v čaji, káve a kakaových bôboch ako alkaloidy teofyllín, kofeín a teobromín. Pteridín je tvorený kondenzáciou pyrimidínu a pyrazínu. Jeho biologicky najvýznamnejším derivátom je kyselina listová. Jej hydrogenovaný derivát, kyselina tetrahydrolistová, je koenzým prenášajúci jednouhlíkové zvyšky pri štiepení aminokyselín. Isoalloxazín je jeden z izomérov benzopteridínu, ktorý vzniká kondenzáciou benzénu a pterydínu. Metylovaný derivát isoalloxazínu je základom vitamínu B 2 (riboflavínu), ktorý je základom flavínových enzýmov. I/28. Strukturní charakteristiky aminokyselin, dělení, reakce, význam. Aminokyseliny sú substitučné deriváty karboxylových kyselín, ktoré majú na uhlíkovom reťazci okrem karboxylovej skupiny naviazanú jednu alebo viac aminoskupín (-NH 2 ). Z vyše 300 aminokyselín, ktoré boli objavené v prírode, iba 21 tvorí základné stavebné jednotky ľudských bielkovín (iba tieto aminokyseliny sú kódované pomocou DNA). Každá aminokyselina (okrem prolínu, ktorý ma sekundárnu aminoskupinu) má karboxylovú skupinu (-COOH), aminoskupinu (-NH 2 ) a zvyšok uhlíkového reťazca (-R, odlišný pre každú aminokyselinu) naviazané na α-uhlíku (obrázok vedľa). Za fyziologického pH (7,4) je karboxylová skupina disociovaná a vytvára záporne nabitý karboxylový anión (-COO - ); a na aminoskupinu je naviazaný protón (-NH 3 + ). V bielkovinách sú takmer všetky karboxylové a aminskupiny pospájané peptidovou väzbou a všeobecne nie sú schopné chemických reakcií (okrem vytvárania vodíkových mostíkov). A teda postranný reťazec určuje úlohu aminokyseliny v bielkovine. Preto je vhodné klasifikovať jednotlivé aminokyseliny na základe vlastností ich postranného reťazca, to znamená, či je polárny alebo nepolárny. Každá aminokyselina má svoje pridelené trojpísmenné označenie a svoj symbol (napr. Cysteín = Cys= C). Aminokyseliny s nepolárnym reťazcom neodovzdávajú ani neprijímajú protón a nezúčastňujú sa na tvorbe vodíkovej alebo iónovej väzby. Postranný reťazec týchto aminokyselín môže byť „mastný“, čo mu dovoľuje vytvárať hydrofóbne interakcie. V bielkovinách nachádzajúcich sa vo vode (polárnom prostredí), postranné reťazce nepolárnych aminokyselín majú tendenciu sa zhlukovať vo vnútornej časti bielkoviny. Tento jav, ktorý je známy ako hydrofóbny efekt, je spôsobený hydrofóbnosťou postranných reťazcov, ktoré sa správajú ako kvapôčky oleja, zhlukujúce sa vo vodnom prostredí. A tak nepolárne reťazce vypĺňajú vnútro poskladanej bielkoviny a pomáhajú im vytvoriť ich trojrozmernú štruktúru. Avšak proteíny, ktoré sa nachádzajú v hydrofóbnom prostredí (napr. bunková membrána), majú nepolárne reťazce na vonkajšom povrchu bielkoviny a interagujú s nepolárnym prostredím. Vzorce týchto aminokyselín sú na obrázku vedľa. Prolín sa líši od ostatných aminokyselín tým, že postranný reťazec a α-amino dusík vytvárajú pevný päťčlenný cyklus, Prolín má preto namiesto primárnej skupiny sekundárnu aminoskupinu a označuje sa ako iminokyselina. Jedinečná štruktúra prolínu napomáha vytvoreniu fibrilárnej štruktúry kolagénu a často rozrúša α-hélixy, ktoré sa nachádzajú v globulárnych proteínoch. Aminokyseliny s elektricky nenabitým polárnym reťazcom majú nulový náboj pri neutrálnom pH. Pri zásaditom pH však môže postranný reťazec cysteínu a tyrozínu odovzdať protón. Serín, treonín a tyrozín obsahujú polárne hydroxylové skupiny, ktoré sa môžu zapájať do vodíkovej väzby. Postranné reťazce asparagínu a glutamínu obsahujú karbonylovú aj aminoskupinu, ktoré tiež môžu vytvárať vodíkové mostíky. Postranný reťazec cysteínu obsahuje thioolovú skupiny (-SH), ktorá je dôležitou súčasťou aktívnej formy enzýmov. V bielkovinách sa môžu dve -SH skupiny dvoch cysteínovoxidovať za vzniku diméru, ktorý obsahuje kovalentný mostík, nazývaný disulfidová väzba (-S-S-). Touto väzbou je stabilizovaných mnoho bielkovín, napr. albumín. Polárna hydroxylová skupina serínu, treonínu a vzácne aj tyrozínu, môžu slúžiť ako miesto väzby s inými zlúčeninami (napr. fosfátová skupina). Taktiež amidová skupina asparagínu a hydroxylová skupina serínu alebo treonínu môžu slúžiť ako miesto naviazania oligosacharidových reťazcov v glykoproteínoch. Aminokyseliny s kyslím reťazcom sú kyselina asparágová a glutámová, obe sú schopné uvoľňovať protón. Za fyziologického pH sú postranné reťazce sú úplne ionizované a obsahujú negatívne nabitú karboxylovú skupinu (-COO - ). Pre tento fakt sa tieto aminokyseliny nazývajú aj ako aspartát a glutamát, aby sa poukázalo na ich iónový charakter za fyziologického pH. Aminokyseliny s bázickým reťazcom sú schopné prijať protón. Za fyziologického pH sú bočné reťazce lyzínu a arginínu úplne ionizované a majú pozitívny náboj. Naopak, histidín je slabá zásada a ako voľná aminokyselina je za fyziologického pH väčšinou neionizovaná a teda má neutrálny náboj. Avšak, keď je histidín zakomponovaný do proteínu, jeho reťazec môže byť buď pozitívne nabitý alebo bez náboja, čo záleží na prostredí, ktoré vytvárajú polypeptidové reťazce bielkoviny. Toto je dôležitá vlastnosť histidínu, ktorá prispieva k fungovaniu určitých bielkovín, napr. hemoglobínu. α-uhlík každej aminokyseliny má na sebe naviazané štyri rôzne substituenty a preto ide o chirálny (alebo opticky aktívny) uhlík. Glycín je výnimkou, lebo na svojom α-uhlíku má naviazané dve vodíkové substituenty a preto je opticky neaktívny. Aminokyseliny, ktoré majú v svojej molekule chirálne centrum, môžu existovať v dvoch formách, D a L forme, ktoré sú si navzájom zrkadlovým obrazom. Tieto dve formy každého páru označujeme ako stereoizomery, optické izoméry alebo enetioméry. Všetky aminokyseliny, ktoré sa vyskytujú v bielkovinách sú v L- forme, avšak, niektoré D-aminokyseliny sa vyskytujú v antibiotikách alebo bunkovej stene rastlín a baktérií. Významnou vlastnosťou aminokyselín je ich schopnosť kondenzácie. Najdôležitejšou reakciou aminokyselín je tvorba peptidovej väzby (viac otázka I/29). Voľná aminokyselina ľahko kondenzuje s aromatickými aldehydami za vzniku Schiffových zásad. Táto reakcia je základom niektorých premien aminokyselín. Pyridoxalfosfát (substituovaný aromatický aldehyd) je súčasťou katalyzovaného miesta všetkých transamináz a ďalších enzýmov (napr. dekarboxylázy). Pri týchto reakciách vznikajú ako medziprodukty Schiffové bázy. Pri biodegradácií aminokyslín prebieha v pečeni a ľadvinách v bunkách oxidatívna deaminácia, pri ktorej aminokyselina oxiduje na α-iminokyselinu, ktorá na seba aduje vodu za vzniku amoniaku a oxokyseliny. Reakcia je katalyzovaná oxidázami aminokyselín s klavínovými koenzýmami FMN alebo FAD, ktoré sú autoxidabilné (ich redukované formy reagujú s O 2 za vzniku H 2 O 2 ). Ďalšou významnou reakciou aminokyselín je dekarboxylácia, pri ktorej vznikajú biogénne amíny (látky s veľkým fyziologickým účinkom) a CO 2 . Deakrboxiláciou histidínu vzniká histamín, tryptofánu tryptamín, tyrozínu tyramín, zo serínu etanolamín (kolamín), z kyseliny asparágovej β- alanín, z kyseliny glutárovej kyselina γ-aminomaslová (GABA; neurotrasmiter). Významnou reakciou, tyopickou pre cysteín, je dehydrogenácia dvoch thiolových skupín –SH na disulfid (–S-S-) cystínu (z dvoch molekúl cysteínu vzniká cytín, dôležitý redoxný systém). Vzniknutá kovalentná väzba disulfidových mostíkov cystínu môže významne stabilizovať štruktúry polypeptidových reťazcov. V molekulách aminokyselín môžu prebiehať aj rôzne iné reakcie na uhlíkovom reťazci, napr. hydroxylácia fenylalanínu na tyrozín alebo tvorba dihydroxyfenilalanínu (DOPA) z tyrozínu. Aminokyseliny môžeme rozdeliť ďalej na esenciálne (Leu, Ile, Val, Phe, Trp, Lys, Thr, Met), ktoré si metabolizmus nedokáže syntetizovať a preto ich musí prijímať v potrave; semiesenciálne (His, Arg), ktorých syntéza je nedostatočná v dobe rastu a neesenciálne, ktoré si vie organizmus sám syntetizovať (všetky ostatné). Voľné aminokyseliny sú stále pripravené na syntézu peptidov, bielkovín a iných dusíkatých látok. Glycín sa využíva pri biosyntéze purínov, kreatínu, glutationu a hemu alebo pri konjugácií so žlčovými kyselinami. Serín sa vyskytuje v štruktúre fosfolipidov a pri syntéze sfingozínu. Tyrozín dáva vznik hormónom štítnej žľazy, v dreni nadľadvín je východiskovou látkou na tvorbu adrenalínu, v neurónoch z neho vznikajú transmitery noradrenalín a dopamín a v pigmentových bunkách sa z neho syntetizujú pigmenty melaníny. Degardácia tryptofánu vedie okrem iného aj k vzniku nikotínamidu, ktorý je súčasťou koenzýmu NAD + . Aminokyseliny môžu byť aj substrátom pre tvorbu iných neesenciálnych aminokyselín. Organizmus si nedokáže nasyntetizovať benzénové jadro, preto je fenylalanín esenciálnou aminokyselinou, avšak tyrozín (ktorý tiež obsahuje benzénové jadro) je neesenciálna aminokyselina, ktorá vzniká pri dostatočnom množstve fenylalanínu a príslušných enzýmov jeho hydroxláciou (naopak to nejde). V organizme sa okrem kódovaných aminokyselín nachádzajú aj iné aminokyseliny, napr. ornitín a citrulín sú potrebné pre syntézu močoviny, β-alanín je dôležitý pre vznik dipeptidu karnozínu, kyseliny γ-aminomaslová (GABA) je inhibičným neurotransmiterom v CNS. I/29. Peptidy, peptidová vazba, příklady biologicky významných peptidů. Významnou vlastnosťou aminokyselín je ich schopnosť kondenzácie. Spojením dvoch a viac aminokyselín peptidovou väzbou vznikajú peptidy, ktoré podľa počtu aminokyselín delíme na dipeptidy, tripeptidy až polypeptidy, ktoré už radíme medzi bielkoviny. V peptidoch sú aminokyseliny spojené peptidovou väzbou, ktorá predstavuje amidové spojenie medzi α-karboxylovou skupinou jednej aminokyseliny a α-aminoskupinou inej. Peptidová väzba nezaniká klasickou denaturáciou bielkoviny (napr. zahrievaním), ale pre jej neenzymatické štiepenie je potrebné vystavenie silnej kyseline alebo bázy za zvýšenej teploty. Peptidová väzba má čiastočne charakter dvojitej väzby, lebo je kratšia než jednoduchá, pevná a rovinná. Tieto vlastnosti zabraňujú voľnej rotácií uhlíku a dusíku okolo peptidovej väzby. Avšak, väzby medzi α uhlíkmi a α-amino alebo karboxylovou skupinou už dovoľujú voľnu rotáciu (ktorá je ale limitovaná vlastnosťami a dĺžkou postranného reťazca). Tento fakt umožňuje polypeptidovému reťazcu vytvárať rôzne možné konfigurácie. Peptidová väzba sa väčšinou vyskytuje v trans-forme, hlavne kvôli vzájomnému priestorovému pôsobeniu bočných reťazcov v cis-forme väzby. Podobne ako všetky amidové spojenia, aj –C=O a –NH skupiny peptidovej väzby sú bez náboja, neprijímajú a ani nevylučujú protóny v pH rozsahu 2-12. Preto v polypeptidovom reťazci sú ionizované iba aminoskupiny na N-konci, kaboxylové skupiny na C-konci a ionizovateľné skupiny bočných reťazcov aminokyselín. Vznik peptidovej väzby je najdôležitejšou reakciou aminokyselín. Podľa dohody voľný amino-koniec peptidového reťazca (N-koniec) sa píše zľava a sprava píšeme voľný karboxylový koniec (C-koniec). Preto sa sekvencia všetkých aminokyselín číta od N-konca smerom k C-koncu peptidu. Každú zabudovanú aminokyselinu označujeme ako „zvyšok“, lebo sa odštiepil protón vo forme vody pri vzniku peptidovej väzby. Pri pomenovávaní polypeptidu sa mania koncovky všetkých zvyškov aminokyselín na –yl okrem poslednej aminokyseliny na C- konci reťazca. Napr. tripeptid, ktorý obsahuj na N-konci valín, glycín a na C-konci má leucín sa nazýva valylglycylleucín. Mnohé peptidy môžeme izolovať z prírodných zdrojov, ale môžeme ich aj vyrobiť chemickou syntézou alebo metódami molekulárnej biológie. Biologická aktivita peptidu výdza z jeho primárnej štruktúry a konformácie celej molekuly. Peptidy syntetizované v organizme majú rôzne fyziologické účinky. Dipeptid karnozín (β-alanylhistidín) sa vyskytuje u človeka v kostrovom svalstve. Tripeptid glutathión (γ-glutamyl-cysteinyl-glycín) sa ľahko oxiduje a katalyzuje rozklad toxického H 2 O 2 a chráni –SH skupiny peptidov a bielkovín v redukovanom stave pred oxidáciou. Taktiež udržuje redukčné prostredie v erytrocytoch a teda aj železo v hemoglobíne v redukovanom stave. Vyššie peptidy a polypeptidy často pôsobia ako hormóny. Primárna štruktúra peptidových hormónov neurohypofýzy, oxitocínu a vozopresínu, umožňuje vznik disulfidového mostíka a prepojenie reťazca do cyklickej formy peptidu. Obe oktapeptidy sú si štruktúrne veľmi podobné (rozdiel 2 aminokyselín), ale majú rozdielne účinky. Oxytocín spôsobuje sťahy hladkého svalstva (hlavne v delohe), preto sa využíva v gynekológií na vyvolanie alebo reguláciu pôrodu. Vazopresín pôsobí konstrikciu hladkého svalstva ciev, čriev a močového mechúra; tiež ako antidiuretický hormón pôsobí na diurézu. Polypeptid inzulín sa skladá z 51 aminokyselín, bol ako prvý polypeptid sekvenovaný a následne chemicky syntetitizovaný. Inzulín sa skladá z dvoch reťazcov spojených dvoma disulfidickými mostíkmi. Inzulín je v pankrease uvoľňovaný z prekurzorovej molekuly biologicky takmer neaktívneho proinzulínu. Reťazec proinzulínu začína normálnou sekvenciou reťazca inzulínu (reťazec B), na ktorý nadväzuje polypeptid (asi 33 aminokyselin) a ďalej sa napojuje na reťazec inzulínu (reťazec A). Proteolýzou sa polypetid vyštiepi a uvoľní sa biologicky aktívny inzulín. Vo vyšších koncentráciách sa tvorí inzulín hexadimér s dvoma zinočnatými iónmi. V pankrease sa okrem inzulínu podobným systémom tvorí ďalší polypetid glukagón. Proglukagón obsahuje 78 aminokyselín a biologický aktívny glukagón je tvorený 34 aminokyselinami. Účinkami ide prakticky o antagonistu inzulínu. Medzi peptidy patria tiež prudko toxické látky, ako napr. toxíny α-amanitín alebo faloidín, ktoré boli izolované z muchotrávky zelenej. Ide o termostabilné toxíny, takže sa nezničia varom. I/30. Bílkoviny, struktura, vlastnosti a funkce Bielkoviny sú najpočetnejšie a funkčne najrozmanitejšie molekuly v živých organizmoch. Doslova každý proces v organizme je závislí na bielkovinách. Enzýmy a polypeptidové hormóny priamo regulujú metabolizmus v tele. Kontraktilné proteíny v svaloch podmieňujú pohyb. V kostiach bielkovina kolagén vytvára konštrukciu pre ukladanie kryštálov fosforečnanu vápenatého [Ca 3 (PO 4 ) 2 ], pričom sa správa ako železné tyče v betónových konštrukciách. V krvi sa nachádzajú bielkoviny ako hemoglobín a albumín, ktoré majú transportnú funkciu. Nachádzajú sa v nej aj imunoglobulíny, ktoré bojujú proti baktériám a vírusom – imunitná funkcia. V skratke, proteíny majú veľmi veľa rôznych funkcií a zároveň majú jednu spoločnú vlastnosť, že štruktúrne ide o lineárne polyméry aminokyselín. Primárnu štruktúru bielkovín predstavuje sekvencia aminokyselín, ktoré sú navzájom pospájané peptidovou väzbou. Pochopenie primárnej štruktúry bielkovín je dôležité, lebo mnohé genetické ochorenia majú pôvod v abnormálnom poradí aminokyselín v bielkovinách, čo ďalej spôsobuje nesprávne zloženie vyšších štruktúr proteínu a narúša tak ich normálnu biologickú aktivitu (napr. zámena aminokyselín v hemoglobíne môže viesť k vzniku kosáčikovitej (srpkovitej) anémie). Ak poznáme primárnu štruktúru zdravej a mutovanej bielkoviny, tak túto informáciu vieme využiť pri diagnóze a štúdiu ochorenia. Viac o peptidovej väzbe a aminokyselinách je napísané v otázke I/26. Polypeptidová kostra nezaujíma náhodné priestorové usporiadanie, ale všeobecne vytvárajú pravidelné usporiadania aminokyselín, ktoré sa nachádzajú blízko seba v lineárnej sekvencií. Tieto usporiadania vytvárajú sekundárnu štruktúru polypeptidov. Príkladmi usporiadaní sekundárnej štruktúry, ktoré sa často vyskytujú v bielkovinách sú α-helix, β-skladaný list a β-ohyb. Viacero rôznych helixov bolo objavených v prírodných bielkovinách, no najčastejšie vyskytujúci sa je α-helix. Ide o špirálovitú štruktúru, pozostávajúcu z natesno zloženého, skrúteného polypeptidového reťazca a bočných reťazcov príslušných aminokyselín, ktoré vytŕčajú smerom von, aby predišli vzájomnému pôsobeniu. α-helix sa nachádza v rôznych typoch bielkovín. Napr. keratíny sú fibrilárne proteíny, ktorých štruktúra je zložená takmer iba z α-helixov. Vytvárajú hlavnú stavebnú zložku vlasov a kože, ich pevnosť je podmienená prítomnosťou disulfidických mostíkov medzi prítomnými polypeptidovými reťazcami. Naopak, myoglobín tiež obsahuje veľa α-helixov vo svojej štruktúre, ale na rozdiel od keratínu, ide o globulárnu flexibilnú bielkovinu. α-helix je stabilizovaný početnými vodíkovými mostíkmi medzi karboxylovým kyslíkom a amínovým dusíkom v polypeptidovom reťazci. Vodíkové väzby sa naťahujú smerom hore od karbonylového uhlíku jednej peptidovej väzby k dusíku peptidovej väzby, posunutej od prvej o tri až štyri aminokyseliny. Tento fakt zapríčiňuje, že všetky komponenty peptidových väzieb sú navzájom pospájané vnútroreťazcovou vodíkovou väzbou. Samotné vodíkové väzby sú veľmi slabé, no kolektívne sú schopné stabilizovať helix. Každá otočka helixu obsahuje 3,5 aminokyseliny, z čoho vypláva, že dve aminokyseliny, ktoré sú od seba vzdialené o 3-4miesta v primárnej štruktúre, budú priestorovo blízko v α-helixe. Sekundárna aminoskupina prolínu je priestorovo nekompatibilná s pravotočivou špirálovitou štruktúrou helixu, preto vytvára ohyb v reťazci, ktorý narúša hladkú špirálovitú štruktúru. Taktiež aminokyseliny s nábojom (napr. aspartát, glutamát, lyzín,...) narušujú helix vytváraním iónových väzieb medzi sebou navzájom alebo vzájomným elektrostatickým priťahovaním. Aminokyseliny s veľkým bočným reťazcom (triptofán) alebo s vetvím na β-uhlíku rozrúšajú helikálnu štruktúru, ak sa nachádzajú vo veľkom počte. Inou formou sekundárnej štruktúry bielkovín, ktorú stabilizujú vodíkové väzby, je β-skladaný list. Na rozdiel od helixu, β-skladaný list pozostáva z dvoch alebo viac polypeptidových reťazcov, ktoré sú takmer úplne natiahnuté. V β-skladanom liste sú vodíkové mostíky kolmé na peptidové reťazce. Skladaný list môže vzniknúť z dvoch alebo viac samostatných polypeptidových reťazcov alebo segmentov reťazca, ktoré sú navzájom uložené buď anitparalelne (C- a N- konce sa striedajú) alebo paralelne (všetky N- a C-konce sú pri sebe ). Vodíkové mostíky, ktoré vzniknú medzi polypeptidovými reťazcami, nazývame ako medzireťazcové väzby. β-skladaný list môže vzniknúť aj z jedného polypeptidového reťazca, ktorý je skladaný na seba (vytvára paralelné usporadanie). V tomto prípade však vodíkové väzby označujee ako vnútroreťazcové väzby. V globulárnych proteínoch často β-skladaný list vytvára pravotočivé špirály, ktoré zvyčajne predstavujú základ pre tieto proteíny. β-ohyb mení smer polypeptidového reťazca, čím pomáha vytvoriť kompaktný globulárny tvar proteínu. Väčšinou tieto ohyby nachádzame na povrchu molekuly a často obsahujú elektricky nabité aminokyseliny. Ohyb sa najčastejšie skladá zo štyroch aminokyselín, z ktorých jedna býva často prolín (vytvára ohyb v reťazci). Taktiež glycín, aminokyselina s najkratším bočným reťazcom, je často zastúpený v β-ohyboch. β-ohyby sú často stabilizované prítomnosťou vodíkových a iónových väzieb. Priemerne asi 50% štruktúry globulárneho proteínu vytvárajú opakujúce sa štruktúry ako α-helix alebo β-skladaný list. Zvyšok molekuly má kruhovú alebo otočnú konformáciu. Tieto neopakujúce sa sekundárne štruktúry nie sú náhodné, ale len sa menej často vyskytujú ako opakujúce sa štruktúry. Terciárna štruktúra proteínu vzniká ďalším skladaním domén sekundárnej štruktúry a môže predstavovať konečné usporiadanie určitých proteínov. Terciána štruktúra je podmienená primárnou štruktúrou proteínu. Štruktúra globulárnych bielkovín vo vodnom prostredí je kompaktná s veľkým nakopením atómov v centre molekuly. Hydrofóbne reťazce sú schované vo vnútri molekuly, zatiaľ čo hydrofilné skupiny nachádzame na povrchu molekuly. Domény sú základné funkčné a priestorové štruktúrne jednotky polypeptidov. Polypeptidy, ktoré obsahujú viac ako 200 aminokyselín všeobecne obsahujú dve a viac domén. Jadro domény tvorí usporiadanie sekundárnych štruktúr do rôznych motívov. Skladanie reťazce vo vnútri domény prebieha nezávisle na skladaní iných domén, preto každú doménu môžeme pokladať za malý, kompaktný globulárny proteíny, ktorý je štruktúrne nezávislí od ostatných domén v reťazci. Terciárna štruktúra bielkovín je stabilizovaná viacerými interakciami, napr. dislufidovými väzbami, vodíkovými mostíkmi, iónovými väzbami, hydrofóbnymi interakciami, etc. Disulfidové väzby sú kovalentné spojenia vzniknuté z –Sh skupín dvoch aminokyselín cysteínu za vzniku cystínu. Dve molekuly cysteínu môžu byť od seba oddelené viacerými aminokyselinami v primárnej štruktúre reťazca alebo môžu sa môžu nachádzať na dvoch rôznych reťazcoch, no skladaním reťazca sa k sebe cysteíny približujú a vytvárajú kovalentnú väzbu na svojich bočných reťazcoch. Disulfidová väzba napomáha stabilizovaniu priestorovej štruktúry bielkovinových molekúl a chráni ich pred denaturáciou v ectracelulárnom prostredí. Aminokyseliny s nepolárnym reťazcom sa snažia umiestniť dovnútra molekuly, kde vytvárajú asociácie s ostatnými hydrofóbnymi aminokyselinami – vznikajú tak hydrofóbne interakcie. Naopak, polárne aminokyseliny sa snažia umiestniť na povrch molekuly, kde majú kontakt s polárnym rozpúšťadlom (pri zmene rozpúšťadla na nepolárne však dôjde k otočeniu konformácie). V oboch prípadoch je rozdelenie aminokyselín spôsobené energetickou stabilitou. Aminokyseliny, ktoré v bočnom reťazci obsahujú funkčné skupiny s vodíkom viazaným na dusík alebo kyslík (treonín alebo serín) môžu vytvárať vodíkové väzby s elektronegatívnymi atómami peptidovej väzby (napr. kyslík). Vznik vodíkových väzieb medzi polárnymi skupinami na povrchu bielkoviny s polárnym rozpúšťadlom podmieňuje rozpustnosť kyseliny. Opačne nabité funkčné skupiny v bočných reťazcoch aminokyselín vedia navzájom interagovať za vzniku iónových interakcií (napr. medzi –COO - aspartátu a – NH 3 + lyzínu). Interakcie medzi jednotlivými bočnými reťazcami aminokyselín určuje ako sa dlhý polypeptidový reťazec poskladá do zložitého trojrozmerného tvaru funkčného proteínu. Skladanie proteínov sa odohráva v bunke počas niekoľkých sekúnd až minút. Počas skladania peptidu sú k sebe bočné reťazce aminokyselín priťahované alebo odpoudzované na základe ich chemických vlastností (aminokyseliny s opačným nábojom sa priťahujú a tie s rovnakým sa odpudzujú). Počas tohto procesu sa skúšajú všetky možné kombinácie interakcií aminokyselín, kým nedôjde k stavu, kedy priťahovanie aminokyselín prevláda nad ich odpudzovaním – vzniká tak správne poskladaný proteín s najnižšou energiou. Denaturáciou bielkovín nastáva rozloženie a dezorganizovanie sekundárnej a terciárnej štruktúry bielkoviny, pričom nedôjde k hydrolýze peptidových väzieb. Medzi denaturačné činitele patrí teplo, organické rozpúšťadlá, silné kyseliny a zásady, detergenty alebo ťažké kovy (Pb, Hg, Cd,...). Za určitých podmienok môže byť denaturácia vratná, tj. bielkovina sa poskladá naspäť do pôvodného zloženia po odstránení činiteľa. Avšak, väčšina proteínov po denaturácií ostáva permanentne dezorganizovaná. Denaturované proteíny sú často nerozpustné a preto sa vyzrážajú z roztoku. Mnohé bielkoviny sa skladajú z jedného polypeptidového reťazca a označujeme ich ako monomérne bielkoviny. Avšak, iné môžu obsahovať dve alebo viac reťazcov, ktoré môžu byť štruktúrne rovnaké alebo rozdielne. Usporiadanie týchto podjednotiek nazývame kvartérna štruktúra proteínu. Podjednotky spolu držia pomocou nekovalentných interakcií (napr. vodíkové mostíky, iónové väzby alebo hydrofóbne interakcie). Tieto podjednotky môžu byť tiež funkčne nezávislé alebo môžu spolupracovať (napr. v molekule hemoglobínu, kde väzba kyslíku na jednu podjednotku tetraméru podporuje afinitu ostatných podjednotiek ku kyslíku). Podjednotky, ktoré majú rovnakú funkciu, majú často rozdielnu primárnu štruktúru. Podľa funkcie môžeme bielkoviny deliť na:  Štrukturálne bielkoviny – sú zodpovedné za tvar a stabilitu buniek a tkanív, príkladom môže byť tropokolagén.  Históny – sú bázické proteíny organizujúce zbaľovanie DNA v bunkovom jadre a riadia transkripciu. Nukleozómy, ktoré sú základne kamene chromatínu, pozostávajú z komplexu histónov, ktoré sú ovinuté DNA (viac otázka IV/13).  Transportné bielkoviny – známym transportným proteínom je erytrocytárny hemoglobín, ktorý uľahčuje transport kyslíku a CO 2 medzi pľúcami a tkanivami. Krvná plazma obsahuje veľa proteínov s transportnými funkciami. Prealbumín (transtyretín) transportuje hormóny štítnej žľazy tyroxín a trijódtyronín. Iónové kanály a ďalšie integrálne membránové proteíny sprostredkúvajú transport iónov a metabolitov biologickými membránami.  Obranné bielkoviny – imunitný systém ochraňuje organizmus pred pôvodcami ochorení a látkami cudzími telu. Jena z dôležitých zložiek imunitného systému sú imunoglobulíny, ktoré ako protilátky podporujú imunitnú obranu.  Regulačné bielkoviny – v biochemických signálnych dráhach pôsobia proteíny ako signálne látky (hormóny) aj ako receptory hormónov. Ako príklad by sa dal uviesť komplex medzi rastovým faktorom somatotropínom a jeho receptorom. Extracelulárne domény dvoch receptorových molekúl sa pritom viažu s jednou molekulou hormón. Väzbou sa aktivujú cytoplazmatické domény komplexu a dochádza k postupu signálu do vnútra bunky. Inými príkladmi môže byť inzulín alebo transkripčné faktory. Transkripčné faktory sú proteíny viažuce sa na DNA, podieľajú sa rozhodujúcim spôsobom na pochodoch diferenciácie a riadení látkovej výmeny. Štruktúra a funkcie katabolitových aktivačných bielkovín a transkripčných faktorov sú preskúmané veľmi dobre..  Katalytické bielkoviny – so svojimi viac ako 2000 známymi zástupcami tvoria enzýmy najpočetnejšiu skupinu proteínov. Najmenšie enzýmy majú molekulovú hmotnosť 10-15 kDa. Tá sa pohybuje u stredne veľkých enzýmov ako napr. alkoholdehydrogenázy medzi 100-200 kDa, zatiľ čo u najväčších, medzi ktoré patrí aj glutamínsyntetáza, ktorá sa skladá z 12 podjednotiek, môže dosahovať aj viac než 500 kDa.  Motorické bielkoviny – súhra aktínu a myozínu je zodpovedná za svalovú kontrakciu a ďalšie pohybové pochody. Hexamérny myozín patrí svojou dĺžkou cez 150 μm k vôbec najdlhším proteínom. Aktínové filamenta (F-aktín) vznikajú polymerizáciou relatívne malých podjednotiek (G-aktínu). Tropomyozín a ďalšie bielkoviny, ktoré asociujú s F-aktínom, riadia kontrakciu.  Zásobné bielkoviny – v rastlinách sa nachádzajú zvláštne zásobné proteíny, ktoré sú dôležité pre ľudskú výživu, napr. glutén (lepok) v obilí. V zvieracích organizmoch tvoria svalové proteíny mobilizovateľnú rezervu pre prípad núdze. Podobne môže človek behom dlhšieho hladovania zaistiť zásobenie svojho organizmu glukózou odbúraním až 6 kg svalových bielkovín. I/31. Sacharidy, rozdělení, struktura, stereochemie, biologický význam. Sacharidy patria medzi dôležité živiny. U mnohých organizmov tvoria veľkú časť potravy, sú zásobárňou energie pre telo, sú súčasou alebo tvoria súčasť bunkovej membrány, ktorá napomáha medzibunkovej komunikácii (glykokalyx). Sacharidy môžu tiež tvoriť stavebnú jednotku tiel niektorých organizmov. Napríklad v bunkovej stene baktérii, exoskelete hmyzu alebo ako celulóza u rastlín. Behom trávenia sa všetky zložené sacharidy rozštiepia na monosacharidy. Kvantitatívne je najvýznamnejšia glukóza, ktorej degradácia predstavuje pre organizmus najrýchlejšiu cestu k uvoľneniu energie a teda k možnosti syntézy najdôležitejšieho prenášača energie – ATP. V priebehu tohto katabolického deja, glykolýzy, získava organizmus súčasne stavebný materiál pre budovanie vlastných dôležitých štruktúr – mastných kyselín a triacylglycerolov, ďalej glycerofosfolipidov, cholesterolu, glykoproteínov, proteoglykanov a glykolipidov. Organizmus využíva glukózu tiež pre syntézu zásobného polysacharidu glykogénu. Sacharidy sú karbonylové zlúčeniny obsahujúce v molekule väčší počet hydroxylových skupín. Rozdeľujú sa na monosacharidy, disacharidy, oligosacharidy a polysacharidy. Ako monosacharidy sú označované sacharidy, ktoré sa nedá už ďalej hydrolyticky štiepiť na menšie jednotky. Monosacharidy, bežne sa vyskytujúce v ľudskom organizme, obsahujú 3-9 uhlíkových atómov. Ich reťazením vznikajú disacharidy, ďalej oligosacharidy, tvorené 3-20 monosacharidmi a polysacharidy, v ktorých môže byť vzájomne viazaných až 10 5 monosacharidov. Pre monosacharidy je typická názvoslovná koncovka –óza. Výnimka existuje v prípade monosacharidov s tromi uhlíkmi, ktoré bežne používajú triviálne názvy – glyceraldehyd a dihydroxyacetón. Obe izomérne monosacharidy tvorené tromi uhlíkmi sa nazývajú triózy. Všeobecné názvy ďalej sledujú počet pribúdajúcich atómov uhlíku v monosacharide – tetrózy (4), pentózy (5), hexózy (6), heptózy (7), etc. Pre molekuly monosacharidov je charakteristická prítomnosť troch funkčných skupín – karbonylovej (>C=O), primárnej alkoholovej (-CH 2 OH) a sekundárnej alkoholovej (>CHOH). Podľa umiestnenia koarbonylovej skupiny na uhlíkovom reťazci sa monosacharidy rozdeľujú na dve základne skupiny – aldózy a ketózy. Aldózy majú aldehydovú funkčnú skupiny –CHO umiestnenú na začiatku reťazca (napr. glyceraldehyd). Tento najviac oxidovateľný uhlík aldóz má číslo 1. Ketózy, ktoré získali svoje pomenovanie podľa ketónov, majú karbonylovú skupinu vo vnútri reťazca(napr. dihydroxyacetón). V spojení s počtom uhlíkových atómov vznikajú presnejšie pomenovania monosacharidov, napr. aldopentóza alebo ketohexóza. Aldóza tvorená tromi atómami uhlíku – glyceraldehyd – má v svojej molekule atóm uhlíku C-2 substituovaný štyrmi rôznymi skupinami. V dôsledku prítomnosti tohto asymetrického (chirálneho) uhlíku je glyceraldehyd chirálnou molekulou a preto existuje v dvoch enantiomérnych formách – ako D- a L-glyceraldehyd, ktoré sú navzájom zrkadlovými obrazmi. Väčšina monosacharidov vyskytujúcich sa v prírode je odvodená od štruktúry D-glyceraldehydu. Majú na poslednom asymetrickom (refernčnom) atóme uhlíku rovnakú stereometrickú konfiguráciu ako D-glyceraldehy, patria teda do D-radu. Tiež izomérne ketózy, patriace ku konfiguračnému D-radu, majú na referenčnom uhlíku rovnaké usporiadanie substituentov ako D- glyceraldehyd s jedinou výnimkou: najjednoduchšia ketóza, dihydroxyacetón, nemá asymetrický uhlíka jej molekula nie je teda chirálna. Aldózy aj ketózy majú na atóme uhlíku s najvyšším číslom viazanú vždy primárnu alkoholovú skupinu. Rovnaká funkčná skupina je v ketózach viazané tiež na C-1. Viac o stereoizoméroch je napísané v otázke I/21. Iba malé množstvo molekúl pentóz a hexóz má vo vodnom roztoku voľnú karbonylovú skupinu. Ostatné molekuly týchto monosacharidov reaguje kabonylová skupina s hydroxylovou skupinou na C-5 alebo C-4 tej istej molekuly za vzniku intramolekulového poloacetálu (hemiacetálu). Výsledkom je šesťčlenný alebo päťčlenný cyklus obsahujúci jeden atóm kyslíku. V prvom prípade, kedy vzniká štruktúra podobná heterocyklu pyránu, preto sa táto cyklická molekula monosacharidu nazýva pyranóza. Monosacharid s päťčlenným cyklom sa analogicky nazýva furanóza. Vytvorenie cyklickej štruktúry je spojené s vznikom ďalšieho chirálneho (asymetrického centra) na C-1 v prípade aldózy (glukóza). Ak cyklickú formu vytvorí ketóza (fruktóza), je nové asymetrické centrum na uhlíku C-2. Tieto uhlíky sa nazývajú anomérne, obe možné priestorovo odlišné formy sa označujú ako anoméry (α- anomér a β-anomér). Alfa-anoméry a beta- anoméry jedného monosacharidu nie sú navzájom enantiomérmi, pretože sa líšia konfiguráciou iba na jednom C-atóme a nie sú teda zrkadlovými obrazmi. Hydroxylové skupiny na anomérnych uhlíkoch, označované ako poloacetálové (hemiacetálové, anomérne) hydroxylové skupiny, sa vyznačujú veľkou reaktivitou. Na vedľajšom obrázku sú zobrazené rôzne formy D-glukózy a D-fruktózy za použitia Fisherovho (nezobrazuje poloacetál), Tollensovho (zobrazuje poloacetál) a Haworthového (zobrazuje cyklickú formu) vzorca. Z obrázku sú zrejme pravidlá spôsobu prekresľovania polohy hydroxylových skupín: -OH skupina vo Fisherovom vzorci zakreslená vpravo sa v Haworthovej projekcii prekresľuje pod rovinu kruhu. Ľavá –OH skupina je v cyklickej forme monosacharidu umiestnená nad rovinu kruhu. Pyránový kruh neleží v rovine, ale najčastejšie zaujíma tzv. židličkovú konformáciu, menej často zaujíma tzv. vaničkovú konformáciu. Monosacharidy sú biele kryštalické látky, ktoré sú vzhľadom k prítomnosti mnohých polárnych skupín dobre rozpustné vo vode. Z veľkého počtu prírodných monosacharidov je len niekoľko štruktúr obzvlášť významných pre organizmus – buď ako také alebo vo forme ich derivátov. Väčšina monosacharidov dôležitých pre ľudský organizmus má D- konfiguráciu. Triózy sú monosacharidy tvorené tromi uhlíkmi, ide o najjednoduchšie sacharidy. Izomérne triózy vznikajú v organizme vo svojej fosforylovanej forme predovšetkým ako metabolity glykolýzy po štiepení šesťuhlíkovej štruktúry D-glukózy. Najvýznamnejšími a jedinými triózami sú glyceraldehyd a dihydroxyacetón. Obe triózy sú vzájomne v rovnováhe, jedna štruktúra môže prechádzať v druhú pôsobením enzýmu izomerázy. Sú zdrojom acetylkoenzým A napr. pre citrátový cyklus, biosyntézu mastných kyselín a cholesterolu. Tiež jedna zložka tukov – glycerol majú pôvod v týchto triózach. Tetrózy sú monosacharidy tvorené štyrmi uhlíkmi. Nie sú veľmi významné, najvýznamnejším zástupcom je erytróza, ktorej derivát erytróza-4-fosfát je medzičlánkom pentózového cyklu. Pentózy sú monosacharidy tvorené piatimi uhlíkmi. Najdôležitejšou aldopentózou je D-ribóza, ktorá tvorí jednu z troch základných zložiek RNA a nukleotidov (viac otázky IV/11 a IV/12). Jej izomér, ketopentóza D-ribulóza, je produktom alternatívnej metabolickej dráhy katabolizujúcej glukózu – pentózový cyklus. Po izomerizácii poskytuje D-ribózu potrebnú pre biosyntézu nukleotidov. D- arabinóza, epimér D-ribózy, nie je v ľudskom organizme prirodzený sacharid, Táto skutočnosť je využívaná v chemoterapii nádorov a vírusových infekcii podávaním syntetického analógu nukleotidu cytozínu – cytarabínu, v ktorom je ribóza nahradená arabinózou. Hexózy sú monosacharidy tvorené šiestimi uhlíkmi. Najrozšírenejšou aldohexózou je D-glukóza. Je stavebným kameňom dôležitých polysacharidov – glykogénu, škrobu a celulózy. Voľná glukóza sa vyskytuje v ovocí (hroznový cukor), medu a ako „krvný cukor“ v krvi vyšších živočíchov. Je tiež viazaná v glykolipidoch. Dôležitú úlohu v organizme hrajú aj epiméry glukózy (t.j. monosacharidy, ktoré sa líšia od glukózy konfiguráciou iba na jednom atóme uhlíku) – D-galaktóza a D-manóza. D- galaktóza je súčasťou mliečneho cukru cicavcov – disacharidu laktózy (s glukózou) – a spoločne s D-manózou sa pravidelne vyskytuje v glykoproteínoch. Tiež glykolipidy prítomné v nervovom tkanive obsahujú galaktózu. Z ketohexóz má najdôležitejšiu úlohu D-fruktóza. Voľná sa vyskytuje v ovocí (ovocný cukor) a v mede, viazaná v disacharide sacharóze spoločne so svojím štruktúrnym izomérom glukózou. V ľudskom organizme je v svojej fosforylovanej forme dôležitým metabolitom glykolýzy a ďalších metabolitom glykolýzy a ďalších metabolických dráh. I/32. Reakce a deriváty monosacharidů, disacharidy, O- a N- glykosidová vazba, příklady. Cukry sa v metabolizme vyskytujú v mnohých podobách (derivátoch), ktoré vznikajú reakciami monosacharidov. Príklady reakcii by sa dali ukázať na D-glukóze: 1. Mutarotácia – na rozdiel od otvorených foriem je C-1 uhlík aldóz v cyklickej forme chirálnym centrom molekuly. Odpovedajúce izoméry sa nazývajú anoméry. V β-anoméroch sú -OH skupiny na C-1 (anomérne OH-skupiny) a skupina CH 2 OH (C-6) na rovnakej strane kruhu, v α-anoméroch sú na opačných stranách. Reakcia, pri ktorej sa jeden anomér premeňuje na druhý sa nazýva mutarotácia. 2. Redoxné reakcie – redukciou anomérneho centra na C-1 vzniká cukorný alkohol sorbitol. Oxidáciou aldehydovej skupiny na C-1 vzniká glukonolaktón, vnútorný ester (laktón) kyseliny glukónovej. Tieto reakcie majú významnú úlohu pri biotransformáciach v pečeni. 3. Glykozidová väzba – ak anomérna -OH skupina cukru reaguje s alkoholom, vznikne odštiepením vody O- glykozid (v tomto prípade α-metylglykozid). Glykozidová väzba sa líši od bežne éterovej väzby, lebo –OH skupina na C-1 si zachováva poloacetálový charakter. O-glykozidovú väzbu obsahujú aj oligosacharidy a polysacharidy. Reakciou anomérnej -OH skupiny so skupinou –NH 2 alebo –NH vznikajú N-glykozidy. 4. Epimerizácia – v slabo zásaditom prostredí je D-glukóza v rovnováhe cez endiolový medziprodukt s D-fruktózou a D-manózou. Glukóza a manóza sa líšia len v konfigurácii na C-2. Podobné páry cukrov sa označujú ako epiméry, premena jedného epiméru na druhý sa nazýva epimerizácia. 5. Esterifikácia – hydroxylové skupiny monosacharidov môžu vytvárať estery s kyselinami. V metabolizme ide predovšetkým o estery kyseliny fosforečnej (fosforylácia) ako sú napr. glukóza-6-fosfát a glukóza-1-fosfát. Medzi hlavné deriváty monosacharidov patria estery, glykozidy, aminoderiváty, urónové kyseliny, aldolové kyseliny, alditoly a halogénderiváty. Estery vznikajú reakciou –OH skupiny sacharidu s kyselinou. Z pohľadu meabolických dráh sú ich najdôležitejšími estermi estery s kyselinou tri hydrogénfosforečnou, ktorá vytvára esterovú väzbu s jednou alebo dvomi hydroxylovými skupinami monosacharidov. Vo forme fosforylovaných derivátov (fosfátov) majú monosacharidy väčšinou dostatočnú reaktivitu, aby mohli vstupovať do biochemických dejov. Príkladom fosforylovaného monosacharidu je glukóza-6fosfát (Glc-6-P, Robinsonov ester), kľúčový medziprodukt v metabolizme sacharidov. Medzi ďalšie estery patria glukóza-1-fosfát (Glc- 1-P, Coriho ester), fruktóza-6-fosfát (Fru-6-P, Neubergov ester), fruktóza-1,6-bisfosfát (Fru-1,6-BP. Harden- Youngov ester). Fosforečné estery monosacharidov hrajú významnú úlohu aj v štruktúre nukleotidov a nukleových kyselín. Nukleotidy majú esterifikovanú –OH skupinu na uhlíku C-5 ́ ribózy alebo deoxyribózy. V nukelových kyselinách je pre spojenie jednotlivých nukleotidov využitá diesterová väzba na uhlíkoch C-3 ́ a C-5 ́ medzi dvomi molekulami ribózy (RNA) alebo deoxyribózy (DNA). Diesterová väzba kyseliny fosforečnej a ribózy môže byť tiež intramolekulárna a vedie k vzniku cyklickej štruktúry – napr. cyklického adenozín-3 ́,5 ́- monofosfátu (cAMP), významného pre reguláciu bunkových dejov. Pre štruktúru a teda aj vlastnosti heteropolysacharidov sú významné tiež estery monosacharidov a kyseliny sírovej. Obe typy esterov, fosfáty aj sulfáty, sú za fyziologických podmienok disociované a existujú ako anióny. Glykozidy sú deriváty monosacharidov, veľmi významné pre štruktúru oligo- a polysacharidov. Je možné ich odvodiť reakciou medzi anomérnnou hydroxyskupinou monosacharidu a hydroxylovou skupinou ďalšieho monosacharidu (prípadne necukornou -OH skupinou, aglykon) za súčasnej eliminácie molekuly vody. Poloacetálová hydroxylová skupina môže reagovať vo forme α-anoméru alebo β-anoméru. Taká glykozidová väzba sa označuje ako α- alebo β-O-glykozidová väzba a vzniknutý derivát ako O-glykozid. Do glykozidovej väzby môže miesto atómu kyslíku vstúpiť z aglykonu atóm dusíku, vznikajúca väzba sa nazýva N-glykozidová a odpovedajúci derivát N-glykozid. Tentotyp väzby je charakteristický pre vytvorenie nukleozidu, teda väzby medzi C-1 ́ribózy (alebo deoxyribózy) a dusíkom pyrimidínovej alebo purínovej bázy. Aminoderiváty sú pre ľudský organizmus významné deriváty, ktoré majú –OH skupinu na C-2 uhlíku monosacharidu nahradenú aminoskupinou, ktorá je väčšinou acetylovaná kyselinou octovou. Vzniká tak zlúčenina, N-acetylaminoderivát, ktorá je z pohľadu organickej chémie amid kyseliny octovej. Najdôležitejšími z týchto derivátov sú N-acetyl-D-glukozamín (GlcNAc) a N-acetyl-D-galaktozamín (GalNAc), charakteristické zložky sacharidového podielu heteropolysacharidov a glykolipidov. Okrem týchto jednoduchých glykosamínov sa v sacharidovej zložke glykoproteínov vyskytujú aj kyseliny sialové. U človeka prevažuje kyselina N- acetylneuraminová (NeuAc). Karboxylová skupina prítomná v molekule radí túto zlúčeninu tiež medzi kyslé sacharidové deriváty. Kyselina N-acetylneuramínová je tiež súčasťou gangliosidov, tj. glykosfingolipidov prítomných vo veľkom množstve v nervovom tkanive. Urónové kyseliny sú produkty dehydrogenácie (oxidácie) primárnej alkoholovej skupiny na poslednom uhlíku, u aldohexóz teda na C-6. Pretože aldehydová funkcia je zachovaná , majú tieto deriváty cyklickú štruktúru vrátane anomérnej hydroxylovej skupiny. Môžu teda vytvárať glykozidy nazývané glykoziduronáty. Kyselina D-glukurónová (GlcUA) je spoločne s glykozamínmi typickou stavebnou jednotkou heteropolysacharidov. Kyselina glukurónová má tiež dôležitú úlohu v detoxikačných reakciách v pečeni, ktoré umožňujú vylučovanie cudzorodých a odpadných látok z organizmu. Ak má vylučovaná látka v molekule hydroxyskupinu, môže vytvárať reakciou d anomérnym hydroxylom kyseliny glukurónovej glukoziduronáty. Hydroxyskupina vylučovanej látky môže tiež reagovať s karboxylom kyseliny glukurónovej za vzniku esterov. Estery môžu ale vznikať aj opačne – ak má vylučovaná zlúčenina karboxylovú skupinu, vytvára ester s anomérnym hydroxylom kyseliny glukurónovej. Vo všetkých prípadoch je výsledná zlúčenina dobre rozpustná vo vode vďaka polárnym skupinám v molekule kyseliny glukurónovej a z organizmu sa môže vylúčiť močom. Aldonové kyseliny, na rozdiel od urónových kyselín, vznikajú dehydrogenáciou (oxidáciou) aldehydovej skupiny na C- 1. Metabolicky významné sú dve aldonové kyseliny – kyselina D-glycerová a kyselina D-glukónová. Kyselina D- glycerová vzniká dehydrogenáciou D-glyceraldehydu ako významný medziprodukt v glykolýze. Kyselina D-glukónová je metabolit oxidačnej časti pentózového cyklu, vznikajúci c dvoch krokoch. Dehydrogenácia glukopyranózy poskytne δ-D-glukonolaktón, t.j. vnútorný ester kyseliny D-glukónovej. Pri nasledujúcej hydrolýze sa uvoľní karboxylová skupina kyseliny D-glukónovej. Všetky reakcie sú v organizme katalyzované enzýmami a prebiehajú na úrovni fosforečných esterov. Aldioly (alebo tiež cukorné alkoholy) vznikajú redukciou karbonylovej skupiny sacharidu. V prípade aldóz je redukovaná aldehydová skupina na C-1 za vzniku primárnej alkoholovej skupiny, v prípade ketóz je redukovaná ketónová skupina za vzniku sekundárneho alkoholu. D-glukóza a D-fruktóza poskytujú redukciou rovnaký alditol – D-sorbitol (D-glucitol), ktorý má určitý metabolický význam a tiež slúži ako náhradné sladidlo pod názvom sorbit. Halogénderiváty nepatria medzi prirodzené monosacharidy. Fluórderivát 2-deoxy-2-fluor-D-glukóza (FDG) má v poslednej dobe význam v diagnostickej metóde označovanej ako pozitronová emisná tomografia (PET). Metóda je založená na jednoduchom vstupe FDG do bunky vzhľadom na jeho štruktúrnej podobnosti s glukózou. Po vstupe do buniek sa FDG hromadí, pretože sa nemôže metabolizovať. Ak sa požije na prípravu FDG radioizotop 18 F, je možné pomocou PET odhaliť nádorový rast, kontrolovať úspešnosť jeho liečby, sledovať lokalizáciu cheorobných ložisiek v mozgu alebo hodnotiť metabolické pomery pri infarkte myokardu. Disacharidy sú tvorené dvoma monosacharidmi spojenými O-glykozidovou väzbou. Pretože v prírode vznikajú reakciami enzymovo katalyzovanými, a teda stereošpecifickými, vyskytujú sa prírodné disacharidy iba v jednej z dvoch možných konfigurácii poloacetálovej hydroxylovej skupiny v glykozidovej väzbe a teda buď α alebo β konfigurácii. Disacharidy prijaté potravou sú v tráviacom systéme ľudského organizmu štiepené na monosacharidy účinkom enzýmov –glykoziláz – lokalizovaných na vonkajšom povrchu buniek kartáčkového lemu tenkého čreva. Fyziologicky významný zástupcovia disacharidov sú sacharóza, laktóza a maltóza. Sacharóza a lakóza sú dôležitou zložkou potravy, maltóza je produktom enzýmovej hydrolýzy prijatého škrobu. Iní zástupcovia disacharidov sú trehalóza v rastlinách, hubách a hmyze; a celobióza, stavebná zložka celulózy – obe tvorené spojením dvoch glukóz. Hlavným zástupcom neredukujúcich disacharidov je sacharóza. Sacharóza je transportnou formou sacharidov v rastlinách a slúži tiež ako ich rozpustná rezerva sacharidov. Pre súčasnú civilizáciu predstavuje dôležitú súčasť výživy. Získava sa z rastlín, v ktorých je sacharóza vo veľkej koncentrácii – z cukrovej repy a trstiny. Tiež glukóza a frukóza v mede majú pôvod v rastlinnej sacharóze. Sú produkované v traviacom systéme včiel enzýmovou hydrolýzou sacharózy z nektáru kvetov. O-glykozidová väzba medzi glukózou a fruktózou v sacharóze je sprostredkovaná α-anomérnym hydroxylom glukózy a β-anomérnym hydroxylom fruktózy. Vzniknutá väzba je označovaná ako α(1→2). Pretože ani jeden monosacharid si nezachováva voľný anomerný hydroxyl, nemá sacharóza redukčné vlastnosti, ktoré sú dôsledkom prítomnosti voľnej anomernej (poloacetálovej) hydroxylovej skupiny. Toto spojenie v disacharide je menej časté. Typickými predstaviteľmi redukujúcich disacharidov sú lakóza a maltóza. Laktóza, mliečny cukor vyskytujúci sa v mlieku cicavcov (kravské mlieko obsahuje 4,5% laktózy, ľudské mlieko až 7,5%), je tvorená galaktózou a glukózou. Galaktóza vytvára O-glykozidovú väzbu svojím β-anomérnym hydroxylom, glukóza poskytuje hydroxyl viazaný na C-. V molekule laktózy zostáva teda voľný anomérny hydroxyl a preto má redukčné vlastnosti. Maltóza je disacharid vznikajúci enymatickou hydrolýzou škrobu, v prírode sa voľne nevyskytuje. Spojenie dvoch molekúl glukózy v maltóze je analogické ako v laktóze – iba jeden monosacharid poskytuje do glykozidovej väzby poloacetálový hydroxyl, preto aj maltóza má redukujúce účinky Poloacetálový hydroxyl v glykozidovej väzbe má v tomo prípade konfiguráciu α. Konfigurácia glykozidovej väzby je veľmi dôležitá, pretože enzýmy sú stereošpecifické a konfiguráciu väzby prísne rozlišujú. I/33. Homopolysacharidy a heteropolysacharidy, struktura, výskyt a význam v organismu. Polysacharidy sú vysokomolekulárne látky tvorené veľkým počtom monosacharidových jednotiek, buď rovnakých (homopolysacharidy) alebo rôznych (heteropolysacharidy). Monosacharidy sú spojené glykozidovými väzbami, vznikajúce reťazce sú buď rozvetvené alebo nerozvetvené. Väčšina prírodných polysacharidov nie sú chemické indivídua, ale zmesou líšiacich sa molekulovou hmotnosťou. Na rozdiel od disacharidov sú polysacharidy väčšinou nerozpustné v studenej vode, niektoré z nich tvoria v horúcej vode koloidné roztoky alebo gély. Homopolysacharidy sa skladajú z reťazcov rovnakých monosacharidových jednotiek. Najdôležitejšie homopolysacharidy a polysacharidy vôbec sú škrob, glykogén a celulóza. Sú tvorené iba glukózou, preto sa nazývajú glukany. V prírode sa vyskytujú v obrovskom množstve. Napr. celulóza, štrukturálny polysacharid rastlín, je dokonca najhojnejšie sa vyskytujúca prírodná organická zlúčenina. Škrob je zásobný polysacharid rastlín, uložený vo forme granúl v bunkách listov, semien a hľúz, z ktorého je v prípade potreby odštiepená glukóza. V porovnaní veľkého počtu voľných molekúl glukózy s rovnakým počtom molekúl glukózy viazaných v škrobe (rádovo 10 2 ) sú polymérne molekuly škrobu osmoticky inaktívne. Pre človeka predstavuje škrob nutrične najdôležitejší sacharid. Škrob je zmes dvoch typov polymérov – amylózy (20%) a amylopektínu (80%). Amylóza má nerozvetvený reťazec tvorený molekulami glukózy spojenými O-glykozidovou väzbou α-(1→4). Vďaka α-konfigurácii na C- 1 vytvára amylóza hélix, ktorého štruktúra je stabilizovaná intramolekulárnymi vodíkovými väzbami. Amylóza je rozpustná vo vode. Amylopektín má rozvetvený reťazec, ktorý je vo vode nerozpustný. Základný reťazec amylopektínu má rovnakú štruktúru ako amylóza, ale po 20-30 glukózových jednotkách je reťazec vetvený väzbou α-(1→6), štruktúra polyméru pripomína strom. Amylóza aj amylopektín majú iba na jednej koncovej molekule glukózy voľný poloacetálový hydroxyl (ostatné glukózové jednotky majú anomérny hydroxyl zapojený do glykozidovej väzby), toto miesto je označené ako redukujúci koniec polyméru. Všetky ostatné konce sa označujú ako neredukujúce. Glykogén je zásobný polysacharid živočíšnych buniek, z ktorého môže byť v prípade fyziologickej potreby uvoľňovaná glukóza. Skladovanie glukózy vo forme glykogénu je rovnako ako v prípade škrobu veľmi výhodné z osmotických dôvodov. Glykogén má molekulovú stavbu rovnakú ako amylopektín, ale vetvenie reťazca je hustejšie, väčšinou po 12 glukózových jednotkách. Má taktiež iba jeden redukujúci koniec. Ľudský organizmus môže skladovať až 450g glykogénu, asi tretinu v pečeni a zvyšok je uložený v svaloch. Svalový glykogén predstavuje energetickú rezervu, glykogén v pečeni slúži predovšetkým na udržiavanie fyziologickej koncentrácie glukózy v krvi. Celulóza je štruktúrny polysacharid rastlín a je postavená z glukózových jednotiek (rádovo 10 4 ) spojených O- glykozidovou väzbou, ale tento krát β-(1→4). Tato zmena konformácie v molekule monoméru spôsobuje zásadnú zmenu v usporiadaní výsledného polyméru a samozrejme tiež zmenu jeho vlastností. Celulóza vytvára nevetvené lineárne reťazca, spevnené intramolekulárnou vodíkovou väzbou. Je to ideálne usporiadanie pre vznik vláken, do ktorých sa jednotlivé reťazce polyméru spájajú intermolekulárnymi vodíkovými väzbami. Celulóza je pre človeka, podobne ako pre veľa iných cicavcov, nestráviteľná. Príčinou je chýbajúca hydroláza, ktorá by vedela štiepiť β-(1→4) glykozidové väzby v tomto polyméri. Celulóza je preto významným zdrojom objemného nestráviteľného zvyšku v potrave (vlákniny), ktorý priaznivo pôsobí na trávenie. Okrem týchto hetropolysachridov sú významné aj iné polysacharidy s inou opakujúcou sa jednotkou v reťazcoch. Významný je bakteriálny polysacharid dextrán. Ide o polymér glukózy s väzbami α-(1→6) a vetvením α-(1→3). S vodou vytvárajú dextrány viskózne gély, ktoré sa používajú v chémii pri chromatografickom oddeľovaní makromolekúl. Dextrány sa používajú tiež ako zložka roztokov pre náhradu krvi (plazma expandérov) a niektorých potravín. Inulín, polymér glukózy, sa používa ako náhrada škrobu v diéte diabetikov. Okrem tohto slúži ako testovacia látka pre určenie renálneho clearance. Chitín, homopolymér N- acetylglukozamínu s väzbami β-(1→4), je dôležitou látkou panciera (krunýře) hmyzu a rakov. Ide o hlavný živočíšny polysacharid. Okrem toho sa nachádza v bunkovej stene húb. Heteropolysacharidy (heteroglykany) sú tvorené rôznymi monosacharidmi, prípadne ich derivátmi. Najdôležitejšie heteropolysacharidy v ľudskom tele sú glykozaminoglykany s nerozvetveným reťazcom, ktoré obsahujú až niekoľko tisíc monosacharidových jednotiek. Najčastejšie zastúpené glykozamíny sú glukosamín alebo galaktosamín, ktorých aminoskupina je esterifikovaná kyselinou octovou alebo sírovou. Z urónových kyselín je bežnou zložkou glykozaminoglykánov kyselina D-glukurónová alebo jej C-5 epimér kyselina L-iurónová (IdoUA). Kyselina L-iduronová ale vzniká až v hotovom polysacharide epimeráciou kyseliny D- glukurónovej na C-5. V reťazcoch glykozaminoglykánov sa opakujú disacharidové jednotky, ktoré obsahujú glykoamíny a uronové kyseliny v konformácii α alebo β. Sú navzájom pospájané nielen glykozidovou väzbou (1→4), ale tiež väzbou (1→3). Hydroxyskupiny týchto sacharidov sú často esterifikované kyselinou sírovou. Vzniknuté sulfáty spoločne s karboxylovými skupinami uronových kyselín sú príčinou kyslých vlastností glykozaminoglykánov, ktoré za fyziologických podmienok tvoria polyvalentné anióny. Kyselina hyaluronová je jednoduchý neesterifikovaný glykozaminoglykan, ktorý sa skladá z disacharidových jednotiek N- acetylglukosaminu a kyseliny glukuronovej. Obe cukry sú spojené väzbami β-(1→4) a β-(1→3), Vďaka nezvyčajným väzbám β- (1→3) majú molekuly kyseliny hyaluronovej, často zostavené z niekoľko tisíc sacharidových zvyškov, helikálnu konformáciu. Karboxylové skupiny kyseliny glukuronovej smerujú von a viažu ióny Ca 2+ . V dôsledku veľkého počtu polárnych skupín viaže veľké množstvo vody, čím vznikajú gély. Kyselina hyaluronová je dôležitou zložkou extracelulárnej matrix, synoviálnej tekutiny kĺbov, očného sklovca (1% kyseliny hyaluronovej a 98% vody), atď. Medzi ďalšie významné heteropolysacharidy patrí bakteriálny mureín alebo agaróza z morských rias. Agaróza sa používa predovšetkým k výrobe gélov. V mikrobiológii sa agaróza používa už viac ako 100 rokov k spevneniu živných pôd (tzv. agar-agar). Prídavkom polysacharidov z rias do kozmetických výrobkov a potravín sa upravuje konzistencia týchto prípravkov. Na rozdiel od kyseliny hyaluronovej sú ostatné glykozaminoglykany kovalentne viazané na bielkoviny a vytvárajú komplexnú štruktúru – proteoglykany (viac otázka I/34). I/34. Proteoglykany, glykoproteiny, struktura, vlastnosti, příklady. Mnoho bielkovín a väčšina secernovaných proteínov nesie na vonkajšom povrchu plazmatickej membrány kovalentne naviazané oligosacharidové zvyšky, ktoré po translácii pripájajú v endoplazmatickom retikule a Golgiho aparáte. Naopak cytoplazmatické bielkoviny sú glykosylované len zriedka. Glykoproteíny (glykany, glykokonjugáty) môžu obsahovať aj viac ako 70% sacharidovej zložky, a keď väčšinou bielkovina prevažuje. Podľa typu väzby s proteínom ich delíme do dvoch skupín: na N- a O- glykosylované. Ak ide o oligosacharidové štruktúry pripojené N-glykozidovou väzbou, rozoznávame dva typy, ktoré sa líšia spôsobom biosyntézy. Pri glykosylácii v endoplazmatickom retikule sa na proteín najprv naviaže jeden oligosacharid, na ktorý sa pripojí šesť zvyškov manózy a nakoniec tri zvyšky glukózy. Jednoduchší typ oligosacharidov (typ bohatý na manózu) vzniká, ak sa z primárneho produktu odštiepia zvyšky glukózy a už sa nepripájajú žiadne ďalšie zvyšky. Druhou možnosťou je, že sa odštiepia aj manózové zvyšky a sú nahradené inými cukrami. Týmto spôsobom získame oligosacharidy iného typu (komplexný typ). Glykoproteíny komplexného typu často obsahujú na konci štruktúry zvyšky kyseliny N-acetylneuramínovej, ktoré oligosacharidovej zložke dodávajú záporný náboj. Určité glykoproteíny na vonkajšom povrchu buniek a veľké secernované proteíny majú sacharidový zvyšok naviazaný nie N- glykozidovou väzbou na zvyšok asparagínu, ale O-glykozidovou väzbou so serínom alebo treonínom. Tento spôsob napojenia je menej častý. Tieto glykopoteíny sú prítomné napr. v mucínoch, ktoré obsahujú 50-80% sacharidov alebo v časti LDL-receptoru, ktorá je v blízkosti bunkovej membrány. Rovnako disacharidové zvyšky kolagénu sú naviazané O-glykozidovou väzbou na hydroxylizínové zvyšky. Všetky glykosaminoglykany, okrem kyseliny hyaluronovej, môžu byť naviazané kovalentne na proteín, čím vznikajú proteoglykany Proteoglykany v chrupavke sa skladajú zo základného proteínu, na ktorý je kovalentne naviazaný lineárny glykosaminoglykánový reťazec. Tieto reťazce, ktoré môžu obsahovať aj viac ako 100 monosacharidových jednotiek, odstupujú zo základného proteínu a sú od seba oddelené pomocou odpudzovania nábojov. Konečná štruktúry pripomína „karáček na čištění lahví“. Chrupavkové glykosaminoglykany obsahujú chondroitín sulfát a keratán sulfát. Proteoglykany sa zoskupujú do génových rodín, ktoré kódujú základné bielkoviny s podobnými štrukturálnymi vlastnosťami. Príkladom môže byť rodina aggrekanov (aggrekan, versekan, neurokan a brevikan), ktoré sú rozšírené v chrupavke. Väzba medzi sacharidovým reťazcom a proteínom najčastejšie vzniká medzi trihexozidom (glaktóza-galaktóza-xylóza) a serínovým zvyškom proteínu. Vzniká tam O- glykozidová väzba medzi xylózou a hydroxlovou skupinou serínu. Proteoglykanové monoméry môžu asociovať s kyselinou hyaluronovou za vzniku proteoglyanových agregátov. Väzba medzi nimi nie je kovalentná, ale vzniká hlavne na základe iónových interakcií medzi kyselinou hyalurónovou a základnými proteínmi. Táto väzba je tiež stabilizovaná pomocou ďalších malých proteínov, nazývaných spojovacie proteíny. I/35. Lipidy − klasifikace, struktura, vlastnosti, funkce v organismu. Lipidy tvoria rôznorodú skupinu látok biologického pôvodu, ktoré sa dobre rozpúšťajú v organických (nepolárnych) rozpúšťadlách ako sú metanol, acetón, chloroform alebo benzén. Vo vode sú naopak nerozpustné alebo veľmi zle rozpustné. Zlá rozpustnosť vo vode je daná tým, že obsahujú málo polarizujúcich atómov ako O, N, S alebo P. Lipidy majú v tele veľa významov: 1. Zdroj energie – v strave slúžia lipidy ako zdroj energie. Z kvantitatívneho hľadiska sú najdôležitejšou zásobarňou energie živočíchov. Lipdiové kvapôčky zložené predovšetkým z netrálnych tukov sú uložené v špecializovaných bunkách, adipocytoch. Podľa potreby môžu poskytovať mastné kyseliny, ktoré sa transportujú do tkanív a vnich sa za prítomnosti kyslíku oxidujú na vodu a oxid uhličitý. Pritom sa tvoria redukované koenzýmy, ktoré sa zužitkujú v dýchacom reťazci za vzniku ATP. 2. Stavebné súčasti – amfipatické lipidy sú stavenými prvkami membrán (viac otázka III/35). Medzi typické membránové lipidy patria fosfolipidy, glykolipidy a cholesterol. Tuky sú len mierne afmipatické a preto sa v membránach nenáchadzajú. 3. Izolácia – lipidy majú výborne izolačné vlastnosti. U vyšších živočíchov ich preto nájdeme v podkožnom väzive a tiž okolo niektorých orgánov, kde slúžia ako tepelné izolátory, Ako významná zložka bunkovej membrány sa podieľajú tiež na elektrickej izolácii buniek voči okoliu. Zlá priepustnosť lipidových membrán pre ióny umožňuje vznik membránových potenciálov. 4. Ďalšie významy – určité lipidy získali v organizme zvláštne postavenie. Steroidy, eikosanoidy a niektoré metabolity fosfoilipov majú signálne funkcie. Slúžia ako hormóny, mediátory a druhí poslovia. Ďalšie lipidy vytvárajú lipidové kotvy, ktorými sa bielkoviny zachycujú do membrán. Lipidy fungujú ajako kofaktory enzymatických reakciách, ide napr. o vitamín K alebo ubichinón. Existuje mnoho spôsobov klasifikácie lipidov, niektoré jednoduché, iné veľmi komplikované. Pri klasifikácii a triedení lipidov sa väčšinou vychádza z týchto kritérii, no žiadne nemá absolútnu platnosť: 1. Rozpustnosť v nepolárnych rozpúšťadlách 2. Prítomnosť esterifikovaných mastných kyselín 3. Rovnaký metabolický základ (acetyl-CoA) 4. Spoločné alebo podobné využitie organizmom Klasifikácia uvedené v učebnice Matouš: Základy lékařské chémie a biochémie vychádza z chemickej štruktúry lipidov a lipidy rozdeľuje do štyroch skupín na:  Mastné kyseliny  Lipidy obsahujúce v svojej molekule glycerol  Lipidy neobsahujúce glycerol  Lipidy kombinované s inými skupinami látok Učebnica Koolman: Barevný atlas biochemie rozdeľuje tuky na hydrolyzovateľné a nehydrolyzovateľné lipidy. Hydrolyzovateľné lipidy podliehajú hydrolytickému štiepeniu a ich stavebné zložky sú spojené esterovými väzbami, ktoré je možné enzymatický alebo chemicky rozštiepiť. Radia sa medzi ne jednoduché estery, fosfolipidy, sfingolipidy a glykolipidy. Jednoduché estery zahŕňajú tuky (triacylglyceroly, ktoré sa skladajú z 1 glycerolu a 3 acylových zvyškov), vosky (1 mastný alkohol + 1 acylový zvyšok) a estery sterolov (1sterol + 1 acylový zvyšok). Fosfolipidy sú komplexné estery obsahujúce fosfátové kyseliny. Do tejto skupiny patria kyseliny fosfatidové (1 glycerol + 2 acylové zvyšky + 1 fosfát) a fosfatidy (1 glycerol + 2 mastné kyseliny + 1 fosfát + 1aminoalkohol). Vo sfingolipidoch je glycerol a 1 acylový zvyšok nahradený sfingozínom. V glykolipidoch je fosfát sfingolipidu nahradený jedným alebo viacerými sacharidmi (1 sfingozín + 1 mastná kyselina + 1 cukor). Zástupcami tejto skupiny sú cerebrozidy (1 sfingozín + 1 mastná kyselina + 1 cukor) a gangliozidy (1 sfingozín + 1 mastná kyselina + viac cukrov, hlavne kyselina neuramínová). Alternatívne sa môžu hydrolyzovateľné lipidy rozdeliť podľa ich základnej zložiek na glycerolipidy a sfingolipidy Medzi nehydrolyzovateľné lipidy patria uhľovodíky (alkány a karotenoidy), lipidové alkoholy (alkoholy s dlhým reťazcom , cyklické steroly (cholesterol) a steroidy (estradiol alebo testosterón)), lipidové kyseliny (mastné kyseliny, eikosanoidy). Triacylglyceroly (TAG) sú najrozšírenejšou skupinou lipidov obsahujúcich glycerol a patria do skupiny neutrálnych tukov. Triacylglyceroly sú estery mastných kyselín a glycerolu (propán-1,2,3-triol). V molekule glyceroli môže byť esterifikovaná jedna, dve alebo tri hydroxylové skupiny. Vznikajú tak mono-, di- a tri-acylglyceroly. Jednotlivé triacylglyeroly môžu mať vštky tri mastné kyseliny rovnaké alebo rozdielne. Najväčšie zastúpenie mastných kyselín patrí kyseline palmitovej, steárovej a olejovej. Prakticky všetky triacylglyceroly sú nerozpustné vo vode a dobre rozpustné v nepolárnych rozpúšťadlách. Hustota triacylglycerolov je všeobecne nižšia ako hustota vody, Prítomnosť nenasýtených mastných kyselín v molekule TAG pôsobí znížením bodu topenia a tieto TAG sú pri izbovej teplote kvapalné. TAG nemajú náboj a sú neutrálne, Trepaním s vodou vznikajú nestále emulzie. Najdôležitejšou chemickou reakciou TAG je ich hydrolýza. Hydrolýza je reverzibilná reakcia a je opakom esterifikácie. In vitro prebieha vo vriacej vode a veľmi pomaly a môže byť urýchlená pridaním kyseliny alebo zásady. Alkalická hydrolýza sa nazýva saponifikácia a jej produktom sú okrem glycerolov aj soli vyšších mastných kyselín – mydlá. V organizme je hydrolýza TAG katalyzovaná špecifickými enzýmami – lipázami. Nenasýtené mastné kyseliny v TAG môžu byť hydrolyzované. Hydrogenácia sa požíva k stužovaniu tukov. Pôsobením vzduchu, tepla, slnečného žiarenia a vlhka podliehajú TAG oxidačným a hydrolytickým reakciám, ktoré sú podstatou žluknutí tukov, Pri tomto procese získavajú tuky nepríjemný zápach a chuť, vznikajú tekavé mastné kyseliny a iné ostro zapáchajúce nízkomolekulové látky, aldehidy a ketóny. Žluknutí tukov môžu spôsobovať aj niektoré plesne. Podľa biologického pôvodu môžeme tuky rozdeliť na dve veľké skupiny: rastlinné a živočíšne tuky. Rastlinné tuky sú tuhé (kokosový, palmový tuk) alebo tekuté (olivový, slnečnicový, makový a iný olej). Tuky studenokrvných živočíchov sú kvapalné (rybí olej, trány), tuky teplokrvných živočíchov sú tuhé a mazľavé (loj, rôzne sádla). Ľudský tuk je pri telesnej teplote kvapalný, obsahuje predovšetkým kyselinu palmitovú, steárovú a olejovú, v menšej miere aj kyselinu linolovú, linolénovú a arachidónovú. U zdravého človeka tvoria tuky (TAG) približne 15% jeho celkovej hmotnosti. U ľudí s nadváhou až obezitou je toto percento vyššie. TAG, hlavne mastné kyseliny v nich sú najvýznamnejším zdrojom energie a v bunkách tukového tkaniva významným rezervoárom energie. Medzi lipidy obsahujúce glycerol patria aj glycerylétery (étery glyceroly a nasýtených aj nenasýtených alifatických mastných kyselín) a glykozyl-mono- a diacylglyceroly. Tieto skupiny nemajú pre človeka význam. I/36. Mastné kyseliny. Mastné kyseliny sú karboxylové kyseliny s nerozvetveným uhľovodíkovým reťazcom dlhým 4-24 uhlíkov, pričom obsahujú väčšinou párny (sudý) počet uhlíkových atómov. Mastné kyseliny sú dôležitou stavebnou súčasťou mnohých lipidov. Mastné kyseliny sa môžu vyskytovať v organizme voľné alebo vo forme esterov v komplexnejších molekulách ako napr. triacylglyceroly. V malých množstvách sa voľné mastné kyseliny vyskytujú vo všetkých tkanivách, ale vo zvýšenom množstve sa môžu vyskytovať v krvnej plazme, najmä počas hladovania. Voľné mastné kyseliny v plazme (naviazané na albumín) sú prenášané z miesta vzniku (triacylglyceroly z tukového tkaniva alebo z cirkulujúcich lipoproteínov) do miesta potreby (väčšina tkanív). Voľné mastné kyseliny môžu byť oxidované vo väčšine tkanív, najmä vo svaloch a pečeni, čím vzniká množstvo energie. Mastné kyseliny sú tiež súčasťou membránových lipidov ako napr. fosfolipidov alebo glykolipidov. Mastné kyseliny môžu byť naviazané na určité intracelulárne bielkoviny, čím napomáhajú proteínom asociovať s membránou. Mastné kyseliny sú tiež prekurzory eikosanoidov. Esterifikované mastné kyseliny sú uskladnené v adipocytoch, ktoré vytvárajú hlavne zásoby energie v organizme. Mastné kyseliny sa skladajú z hydrofóbneho uhľovodíkového reťazca a koncovej karboxylovej skupiny, ktorá má pK a približne 4,8. Za fyziologického pH karboxylová skupiny ionizuje, čím vzniká –COO - . Záporný náboj karboxylovej skupiny vykazuje afinitu k vode, čo podmieňuje amfolytický charakter (majú hydrofóbnu a hydrofilnú časť). Avšak u mastných kyselín s dlhým reťazcom prevláda práve hydrofóbny charakter uhľovodíkového reťazca. Toto štruktúrne usporiadanie určuje mastným kyselinám charakter povrchovo aktívnych látok (tenzidy – znižujú povrchové napätie). Rozpustnosť mastných kyselín závisí na dĺžke reťazca, no väčšina mastných kyselín je vo vode nerozpustné, preto musia byť v krvi transportované vo väzbe s transportným proteínom. Viac ako 90% mastných kyselín v krvnej plazme sa nachádzajú vo forme esterov mastných kyselín (hlavnetriacylglycerolov, cholesteryl esterov a fosfolipidov) obsiahnutých v cirkulujúcich lipoproteínových časticiach. Neesterifikované (voľné) mastné kyseliny sú transportované vo väzbe s albumínom. Mastné kyseliny vo svojich reťazcoch nemusia obsahovať žiadne dvojité väzby a teda sú saturované (nenasýtené) alebo naopak môžu obsahovať jednu alebo viac dvojitých väzieb, teda sú nasýtené. Dvojité väzby v mastných kyselinách väčšinou zaujímajú cis-konformáciu a menej často trans-konformáciu (obe konformácie sa líšia v biologickom účinku – iba cis-forma mastných kyselín je biologicky aktívna). Prítomnosť cis- konformácie v molekule mastnej kyseliny spôsobuje „ohyb“ v mieste väzby. Ak sa v mastnej kyseline vyskytuje viac ako jedna dvojitá väzba, väzby sú od seba vždy vzdialené o úsek troch uhlíkov. Všeobecne zvýšený počet dvojitých väzieb v mastnej kyseline znižuje teplotu topenia (tání), pričom zväčšenie dĺžky reťazca zvyšuje teplotu topenia. Vo vzorcoch mastných kyselín sa uhlíkové atómy číslujú v smere od karboxylového uhlíka, ktorý má číslo 1. Mastné kyseliny sa charakterizujú dvoma číslami, ktoré sú oddelené dvojbodkou. Číslo pred dvojbodkou označuje počet uhlíkov a číslo za dvojbodkou označuje počet a polohu dvojitých väzieb v závislosti na karboxylovom uhlíku (polohy dvojitých väzieb sa píšu v zátvorkách). Napr. kyselina arachidónová – 20:4 (5, 8, 11, 14) – zápis vyjadruje, že kyselina je dlhá 20 uhlíkov a obsahuje 4 dvojité väzby medzi uhlíkmi 5-6, 8-9, 11-12 a 14-15. Dvojité väzby v mastných kyselinách môžu byť tiež označované v závislosti na ω-uhlíku (posledný uhlík reťazca v smere od karboxylového uhlíku) – napr. kyselina arachidónová je označovaná tiež ako ω-6 mastná kyselina, inou ω-6 mastnou kyselinou je kyselina linolová – 18:2(9,12). Naopak, kyselina α- linolénová – 18:3(9, 12, 15) - je označovaná ako ω-3 mastná kyselina. Dve mastné kyseliny sú pre človeka esenciálne pre svoju neschopnosť ich syntézy. Prvou je kyselina linolová, ktorá funguje ako prekurzor pre ω-6 kyselinu arachidónovú, ktorá je substrátom pre syntézu eikosanoidov (viac otázka II/28). Druhou esenciálnou mastnou kyselinou je kyselina α-linolénová, ktorá je prekurzorom pre syntézu iných ω-3 mastných kyselín potrebných pre rast a vývin. Zdrojom esenciálnych mastných kyselín je napr. rastlinná potrava. I/37. Fosfolipidy a sfingolipidy, struktura, vlastnosti a význam. Väčšinu lipidov ľudského tela tvoria zložité zlúčeniny. Ide o estery mastných kyselín s alkoholmi. Základom ich názvoslovia je pomenovanie stavebných zložiek. Všetky lipidy obsahujúce trojsýtny alkohol glycerol sa radia medzi glycerolipidy. Pokiaľ je na mieste glycerolu sfingozín, hovoríme o sfingolipidoch. Ku glycerolu a sfingozínu nemusia byť pripojené iba zvyšky mastných kyselín, častou súčasťou fosfátové skupiny a sacharidy. Lipidy, ktoré ich obsahujú, označujeme ako fosfolipidy a glykolipidy. Fosfolipidy sú hlavnou súčasťou biologických membrán. Ich spoločným znakom je fosfátový zvyšok, ktorý tvorí ester s hydroxylovou skupinou na C-3 glycerolu alebo acylsfingotínu. Vďaka fosfátovej skupine majú fosfolipidy pri neutrálnom pH najmenej jeden negatívny náboj. K fosfolipidom patria glycerofosfolipidy a sfingofosfolipidy. Najjednoduchšími fosfolipidmi sú fosfoestery diacylglycerolu, fosfatidáty (anióny fosfatidových kyselín). Predstavujú významné medziprodukty biosyntézy tukov a fosfolipidov. Fosfatidáty sa tiež môžu odštiepiť z fosfolipidov účinkom fosfolipidázy. Z fosfatidátov (zvyšok = fosfatidyl) môžeme odvodiť fosfatidy a ďalšie fosfolipidy. Fosfatidy majú fosfátový zvyšok esterifikovaný ďalším alkoholom. Môže ísť o aminoalkohol (cholín, etanolamín alebo serín) alebo o derivát cyklohexánu myo-inozitol. Dôležitým príkladom týchto zlúčenín je fosfatidylcholín (lecitín, ptd- cholín). Ak sa dve fosfatidylové zvyšky spoja s glycerolom, získame kardiolipín (difosfatidylglycerol). Tento fosfolipid sa vyskytuje vo vnútornej mitochondriálnej membráne. Lyzofosfolipidy sú výrazne amfipatické lipidy vznikajúce z fosfolipidov enzymatickým odštiepením acylového zvyšku. Hemolytické účinky bôbov a hadieho jedu z časti závisia na tejto reakcii. Foafatidylcholín (lecitín) je hlavným fosfolipidom membrán. Ako povrchovo aktívna látka je tiež súčasťou pľúcneho surfaktantu významnou pre roztiahnutie pľúc a ich ďalšiu činnosť. Fosfatidyletanolamín (cefalin) nesia na mieste cholínu zvyšok etanolamínu, fosfatidylserín má na rovnakom mieste zvyšok serínu. Vo fosfatidylinozitolu je na fosfatidát naviazanýcyklický polyalkohol myo-inozitol. Derivát tohto fosfolipidu, ktorý je fosforylovaný na dvoch miestach – fosfatidylinozitol-4,5-bisfosfát, je zvláštnou súčasťou membrán, z ktorých enzymatickým štiepením vznikajú dvaja druhí poslovia – diacylglycerol (DAG) a inozitol-1,4,5-trifosfát (InsP 3 ) – viac v otázke IV/6. Zvláštnou skupinou fosfolipidov sú plazmalogény, ktoré pripomínajú lecitín alebo cefalín, avšak miesto mastnej kyseliny majú na C-1 glycerole éterovo naviazaný nenasýtený mastný alkhol. Plazmalogény a ďalšie éterofosfolipidy s nasýteným mastným alkohol naviazaným éterovou väzbou tvorí asi 8% všetkých fosfolipidov človeka. Sú tkanivovo špecifické a nachádzajú sa napr. v membránach myelinových pošiev. Určité plazmalogény fungujú ako faktor aktivujúce doštičky (PAF). Okrem záporného náboja nesú fosfátové skupiny fosfolipidov aj ďalšie náboje. Foasfatidylcholín a fosfatidyletanolamín sú kladne nabité na dusíku aminoalkoholu. Celkovo sú preto tieto fosfolipidy neutrálne. Naproti tomu fosfatidylserín, ktorý má jeden kladný a jeden záporný náboj na serínovom zvyšku a fosfatidylinzitol (nemá ďalší kladný náboj) sú vďaka fosfatovým zvyškom celkovo nabité záporne, čo je dôležité pre ich umiestnenie v membráne. Sfingolipidy sú ďalšie dôležité lipidy membrán. V obzvlášť veľkej miere sa vyskytujú v membránach nervových buniek v motgu a nervového tkaniva. Sfingolipidy sa štruktúrou od iných membránových lipidov líšia – úlohu glycerolu a jedného zvyšku mastnej kyseliny preberá sfingozín, aminodialkohol s dlhým nenasýteným reťazcom. Dá sa tiež povedať, že sfingozín približne odpovedá monoacylglycerolu. Sfingozín je základným stavebným prvkom sfingolipidov. Ide o 18-uhlíkový nenasýtený, dvakrát hydroxylovaný uhľovodík s dlhým alifatickým zvyškom, ktorý vzniká zo serínu a palmitoyl-CoA. Ceramid vzniká naviazaním jednej mastnej kyseliny na sfingozín pomocou amidovej väzby. Ceramid je prekurzorom sfingolipidov. Z sfingofosfolipidov je kvantitatívne najvýznamnejším fosfolipidom membrán sfingomyelín. Vzniká z ceramindu pripojením fosfátovej skupiny a zvyšku cholínu. Sfingomyelín odpovedá lecitínu. Jeho názov odráža vysokú koncentráciu v myelinových pošvách nervového systému. Glykolipidy obsahujú sacharidové zvyšky. Vyskytujú sa vo všetkých tkanivách na vonkajšej strane plazmatickej membrány. Na zvyšok ceramidu (sfingozín + mastná kyselina) sú v glykolipidoch pripojené monosacharidy alebo oligosacharidové zvyšky. Avšak glykolipidy neobsahujú fosfátový zvyšok charakteristický pre fosfolipidy. Základnými zástupcami tejto skupiny sú galaktozylceramid a glukozylceramid, tzv. cerebrozidy. Cerebrozidy, ktorých cukor je esterifikovaný kyselinou sírovou, sa označujú ako sulfamidy. Syntetizujú sa hlavne v oligodendrocytoch CNS. Gangliozidy patria so svojim rozvetveným reťazcom zloženým z niekoľkých monosacharidov medzi najzložitejšími glykolipidmi. Ich charakteristickou súčasťou je kyselina N-acetylneramínová (NeuAc, NANA, kyselina sialová). Glykolipidy vytvárajú na bunkovej membráne hydrofilnú vrstvu označovanú ako glykokalyx. Chráni bunku pred natrávením a pred nežiaducim príjmom lipofilných látok. Rozličné glykolipidy plazmatickej membrány slúžia tiež pre rozpoznanie buniek a odpovedajú za vznik krvných skupín AB0 systému. Vírusy a bakteriálne toxíny využívajú glykolipidov bunkového povrchu ako špecifických väzobných miest a prenikajú pomocou nich do buniek. I/38. Steroly, žlučové kyseliny a steroidní hormony, struktura, funkce a význam v organismu. Steroly a steroidy tvoria skupinu biologicky veľmi dôležitých prírodných látok, ktorých štrukturálny základ tvorí kondenzovaný, nasýtený cyklický uhľovodík sterán (cyklopentanoperhydrofenantrén). Steroly sú súčasťou buniek rastlín (fytosteroly), živočíchov (zoosteroly), ale aj húb a plesní (myosteroly). Steroidy sú veľmi blízke sterolom. Patria k nim žlčové kyseliny, steroidné hormóny (hormóny kôry nadľadvín, mužské aženské sexuálne hormóny), aglykony niektorých glykozidov a určité alkaloidy a vitamíny. Steroly sú pevné látky, nerozpustné vo vode, ale rozpustné v nepolárnych rozpúšťadlách. Steroly a steroidy majú rovnaký biologický základ – päťuhlíkatý nenasýtený uhľovodík izoprén (2-metyl- buta-1,3-dién) a sú teda príbuzné ďalším významným prírodným látkam, karotenoidom a terpénom; spoločne s nimi ich radíme medzi izoprenoidy. Štrukturálnym základom sterolov a steroidov je uhľovodík sterán (voľný sterán sa v prírode nevyskyuje). Sterán vzniká kondenzáciou troch cyklohexánových kruhov a jedného cyklopentánového kruhu. Cyklohexánové kruhy sú kondenzované angulárne, podobne ako benzénové jadrá fenanthrénu a k ním je pripojený cyklopentánový kruh. Dôležitým znakom všetkých prírodných sterolov a steroidov je prítomnosť metylovej skupiny na C10 (19. uhlík) a na C13 (18. uhlík), tzv. angulárne metyly. Výnimku tvoria estrogény, ktoré nemajú metylovú skupinu na C10. Spojenie dvoch cyklohexánových kruhov dáva možnosť priestorovej izomérie cis a trans. U všetkých prírodných sterolov a steroidov (okrem jednej výnimky) je spojenie kruhov B/C a C/D v trans-konfigurácií a možnosť izomérie zostáva iba pre kruhy A/B. Ak sú kruhy A/B v trans konfigurácií, patria do 5-α-rady a ak sú v cis- konfigurácií, patria do 5-β-rady. Priestorové usporiadanie vodíkových atómov a prípadných substituentov sa vzťahuje k metylovej skupine na C10. Ak je táto skupina nad rovinou tetracyklického útvaru, označujeme jej polohu ako β a rovnako tak všetky ostatné substituenty s rovnakou konfiguráciou. Substituenty s opačnou konfiguráciou, smerujúcou pod rovinu tetracyklického útvaru, označujeme ako α. Vo vzorcoch je α-substitúcia vyznačená prerušovanou čiarou a β-substitúcia plnou čiarou. Všetky prirodzené steroly a steroidy (až na jednu výnimku) môžeme rozdeliť do dvoch skupín, ktoré sa od seba líšia konfiguráciou na piatom uhlíku. Kruhy A a B tvoria trans- alebo cis-dekalanový systém. Je známa presná konformácia tohto systému, ktorá v trans- alebo cis-forme je založená na židličkovej konformácií. Trans-dekalan vytvára strnulý systém. Cis-dekalan sa vyskytuje v rovnovážnej zmesi dvoch foriem. Najstálejšou formou steránového jadra je tá, kde všetky uhlíkové atómy vychádzajúce z cyklohexánových kruhov sú viazané v axiálnej polohe. Všetky cyklohexánové jadra majú židličkovú konformáciu a celý steroidný skelet 5-α foriem je strnulý útvar. Názvoslovie steroidov a sterolov je odvodené od základných uhľovodíkov. Pre C27 steroly je základným uhľovodíkom cholestan, patriaci k 5-α rade, pre C24 steroidy je to cholán, patriaci k 5-β rade, pre C21 steroidy je základným uhľovodíkom pregnán, patriaci k 5-β rade, pre C19 steroidy androstan, patriaci k 5-α rade a nakoniec pre C18 steroidy estran. Dvojitá väzba sa väčšinou v staršej nomenklatúre označuje symbolom Δ a číslom uhlíku, z ktorého dvojitá väzba vychádza, ďalej zmenou zakončenia základného uhľovodíku z –an na –en, prípadne –dien, -trien a pod. Funkčné skupiny sa označujú klasickým spôsobom. naviac je iba označenie konfigurácie α alebo β. Najdôležitejším živočíšnym sterolom je cholesterol. Bol objavený už v druhej polovici 18. storočia v žlčových kameňoch a odtiaľ má aj meno (lat. chole = žlč a stereos = pevný). Cholesterol je odvodený od hypotetického základného uhľovodíku cholesteranu. Na C17 steránového jadra má naviazaný osemčlenný uhlíkový reťazec, ktorý sa orientuje ako metylové skupiny na C10 a C13, teda v β-konfigurácií. Cholesterol je nenasýtený alkohol s hydroxylovou skupinou na C3 v β- konfigurácií a s jednou dvojitou väzbou medzi C5 a C6. Cholesterol je Δ 5 -cholesten-3-β-ol alebo novšie cholest-5-en-3-β-ol. Cholesterol má vo svojej molekule osem asymetrických uhlíkov, ale z 512 možných stereoizomerov bol v prírode nájdený len jediný. Pre biologické chovanie cholesterolu má zásadný význam konformácia jeho molekuly a substituentov položených ekvatoriálne aj axiálne k rovine jednotlivých kruhov. Toto usporiadanie ovplyvňuje chovanie cholesterolu v bunkových membránach. Čistý cholesterol je biela kryštalická látka, je nerozpustný vo vode a rozpustný v nepolárnych rozpúšťadlách. Cholesterol vytvára s mastnými kyselinami estery. Estery cholesterolu patria medzi neutrálne tuky. Cholesterol je súčasťou všetkých tkanív živočíchov a to buď voľný alebo vo forme esterov. Spolu s fosfolipidmi je integrálnou súčasťou bunkových membrán všetkých živočíšnych buniek. V rastlinnej ríši cholesterol chýba. Ďalšie biologicky významné C27 steroly sú predovšetkým tie, ktoré sú vo vzťahu k metabolizmu cholesterolu (zymosterol, lanosterol, desmosterol,...). Fytosteroly (rastlinné steroly) majú 28 uhlíkov, biochemicky patria k C27 sterolom, 28. uhlík v ich molekule pochádza z methionínu. Najdôležitejším fytosterolom je ergosterol 24-metyl-Δ 5,7,22 -cholestatrien-3-β-ol. Ergosterol je obsiahnutý v rastlinných olejoch a je prekurzorom vitamínu D. Vzhľadom k ľahkému rozštiepeniu väzby medzi C22 a C23 nie je ťažké získať C21 steroidy. Ergosterol tak môže slúžiť ako výchozí látka pri syntéze niektorých steroidných hormónov. Fytosterolov je značný počet a všetky sú v rôznom množstve obsiahnuté v rastlinných olejoch. Štrukturálnym základom žlčových kyselín je kyselina cholanová, ktorá sa v prírode ako voľná kyselina nevyskytuje. Je odvodená od základného uhľovodíku cholanu a patrí k 5-β rade. Kyselina cholanová má bočný reťazec tvorený piatimi uhlíkovými atómami, na ktorých konci je karboxylová skupina. Žlčové kyseliny sú hydroxyderivátmi kyseliny cholanovej, kde jedna hydroxylová skupina je vždy viazaná na C3 steránového jadra v α-konfigurácií. Žlčové kyseliny rozoznávamie primárne – tie vznikajú priami z cholesterolu v pečeni, a sekundárne, vznikajúce z primárnych činnosťou črevnej flóry. Primárne žlčové kyseliny sú kyselina cholová (3,7,12-α-trihydroxycholanová, po novom 3-α-7- α-12-α-trihydroxy-5-β-cholan-24-ová) a kyselina chenodeoxycholová (3,7-α-dihydroxycholanová). Sekundárne žlčové kyseliny sú kyselina deoxycholová (3,12-α-dihydroxycholanová) a kyselina litocholová (3-α-hydroxycholanová). Žlčové kyseliny sú zle rozpustné vo vode. V alkalickom prostredí sa rozpúšťajú dobre a vznikajú ich soli Medzi steroly patria tiež kardiotonické steroidy –látky, ktoré sa vyskytujú v organizmoch niektorých rastlín a živočíchom; majú špecifický účinok na myokard stavovcov. Okrem steroidného skeletu majú ešte cukornú zložku, sú teda heteroglykozidy. Ich štrukturálnou vlastnosťou je cis-konformácia kruhov C a D steranového jadra. Do tejto skupiny patria predovšetkým digitalisové steroidy a strofantové glykozidy a mnoho ďalších. Významné sú vo farmakológií. Steroidné hormóny rozdeľujeme podľa počtu uhlíkových atómov steroidnej molekuly do 3 skupín: 1. C21 steroidy – deriváty pregnanu – kortikoidy a gestagény 2. C19 – deriváty androstani – androgény (mužské sexuálne hormóny) 3. C18 steroidy – deriváty estranu – estrogény (ženské sexuálne hormóny) Pre potreby medicíny sa používa tiež delenie steroidných hormónov podľa miesta vzniku. Steroidné hormóny sú syntetizované v kôre nadľadvín, varlatách, vaječníkoch, placente a tiež trofoblaste. Rozdeľujeme ich teda tiež na hormóny vznikajúce 1. v kôre nadľadvín, 2. vo varlatách, 3. vo vaječníkoch. Steroidné hormóny kôry nadľadvín delíme na 5 základných skupín: 1. glukokortikoidy – C21 steroidy – kortizol a kortikosteron 2. mineralokortikoidy – C21 steroidy – aldosteron a deoxykortikosteron 3. gestageny – C21 steroidy – progesteron 4. androgény – C19 steroidy – androstenolon, androstendion a testosteron 5. estrogény – C18 steroidy – estradiol Progesteron je v kôre nadľadvín iba medzistupňom (prekurzorom) pri tvorbe vlastných kortikoidov a tvorba estrogénov je nevýznamná. Vlastné hormóny kôry nadľadvín v užšom slova zmysle sú všetky C21 steroidy – kortikoidy. Kortikoidy sú deriváty pregnanu. Pre ich štruktúru je charakteristická dvojitá väzba medzi C4 a C5, oxo-skupina v polohe 3 a na C17 v β-konfigurácií dvojuhlíkový bočný reťazec s primárne alkoholovou a ketónovou funkčnou skupinou. Hlavnými predstaviteľmi sú kortikosteron, kortizol, kortizon, 11- deoxykortikosteron a aldosteron. Kôra nadľadvín vytvára ešte ďalšie kortikoidy, jedná sa väčšinou o deriváty kortizolu alebo kortikosteronu. Poznaním dvojitého účinku kortikoidov (glukotropného a mineralotropného) bola preukázaná súvislosť medzi štruktúrou a funkciou. Základnou podmienkou glukotropnej účinnosti C21 steroidov je oxoskupina v polohe 3, dvojitá väzba medzi C4 a C5, hydroxylová skupina v konfigurácií 11-β a charakteristické α-ketolové usporiadanie na C17. Pre mineralotropný účinok je charakteristická hydroxyskupina na C21 a aldehydová skupina na C18. Odstránením niektorej z funkčných skupín kortikoidný účinok vymizne. Niektoré zmeny v základnej štruktúre kortikoidov silno zvyšujú účinnosť. je o hlavne ďalšia dvojitá väzba medzi C1 a C2 (prednison) alebo substitúcia halogénom, prednostne fluórom do polohy 9-α a substitúcia metylom v polohe 16-α. Tieto poznatky umožnili prípravu mnohých syntetických steroidných látok s kortikoidným účinkom, využívaných v liečbe mnohých ochorení (prednison, triamcinolon, dexametason, etc.). Z androgénov, C19 steroidov, sa v kôre nadľadvín vytvára predovšetkým dehydroepiandrosteron, androsteron a Δ 4 -androstendion. Kortikoidy ovplyvňujú rôzne metabolické pochody v organizme. Mužské sexuálne hormóny (androgény, C19 steroidy) sa vytvárajú v kôre nadľadvín oboch pohlaví, v Leydigových bunkách testes a v ováriu. Androgény sú deriváty androstanu. Je pre nich typická ketónová alebo hydroxylová skupina na C17. Hlavným androgénom testes je testosteron, v bunkách testes vznikajú aj iné androgény, napr. 15-α-hydroxytestosteron alebo 6-β- hydroxytestosteron. Hlavnými androgénmi kôry nadľadvín sú androsterón, andrenosteron, Δ 4 -androstendion, dehydroepiandrosteron- Pre andrgogénny účinok sú nevyhnutné substituenty na C17, ich odstránenie vedie k strate účinku. Všeobecne 17-hydroxyderiváty sú účinnejšie než 17- ketoderiváty. Tiež poloha dvojitej väzby (Δ 4 , Δ 5 ) má vplyv na ich andrgénnu účinnosť. Synteticky pripravené androgény – alkyl-deriváty, halogén-deriváty a nor-deriváty (steroidy bez angulárnej metylovej skupiny v polohe 10) – sa používajú pre svoj zvýšený proteoanabolický účinok pri pomerne malom androgénnom efekte ako anabolika a sú zneužívané pri dopingu. Ženské sexuálne hormóny (estrogény, C18 steroidy) sú syntetizované vo folikulárnych bunkách vaječníkov, intersticiálnych tkanivách varlat, placente a v malom množstve aj v kôre nadľadvín. Estrogény sú derivátmi estránu. Ich základnou štruktúrnou charakteristikou je prítomnosť aromatického kruhu A s fenolovým hydroxylom v polohe 3 a hydroxy- alebo ketoskupina na C17. Všetkým estrogénom teda chýba angulárna metylová skupina na C10 ako dôsledok aromatizácie kruhu A. Najdôležitejšími estrogénmi sú estradiol, estron a estriol. Pre úplný estrogény účinok je nutné popísané usporiadanie na C3 a C17. Strata metylovej skupiny na C13 vedie k strate účinku. Bolo preukázané, že pre estrogénny účinok nie je nevyhnutná steroidná štruktúra. Boli syntetizované niektoré nesteroidné látky so silne estrogénnym účinkom. Estrgoény, rovnako ako androgény, majú výrazne proteoanabolické účinky. Gestageny (progesteron, C21 steroidy) – hlavným predstaviteľom tejto skupiny hormónov je progesteron. Ak cieľový hormón je vytváraný v corpus luteum vaječníkov v sekrečnej fáze menštruačného cyklu a v plycente. V kôre nadľadvín a testes je prekurzorom ostatných steroidných hormóov. Progesteron je derivát pregnanu, je to nenasýtený diketón s ketoskupinami v polohe 3 a 20 a s krátkym dvojuhlíkatým reťazcom v β-konfigurácií na C17. Gestagénny účinok je do istej miery viazaný na uvedenú štruktúru. Redukcia oxo-skupín, hydrogenácia dvojitej väzby a stérickeé zmeny v konformácií kruhov vedú k strate účinku. Rovnako ako v prípade ostatných steroidných hormónov sú syntetické analógy progesteronu významnými liekmi. Syntetické nor- deriváty boli použité ako jedyn z prvých hormonálnych perorálnych kontraceptív. Všeobecný význam syntetických analógov steroidných hormónov je – okrem zvýšeného účinku – aj možnosť perorálnej aplikácie. K lipidom patria tiež terpény, radené do skupiny tzv. izoprenoidov. Ich základnou štruktúrnou jednotkou je izoprén (2-metyl-1,3- butadién). Terpény vytvárajú jak rastliny, tak aj živočích. Podľa počtu izoprenových jednotiek v moeluke ich delíme na: monoterpény (2 jednotky), seskviterpény (3 jednotky), diterpény (4 jednotky), triterpény (6 jednotiek), tetraterpény (8 jednotiek) a polyterpény (n jednotiek). Podľa chemickej štruktúry to sú uhľovodíky alebo kyslíkaté deriváty uhľovodíkov . alkoholy, aldehydy, ketóny a karboxylové kyseliny, ale aj étery, epoxidy, etc. Sú acyklické alebo cyklické s jedným alebo viacerými alicyklickými kruhmi. Medzi terpény patrí množstvo dôležitých látok, ako je napr. mentol, gáfor (kafr), skvalén, β-karotén, vitamín A, retinal ale aj kaučuk a gutaperča. II. Základy metabolismu II/1. Struktura enzymů (jednoduché a složené; apoenzym a holoenzym; kofaktory: koenzymy, prosthetické skupiny, koaktivátory; oligomerní struktura); mnohočetné enzymové formy a isoenzymy. Klasifikace enzymů. Příklady, význam. Enzýmy sú životne dôležité biopolyméry, ktorých hlavnou úlohou je katalýza životne dôležitých chemických procesov. Prítomnosť a udržiavanie kompletnej sady enzýmov sú základne predpoklady pre metabolizmus živín. Metabolizmom sa získava energia na základne aktivity – bunkový pohyb, transmembránový transport, vedenie nervového vzruchu, kontrakciu svalstva, etc. Stanovenie enzýmovej aktivity vo vzorke krvi alebo iných tkanivových tekutín, či bunkových extraktov má diagnostický význam. Nedostatočné množstvo enzýmov alebo ich nedostatočná katalytická aktivita môže byť spôsobená genetickou poruchou alebo účinkom toxínov. V medicíne sa skúma ovplyvnenie porúch a nevyváženosť enzýmových aktivít použitím farmak k inhibícií špecifických enzýmov a taktiež možnosť génovej terapie ako prostriedku obnovy správnej enzymatickej funkcie. Absolutná stereošpecifita je dôležitá vlastnosť enzýmov pri ich požití ako katalyzátorov pri syntéze liečiv a antibiotík. Proteolytické enzýmy zvyšujú účinky detergentov pri odstraňovaní nečistôt a škvŕn. Enzýmy sú dôležité pri zvyšovaní alebo tvorbe nutričných hodnôt potravy, napr. proteáza renín sa využíva ako syridlo, laktázou sa odstraňuje laktóza z mlieka,... Enzýmy katalyzujú chemické reakcie, v ktorých je premenená jedna alebo viac zlúčenín (substrátov) na jednu alebo viac odlišných zlúčenín (produkty). Enzymaticky katalyzovaná reakcia prebieha aspoň 10 6 krát rýchlejšie ako rovnaká reakcia bez enzymatickej katalýzy. Ako všetky katalyzátory, aj enzýmy, ktoré vstupujú do reakcie nie sú počas reakcie spotrebované ani nedôjde k trvalej zmene ich chemickej štruktúry. Enzýmy sú nielen veľmi účinné katalyzátory, ale taktiež veľmi selektívne. Enzýmy sú biokatalyzátory špecifické pre daný typ reakcie aj pre daný substrát alebo úzku skupinu chemicky príbuzných substrátov. Sú tiež stereošpecifické, čo zanmená, že katalyzujú premenu iba jedného stereoizoméru danej zlúčeniny (napr. integaujú s L-sacharidami ale nie D- sacharidami).Substrát s aktívnym miestom enzýmu špecificky interaguje aspoň v troch miestach. Takéto „trojbodové pripojenie“ vysvetľuje opticky neaktívneho substrátu na opticky aktívny produkt (vzniká stereošpecificky enantiomér a nie racemát produktu). Dokonalá špecifita pôsobenia umožňuje živým bunkám simultánne vykonávať široké spektrum nezávisle regulovaných chemických procesov. Enzýmy sú bielkovinové molekuly, s výnimkou katalyticky účinných molekúl RNA, nazývaných ribozýmy. Súčasťou molekuly enzýmu sú aj malé neproteínové molekuly alebo ióny kovov, ktoré sa zúčastňujú na katalytickom pôsobení enzýmov. Označujeme ich ako prostetické skupiny , kofaktory a koenýmy. Môžu sa priamo zúčastňovať naviazania substrátu alebo majú katalytickú funkciu. Aminokyselinové bočné reťazce proteínovej časti enzýmu poskytujú iba obmedzené množstvo funkčných skupín a tieto neproteínové časti enzýmu rozširujú katalytické účinky enzýmu, lebo prinášajú do molekuly nové funkčné skupiny. Prostetické skupiny rozlišujeme podľa toho, ako veľmi sú stabilnou súčasťou proteínovej molekuly. Sily, ktoré sa zúčastňujú integrácie prostetickej skupiny do štruktúry enzýmu môžu mať kovelentný alebo nekovalentný charakter. Prostetickou skupinou sú napr. pyridoxalfosfát, flavínmononukleotid (FMN), flaínadeníndinukleotid (FAD), tiamíndifosfát (tiamínpyrofosfát, TPP), biotín a niektoré kovové ióny (napr. Co, Cu, Mg, Mn, Zn,...). Najbežnejšími prostetickými skupinami sú ióny kovov, približne jedna tretina všetkých enzýmov obsahuje pevne viazaný ión kovu, preto ich označujeme ako metalloenzýmy. Ióny kovov, ktoré sa zúčastňujú redoxných reakcií sú väčšinou súčasťou prostetickej skupiny a tvoria s ňou komplexné zlúčeniny ako napr. hem alebo Fe-S klastry. Kovové ióny môžu tiež uľahčiť naviazanie a orientáciu substrátu, vytvorenie kovalentnej väzby v reakčnom intermédiu (napr. Co 2+ ióny v koenzýme B 12 ) alebo môžu interagovať so substrátom za účelom premeny substrátu na viac elektrofilnú (s menej elektrónmi) alebo viac nukleofilnú (bohatšiu na elektróny) molekulu Kofaktory plnia podobné funkcie ako prostetické skupiny, ale ich väzba na substrát alebo enzým je krátkodobá a ľahko disociuje (napr. ATP). Na rozdiel od pevne asociovanej prostetickej skupiny, kofaktory musia byť prítomné v okolí enzýmu, ktorý katalyzuje reakciu. Najbežnejšími kofaktormi sú opäť ióny kovov. Enzýmy, ktoré pre svoju činnosť vyžadujú ióny kovov sa nazývajú enzýmy aktivované kovovými iónmi a líšia sa od metalloenzýmov, kde kovové ióny slúžia ako prostetické skupiny. Koenzýmy fungujú ako recyklovateľné prenášače skupín, ktoré prenášajú rôzne substráty z miesta syntézy do miesta využitia. Substrát je v spojení s konezýmov stabilizovaný (napr. stabilizácia vodíkových atómov alebo hydridových iónov, ktoré sú vo vodnom prostredí bunky nestabilné). Koenzýmy ďalej prenášajú ďalej metylové skupiny (foláty), acylové skupiny (koenzým A) a oligosacharidy (dolichol). Dôležitou zložkou mnohých enzýmov sú vo vode rozpustné vitamíny typu B. Niektoré koenzýmy navyše obsahujú adenín, ribózu a fosfátovú skupinu AMP alebo ADP. Nikotínamid je súčasťou koenýmov NAD a NADP, ktoré sa zúčastňujú redoxných reakcií, zatiaľ čo riboflavín je súčasťou ďalších redoxných koenzýmov FMN a FAD. Kyselina pantothenová je prekurzorom koenzýmu A, ktorý slúži ako prenášač acylových skupín. Thiamín sa vo forme pyrofosfátu (difosfátu) zúčastňuje dekarboxylácie α-oxokyselín, kyselina listová a kobamidové koenzýmy (B 12 ) sú dôležité pre prenos jednouhlíkového zvyšku. Empiricky bolo zistené, že naviazaním substrátu na enzým sa vytvorí komplex enzým-substrát (ES), ktorý je tepelne stabilnejší ako samotný enzým. Špecifita, a ktorou enzýmy rozpoznávajú substrát a tvoria komplex ES sa dá prirovnať k mechanickej zámke, do ktorej sa hodí iba správny kľúč. Túto enzýmovú „zámku“ označujeme ako aktívne miesto. Aktívne miesto väčšiny enzýmov má tvar štrbiny alebo kapsy na povrchu molekuly enzýmu. V prípade enzýmov zložených z viacerých proteínových podjednotiek (multimérne enzýmy) sa aktívne miesto nachádza na rozhraní podjednotiek. Aktívne miesto neslúži len na rozpoznanie a naviazanie substrátu, je to priestor, ktorý zabraňuje solvatácii substrátu a tým uľahčuje katalytickú reakciu. Na aktívne miesto sa tiež môžu viazať kofaktory a prostetické skupiny, ktoré sa reakcie zúčastňujú. Molekula substrátu je viazaná v tesnej blízkosti a optimálnej orientácií k funkčným skupinám aktívneho miesta (aminokyselinové zvyšky, kofaktory, prostetické skupiny) zodpovedným za katalýzu chemickej transformácie substrátu na produkty. Názvy enzýmov často vychádzajú z typu reakcie, ktorú katalyzujú a názov je zakončený príponou –áza. Napr. dehydrogenázy prenášajú vodíkové atómy, proteázy hydrolyzujú proteíny a izomerázy katalyzujú prešmyky (zmeny konfigurácie molekúl). Názov môže byť modifikovaný tak, že mu predchádza označenie substrátu, ktorého premenu enzým katalyzuje (xantínoxidáza), zdroj enzýmu (pankreatická ribonukleáza), regulačný mechanizmus enzýmu (hormonsenzitívna lipáza) alebo podstata mechanizmu pôsobenia enzýmu (cysteínova proteáza). Ak existuje viacero foriem enzýmu, pridáva sa za názov enzýmu alfanumerický znak (napr. RNA polymeráza III, proteínkináza β). Aby sa zabránilo dvojznačnosti názvu, bolo vydané odporúčanie pre jednotnú nomenklatúru a klasifikáciu enzýmov, kde ma každý enzým jedinečný názov a číselný kód, ktorý identifikuje typ katalyzovanej reakcie a zúčastnený substrát. Enzýmy môžeme rozdeliť do šiestich hlavných tried: 1. Oxidoreduktázy – katalyzujú redoxné reakcie 2. Transferázy – kataylzujú prenos fnkčných skupín (napr. glykozylová, metylová alebo fosfátová) 3. Hydrolázy – katalyzujú hydrolytické štiepenie kovalentných väzieb substrátu medzi C-C, C-O, C-N, etc. 4. Lyázy – katalyzujú nehydrolytické štiepenie kovalentnej väzby medzi C-C, C-O, C-N, etc. za súčasnej eliminácie atómu vodíka a vzniku dvojitej väzby 5. Izomerázy – katalyzujú geometrické alebo štruktúrne zmeny vo vnútri molekuly 6. Ligázy – katalyzujú silno endergonické zlučovanie dvoch molekúl za súčasnej spotreby energie (formou hydrolýzy fosfátovej väzby v ATP) Jeden enzým s rovnakým názvom sa často vyskytuje v niekoľkých formách, ktoré majú síce rovnakú špecifickosť, ale líšia sa od seba veľkosťou molekuly a menšími rozdielmi v štruktúre, prejavujúcimi sa napr. rozdielnym počtom elektrických nábojov (čo umožňuje ich separovanie elektroforézou). Môžu sa líšiť tiež odolnosťou voči vyšším teplotám alebo aj imunitnými vlastnosťami. Hovoríme o mnohočetných enzýmových formách, ktoré môžu vznikať rôznymi mechanizmami. Ak sú tieto rozdiely podmienené geneticky, tj. determinované rozdielnymi, ale blízko príbuznými génmi, potom sa od seba líšiace formy sa nazývajú izoenzýmy. Podjednotky vzniknuté podľa príslušného genetického kódu sa spolu môžu rôznym spôsobom hybridizovať a tým vznikajú diméry, tetraméry a iné oligomérne štruktúry (enzýmy vzniknuté z viacerých podjednotiek). Príkladom izoenzýmu je laktátdehydrogenáza (LDH, LD). V jadre bunky stavovcov sú 2 gény pre odlišné podjednotky – M a H a tie sa po skončení proteosyntetického pochodu agregujú 5 možnými spôsobmi do tetraméru. Existuje preto 5 izoenzýmov laktátdehydrogenázy – LD-1 až LD-5, ktoré je možné od seba odlíšiť elektroforézou. Tento enzým má význam ako kardiomarker (otázka III/20). Ako izoformy enzýmov označujeme také enzýmy, ktoré sa nejakým spôsobom líšia vo svojej štruktúre alebo veľkosti, ale tieto zmeny nie sú podmienené geneticky. Môže ísť o rozdiely v posttranslačných alebo posttranskripčných úpravách, predovšetkým v glykozylácií alebo proteolytickom odštiepení časti molekuly. Ak sa odštiepený fragment netýka aminokyselinových zvyškov tvoriacich súčasť aktívneho miesta, zmenšenie molekuly nemá za následok inaktiváciu enzýmu. Mnohočetné formy enzýmov majú veľký význam predovšetkým v diagnostike. Pojem alloenzýmy opisuje enzýmy pochádzajúce z rôznych alel jedného génu. II/2. Enzymová aktivita a její měření, fyzikálně chemické faktory ovlivňující aktivitu enzymů, regulace enzymů (exprese, kovalentní modifikace, allosterické vlivy). Využití enzymologie v medicíně. Na mechanizmus enzýmovej aktivity môžeme nazerať z dvoch rôznych perspektív. Prvá sa zaoberá energetickými zmenami počas reakcie. To znamená, že enzýmy poskytujú alternatívny, energeticky nenáročnejší priebeh reakcie oproti enzymaticky nekatalyzovanej reakcii. Druhá vysvetľuje ako aktívne miesto chemicky uskutočňuje katalýzu. Všetky chemické reakcia musia pri premene reaktantov na produkty prekonať určitú energetickú bariéru. Táto bariéra, ktorú nazývame aktivačná energia, je energetický rozdiel medzi energiou reaktantov a energiou vysoko energetického medzičlánku (nazývame ho aktivovaný komplex, T*), ktorý vzniká pri formácií produktu. Všeobecne to môžeme zapísať ako: A ↔ T* ↔ B Vrcholová energia tejto reakcie predstavuje energiu aktivovaného komplexu. Kvôli vysokej aktivačnej energii sú nekatalyzované väčšinou veľmi pomalé. Aby mohli molekuly zreagovať, musia obsahovať dostatok energie na prekonanie energetickej bariéry. Za neprítomnosti enzýmu má iba malá časť molekúl dostatočné množstvo energie na premenu na produkt, reakcia bude prebiehať len veľmi pomaly. Ak sa však zníži aktivačná energia reakcia, viac molekúl bude mať dostatočnú energiu na premenu na produkt a reakcia bude prebiehať rýchlejšie. Enzýmy navodzujú rýchlejší priebeh reakcie za bežných podmienok v bunke tým, že menia priebeh reakcie na taký, ktorý má nižšiu aktivačnú energiu. Enzýmy však nemenia energie reaktantov ani produktov a tak nemenia ani rovnováhu reakcie. Avšak enzýmy menia rýchlosť s ktorou sa docieli rovnováha reakcie. Aktívne miesto enzýmu nie je pasívne miesto na naviazanie substrátu, ale môžeme si ho predstaviť skôr ako komplexný molekulárny stroj, ktorý využíva rôzne chemické mechanizmy na premenu substrátu na produkt. Aktívne miesto často premenlivý vzor, ktorý viaže substrát a začína jeho premenu na aktivovaný komplex. Stabilizovaním aktivovaného komplexu enzým veľmi zvýši koncentráciu reaktívneho medziproduktu, ktorý môže byť premenený na produkt a tým sa zvyšuje rýchlosť reakcie. Aktívne miesto môže poskytnúť viacero katalytických funkčných skupín, ktoré zvyšujú pravdepodobnosť vzniku aktivovaného komplexu. V niektorých enzýmoch môžu tieto skupiny sa zúčastňovať protolytickej katalýzy, pri ktorej aminokyselinový zvyšok enzýmu môže prijímať alebo odovzdávať protón, v iných zase počas katalýzy kovalentne vzniká prechodný enzymovo-substrátový komplex (ES komplex). Enzýmy môžeme izolovať z bunky a ich vlastnosti môžu byť skúmané v laboratórnych podmienkach (in vitro). Rôzne enzýmy vykazujú rôzne reakcie na zmeny koncentrácie substrátu, teploty a pH. Reakcie enzýmov na tieto zmeny nám objasňujú ako enzýmy fungujú v organizme (in vivo). Rýchlosť chemickej reakcie vyjadruje množstvo substrátu premenného na produkty za jednotku času, väčšinou sa rýchlosť vyjadruje v μmol/min. Rýchlosť enzymatickej reakcie stúpa s koncentráciou substrátu až kým nedosiahne maximálnu rýchlosť (V max ). Ustálenie reakčnej rýchlosti pri vysokej koncentrácii substrátu odráža saturáciu všetkých väzobných miest na enzýmovej molekule substrátom. Väčšina enzýmov sa riadi Michalisovskou kinetikou, ktorej graf závislosti rýchlosti reakcie na koncentrácií substrátu má hyperbolický priebeh (podobný saturačnej krivke myoglobínu). Naopak, allosterické enzýmy sa neriadia Michaelisovskou kinematikou a ich graf má sigmoidálny tvar (podobný saturačnej krivke hemoglobínu). Reakčná rýchlosť stúpa so vzrastajúcou teplotou reakcie až kým sa nedocieli maximálnej rýchlosti. Tento vzrast rýchlosti je výsledkom zvýšeného množstva molekúl s dostatočným množstvom energie na prekonanie aktivačnej energie. Ďalšie zvyšovanie teploty spôsobí zníženie reakčnej rýchlosti, v dôsledku denaturácie enzýmov vysokou teplotou (optimum telesnej teploty pre ľudské enzýmy je 35-40°C, nad 40°C sa enzýmy začínajú denaturovať). Hodnota pH ovplyvňuje reakčnú rýchlosť viacerými spôsobmi. Za prvé, katalytický proces vyžaduje, aby enzým aj substrát obsahovali určité funkčné skupiny, buď v ionizovanej alebo neionizovanej forme, aby mohli spolu interagovať. Napr. počas reakcie môže byť nutné, aby bola aminoskupina enzýmu kladne nabitá (-NH 3+ ) , pri alkalickom pH je aminoskupina záporne nabitá (-NH - ) a preto sa reakcia spomaľuje. Po druhé, extrémne pH môže tiež spôsobiť denaturáciu enzýmov, lebo ich štruktúra, ako katalyticky aktívnych bielkovín, závisí na iónovom charaktere aminokyselín peptidového reťazca. Po tretie, maximálna enzýmová aktivita rôznych enzýmov vyžaduje určité pH prostredia. Napr. pepsín, ktorý je tráviacim enzýmom, je maximálne aktívny pri pH = 2, pričom iné enzýmy pracujú pri neutrálnom pH a v kyslom prostredí by denaturovali. Akákoľvek chemická látka, ktorá vie spomaliť chemickú reakciu sa nazýva inhibítor. Všeobecne sa ireverzibilné inhibítory viažu na enzým kovalentnými väzbami . Reverzibilné inhibítory sa viažu na enzým nekovalentnými väzbami a tak rozdelenie enzym- inhibitorového komplexu je spôsobené disociáciou reverzibilných väzieb inhibítora a obnovenie enzýmu. Hlavné dva typy reverzibilnej inhibície sú kompetitívna a nekompetitívna. Kompetitívna inhibícia nastáva najmä, keď sa inhibítor viaže na miesto väzby enzýmu so substrátom a preto inhibítor konkuruje substrátu o obsadenie tohto miesta. Efekt kompetitívneho inhibítora sa znižuje zvýšením koncentrácie substrátu. Pri dostatočnej koncentrácií substrátu dosiahne reakčná rýchlosť maxima, ktorého by dosiahla v neprítomnosti inhibítora. Kompetitívny inhibítor zvyšuje K m pre konkrétny substrát. To znamená, že v prítomnosti kompetitívneho inhibítora je potrebné viac substrátu na dosiahnutie ½ V max . Kompetitívna inhibícia vykazuje špecifické Lineweaver-Burkové zobrazenie, ktoré zobrazuje prelínanie inhibovanej a neinhibovanej reakcie na ose y. Inhibovaná a neinhibovaná reakcia vykazuje rozdiely na ose x, čo naznačuje, že konkrétna K m vzrastá v prítomnosti kompetitívneho inhibítora, lebo -1/K m je menej negatívna (obrázok vedľa). Nekompetitívny inhibítor je typický tým, že ovplyvňuje V max enzýmu. Nekompetitívny inhibítor sa viaže na iné miesto na enzýme ako substrát, môže sa viazať na voľný enzým alebo na ES komplex, čím ovplyvňuje reakciu. Účinky nekompetitívneho inhibítora nemôžeme zmierniť zvýšenou koncentráciou substrátu, z toho vyplýva, že tento typ inhibítora znižuje V max reakcie. Nekompetitívne inhibítory nezasahujú do väzby enzýmu a substrátu, preto nemení K m reakcie. Lineweaver-Burkov graf nekompetitívneho inhibítora sa líši od grafu kompetitívneho inhibítora, na grafe sa znižuje V max a K m sa nemení (obrázok vedľa). Príkladom nekompetitívnych inhibítorov môžu byť ťažké kovy, insekticídy a niektoré lieky. Regulácia enzýmovej aktivity e dôležitá pre koordináciu metabolických procesov v organizme. Rýchlosť väčšiny enzymatických reakcií reaguje na zmeny koncentrácií substrátov, lebo intracelulárna koncentrácia väčšiny substrátov rozsahu K m . Preto vzrast koncentrácie substrátu vyvolá vzrast rýchlosti reakcia, čím sa systém snaží vrátiť koncentráciu substrátu do normálu. Okrem toho, niektoré enzýmy so špeciálnymi regulačnými funkciami, reagujú na allosterické efektory alebo na kovalentné modifikácie alebo vykazujú zmeny intenzity ich metabolizmu (syntéza alebo degradácia enzýmu) pri zmene fyziologických podmienok. Allosterické enzýmy sú regulované molekulami, ktoré sa nazývajú efektory. Efektory sa viažu nekovalentne na enzým mimo aktívneho miesta. Tieto enzýmy vo všeobecnosti môžu obsahovať veľa podjednotiek a miesto regulácie (allosterické miesto), na ktoré sa viaže efektor, nemusí vykazovať katalytickú aktivitu. Naviazaný efektor môže ovplyvňovať afinitu enzýmu k substrátu, maximálnu katalytickú aktivitu enzýmu alebo oboje. Efektory, ktoré znižujú enzýmovú aktivitu sa nazývajú negatívne efektory a tie, ktoré ju zvyšujú sa nazývajú pozitívne efektory. Allosterické enzýmy často katalyzujú kľúčové reakcie metabolických dráh. Ak substrát pôsobí na enzým ako efektor, tento efekt sa nazýva homotropický. Najčastejšie však allosterické substráty pôsobia ako pozitívne efektory. V tomto prípade, prítomnosť substrátovej molekuly na jednom mieste enzýmu zvyšuje katalytické účinky iného substrátového miesta enzýmu – to znamená, že tieto miesta vykazujú kooperáciu. Tieto enzýmy vykazujú sigmoidálny priebeh grafu závislosti reakčnej rýchlosti na koncentrácií substrátu, tento graf sa líši do grafu Michaelisovskej kinetiky. Pozitívny alebo negatívny efektor allosterického enzýmu môže zmeniť V max , K 0,5 alebo oboje (obrázok vedľa). Ak efektorom nie je substrát, efekt tohto efektora sa nazýva heteropické. Príkladom heteropickej inhibície môže byť inhibícia spätnou väzbou. Napr. enzým, ktorý premieňa substrát jednej reakcie (označíme si D) na produkt inej reakcie metabolickej dráhy (označíme si E) má allosterické miesto pre väzbu koncového produktu metabolickej dráhy (označíme si G). Ak koncentrácia G vzrastie (kvôli jeho rýchlej spotrebe alebo pomalej syntéze), prvá ireverzibilná reakcia dráhy je väčšinou inhibovaná. Inhibícia spätnou väzbou napomáha bunke udržiavať si presné množstvo produktu, ktoré potrebuje, reguláciou substrátov počas syntézy produktu. Veľa enzýmov môže byť regulovaných kovalentnou modifikáciou, najčastejšie pridaním alebo odobratím fosfátových skupín z určitých serínových, treonínových alebo tyrozínových zvyškov enzýmu. Fosforylácia proteínov je jeden z hlavných procesov v bunke, ktorá je regulovaná. Fosforylácie sú katalyzované rodinou enzýmov, ktoré sa nazývajú proteín-kinázy, ktoré využívajú ATP ako zdroj fosfátu. Fosfátová skupina je odštiepená od fosforylovaného enzýmu účinkom fosfoproteínovej fosfatázy. V závislosti od určitého enzýmu, môže byť fosforylovaná forma viac alebo menej aktívna ako nefosforylovaná. Napr. fosforylovaná glykogén-fosforyláza (enzým, ktorý rozkladá glykogén) je aktívnejšia než jej defosforylovaná forma, naopak glykogén-syntáza (enzým, ktorý syntetizuje glykogén) fosforyláciou znižuje svoju aktivitu. Spomínané regulačné mechanizmy upravujú aktivitu existujúcich enzýmových molekúl. Avšak, bunky môžu taktiež môžu regulovať množstvo enzýmu zmenou rýchlosti enzýmovej degradácie alebo častejšie enzýmovej syntézy. Nárast (indukcia) alebo zníženie (represia) enzýmovej syntézy vedie k zmene celkového počtu enzýmov. Enzýmy, ktoré podliehajú regulácií syntézy sú väčšinou potrebné iba v určitom štádiu života alebo za určitých fyziologických podmienok. Napr. zvýšená koncentrácia inzulínu ako odpoveď vysokej koncentrácie glukózy v krvi, vyvoláva zvýšenie syntézy kľúčových enzýmov metabolizmu glukózy. Naopak, enzýmy, ktoré sa využívajú konštantne, väčšinou nepodliehajú regulácií rýchlosti ich syntézy. Zmeny enzýmovej koncentrácie ako výsledok indukcie alebo represie syntézy proteínov sú pomalé (trvajú hodiny až dni) v porovnaní s allostérickými a kovalentnými regulačnými zmenami, ktoré trvajú sekundy alebo minúty. Enzýmová aktivita sa meria podľa zvýšenia reakčnej rýchlosti za určitých podmienok (napr. pomocou rozdielu výťažkov katalyzovanej a nekatalyzovanej reakcie za rovnaký časový interval). Reakčná rýchlosť sa vyjadruje ako zmena koncentrácie za určitý čas [mol.l -1 .s -1 ]. Pretože enzýmová aktivita nezávisí na objeme, jednotkou pre enzymatické reakcie je katal, ktorý vyjadruje zmenu výťažku reakcie za jednotku času (kat [mol.s -1 ]). II/3. Energetika enzymové katalýzy. Kinetika monomerních a oligomerních enzymů, příklady. Km, kcat, katalytická účinnost enzymu. Michaelis a Mentenová navrhli jednoduchý model, ktorý platí pre väčšinu enzymaticky katalyzovaných reakcií. V tomto modely sa enzým reverzibilne viaže so substrátom za vzniku enzýmovo-substrátového komplexu (SE komplex), ktorý uvoľňuje produkt a ponecháva voľný produkt. Tento model je popísaný na obrázku vedľa. Michaelisova rovnica popisuje závislosť reakčnej rýchlosti na koncentrácií substrátu (vyjadrená na obrázku vedľa). Na odvodenie tejto rovnice sú potrebné niektoré predpoklady. Za prvé, koncentrácia substrátu je o veľa väčšia ako koncentrácia enzýmu, preto množstvo celkového substrátov naviazaných naraz na enzým y je malé. Za druhé, koncentrácia ES sa s časom nemení, to znamená, že množstvo novo vzniknutých a zaniknutých ES je v rovnováhe. Všeobecne platí, že medziprodukt v sérií reakcií je v ustálenom stave, keď rýchlosť jeho syntézy sa rovná rýchlosti jeho degradácie. Za tretie, počiatočná rýchlosť reakcie (v 0 ) je používaná na analýzu enzýmových reakcií. Rýchlosť reakcie sa začína merať hneď, ako sa zmieša enzým so substrátom. V tomto momente je koncentrácia produktu veľmi malá a preto rýchlosť spätnej reakcie môžeme zanedbať. Michaelisova konštanta (K m ; mol/l) charakterizuje určitý enzým a jeho špecifický substrát a popisuje afinitu enzýmu k substrátu. K m sa numericky rovná koncentrácií substrátu, pri ktorej bude rýchlosť reakcie rovná ½ V max . K m nezávisí na koncentrácií enzýmu. Malá hodnota K m znamená vysokú afinitu enzýmu k substrátu, lebo je potrebná nízka koncentrácia substrátu, aby sa saturovala polovica enzýmov a docielila sa tak ½ V max . Veľká hodnota K m znamená nízku afinitu enzýmu na substrát, lebo je potrebná vysoká koncentrácia substrátu na saturáciu polovice enzýmov. Reakčná rýchlosť je vždy priamo úmerná koncentrácii enzýmu. Napr. ak koncentrácia enzýmu sa zníži na polovicu, tak počiatočná a maximálna rýchlosť rekcie tiež klesnú na polovicu. Ak je koncentrácia substrátu nižšia ako K m , tak rýchlosť reakcie je približne úmerná koncentrácií substrátu. V tomto prípade hovoríme, že reakcia je prvého poriadku (řadu) vzhľadom na koncentráciu substrátu. Ak je koncentrácia substrátu o veľa väčšia ako K m , rýchlosť konštantná a rovná V max: Rýchlosť reakcie je teda nezávislá na koncentrácií substrátu a preto ide o reakciu nultého poriadku (řádu) vzhľadom na koncentráciu substrátov. Ak vytvoríme graf závislosti v o na koncentrácií substrátu, nie vždy na ňom je možné určiť, kedy bola dosiahnutá maximálna rýchlosť, kvôli postupnému zvyšovaniu hyperbolického priebehu krivky pri vyšších koncentráciách substrátu. Avšak, ak vytvoríme graf závislosti 1/v 0 na 1/[S], dostaneme rovnú krivku. Toto znázornenie sa nazýva znázornenie podľa Lineweavera-Bruka a je možné z neho vypočítať K m , V max a určiť mechanizmus účinku enzymatických inhibítorov. Toto znázornenie je možné vyjadriť rovnicou: 1 푣 0 = 퐾 푚 푉 푚푎푥 [푆] + 1 푉 푚푎푥 Enzýmová aktivita sa meria podľa zvýšenia reakčnej rýchlosti za určitých podmienok (napr. pomocou rozdielu výťažkov katalyzovanej a nekatalyzovanej reakcie za rovnaký časový interval). Reakčná rýchlosť sa vyjadruje ako zmena koncentrácie za určitý čas [mol.l -1 .s -1 ]. Pretože enzýmová aktivita nezávisí na objeme, jednotkou pre enzymatické reakcie je katal, ktorý vyjadruje zmenu výťažku reakcie za jednotku času (kat [mol.s -1 ]). II/4. Inhibice enzymů: kompetitivní, nekompetitivní, kovalentní, allosterická. Využití enzymových inhibitorů v medicíně. Akákoľvek chemická látka, ktorá vie spomaliť chemickú reakciu sa nazýva inhibítor. Všeobecne sa ireverzibilné inhibítory viažu na enzým kovalentnými väzbami . Reverzibilné inhibítory sa viažu na enzým nekovalentnými väzbami a tak rozdelenie enzym- inhibitorového komplexu je spôsobené disociáciou reverzibilných väzieb inhibítora a obnovenie enzýmu. Hlavné dva typy reverzibilnej inhibície sú kompetitívna a nekompetitívna. Kompetitívna inhibícia nastáva najmä, keď sa inhibítor viaže na miesto väzby enzýmu so substrátom a preto inhibítor konkuruje substrátu o obsadenie tohto miesta. Efekt kompetitívneho inhibítora sa znižuje zvýšením koncentrácie substrátu. Pri dostatočnej koncentrácií substrátu dosiahne reakčná rýchlosť maxima, ktorého by dosiahla v neprítomnosti inhibítora. Kompetitívny inhibítor zvyšuje K m pre konkrétny substrát. To znamená, že v prítomnosti kompetitívneho inhibítora je potrebné viac substrátu na dosiahnutie ½ V max . Kompetitívna inhibícia vykazuje špecifické Lineweaver-Burkové zobrazenie, ktoré zobrazuje prelínanie inhibovanej a neinhibovanej reakcie na ose y. Inhibovaná a neinhibovaná reakcia vykazuje rozdiely na ose x, čo naznačuje, že konkrétna K m vzrastá v prítomnosti kompetitívneho inhibítora, lebo -1/K m je menej negatívna (obrázok vedľa). Nekompetitívny inhibítor je typický tým, že ovplyvňuje V max enzýmu. Nekompetitívny inhibítor sa viaže na iné miesto na enzýme ako substrát, môže sa viazať na voľný enzým alebo na ES komplex, čím ovplyvňuje reakciu. Účinky nekompetitívneho inhibítora nemôžeme zmierniť zvýšenou koncentráciou substrátu, z toho vyplýva, že tento typ inhibítora znižuje V max reakcie. Nekompetitívne inhibítory nezasahujú do väzby enzýmu a substrátu, preto nemení K m reakcie. Lineweaver-Burkov graf nekompetitívneho inhibítora sa líši od grafu kompetitívneho inhibítora, na grafe sa znižuje V max a K m sa nemení (obrázok vedľa). Príkladom nekompetitívnych inhibítorov môžu byť ťažké kovy, insekticídy a niektoré lieky. Regulácia enzýmovej aktivity e dôležitá pre koordináciu metabolických procesov v organizme. Rýchlosť väčšiny enzymatických reakcií reaguje na zmeny koncentrácií substrátov, lebo intracelulárna koncentrácia väčšiny substrátov rozsahu K m . Preto vzrast koncentrácie substrátu vyvolá vzrast rýchlosti reakcia, čím sa systém snaží vrátiť koncentráciu substrátu do normálu. Okrem toho, niektoré enzýmy so špeciálnymi regulačnými funkciami, reagujú na allosterické efektory alebo na kovalentné modifikácie alebo vykazujú zmeny intenzity ich metabolizmu (syntéza alebo degradácia enzýmu) pri zmene fyziologických podmienok. Allosterické enzýmy sú regulované molekulami, ktoré sa nazývajú efektory. Efektory sa viažu nekovalentne na enzým mimo aktívneho miesta. Tieto enzýmy vo všeobecnosti môžu obsahovať veľa podjednotiek a miesto regulácie (allosterické miesto), na ktoré sa viaže efektor, nemusí vykazovať katalytickú aktivitu. Naviazaný efektor môže ovplyvňovať afinitu enzýmu k substrátu, maximálnu katalytickú aktivitu enzýmu alebo oboje. Efektory, ktoré znižujú enzýmovú aktivitu sa nazývajú negatívne efektory a tie, ktoré ju zvyšujú sa nazývajú pozitívne efektory. Allosterické enzýmy často katalyzujú kľúčové reakcie metabolických dráh. Ak substrát pôsobí na enzým ako efektor, tento efekt sa nazýva homotropický. Najčastejšie však allosterické substráty pôsobia ako pozitívne efektory. V tomto prípade, prítomnosť substrátovej molekuly na jednom mieste enzýmu zvyšuje katalytické účinky iného substrátového miesta enzýmu – to znamená, že tieto miesta vykazujú kooperáciu. Tieto enzýmy vykazujú sigmoidálny priebeh grafu závislosti reakčnej rýchlosti na koncentrácií substrátu, tento graf sa líši do grafu Michaelisovskej kinetiky. Pozitívny alebo negatívny efektor allosterického enzýmu môže zmeniť V max , K 0,5 alebo oboje (obrázok vedľa). Ak efektorom nie je substrát, efekt tohto efektora sa nazýva heteropické. Príkladom heteropickej inhibície môže byť inhibícia spätnou väzbou. Napr. enzým, ktorý premieňa substrát jednej reakcie (označíme si D) na produkt inej reakcie metabolickej dráhy (označíme si E) má allosterické miesto pre väzbu koncového produktu metabolickej dráhy (označíme si G). Ak koncentrácia G vzrastie (kvôli jeho rýchlej spotrebe alebo pomalej syntéze), prvá ireverzibilná reakcia dráhy je väčšinou inhibovaná. Inhibícia spätnou väzbou napomáha bunke udržiavať si presné množstvo produktu, ktoré potrebuje, reguláciou substrátov počas syntézy produktu. Veľa enzýmov môže byť regulovaných kovalentnou modifikáciou, najčastejšie pridaním alebo odobratím fosfátových skupín z určitých serínových, treonínových alebo tyrozínových zvyškov enzýmu. Fosforylácia proteínov je jeden z hlavných procesov v bunke, ktorá je regulovaná. Fosforylácie sú katalyzované rodinou enzýmov, ktoré sa nazývajú proteín-kinázy, ktoré využívajú ATP ako zdroj fosfátu. Fosfátová skupina je odštiepená od fosforylovaného enzýmu účinkom fosfoproteínovej fosfatázy. V závislosti od určitého enzýmu, môže byť fosforylovaná forma viac alebo menej aktívna ako nefosforylovaná. Napr. fosforylovaná glykogén-fosforyláza (enzým, ktorý rozkladá glykogén) je aktívnejšia než jej defosforylovaná forma, naopak glykogén-syntáza (enzým, ktorý syntetizuje glykogén) fosforyláciou znižuje svoju aktivitu. Spomínané regulačné mechanizmy upravujú aktivitu existujúcich enzýmových molekúl. Avšak, bunky môžu taktiež môžu regulovať množstvo enzýmu zmenou rýchlosti enzýmovej degradácie alebo častejšie enzýmovej syntézy. Nárast (indukcia) alebo zníženie (represia) enzýmovej syntézy vedie k zmene celkového počtu enzýmov. Enzýmy, ktoré podliehajú regulácií syntézy sú väčšinou potrebné iba v určitom štádiu života alebo za určitých fyziologických podmienok. Napr. zvýšená koncentrácia inzulínu ako odpoveď vysokej koncentrácie glukózy v krvi, vyvoláva zvýšenie syntézy kľúčových enzýmov metabolizmu glukózy. Naopak, enzýmy, ktoré sa využívajú konštantne, väčšinou nepodliehajú regulácií rýchlosti ich syntézy. Zmeny enzýmovej koncentrácie ako výsledok indukcie alebo represie syntézy proteínov sú pomalé (trvajú hodiny až dni) v porovnaní s allostérickými a kovalentnými regulačnými zmenami, ktoré trvajú sekundy alebo minúty. II/5. Dýchací řetězec. Oxidativní fosforylace. Mitochondrie sú ohraničené dvomi membránami. Vonkajšia membrána obsahuje poríny, ktorými môžu prechádzať molekuly veľké až 10 kDa. Oproti tomu vnútorná membrána je nepriepustná aj pre malé molekuly (s výnimkou O 2 a CO 2 ). Všetky substráty pre mitochondriálny metabolizmus aj jeho produkty musia k prechodu cez vnútornú membránu využívať špecifické transportéry (člunky). Import bielkovín kódovaných v jadre zaisťuje zvláštny transportný systém. Ktorý prechádza obomi membránami Smer a rýchlosť transportu cez vnútornú membránu mitochondrií závisí na stavu metabolizmu. Sacharidy sú v cytoplazme degradované na pyruvát, ktorý sa do matrix dostáva monokarboxylátovým transportérom. NADH, ktoré sa súčasne tvorí, vstupuje nepriamo pomocou člunků. Mastné kyseliny prechádzajú do matrix ako acyl-CoA pomocou karnitínového člunku. Aminodusík do matrix vstupuje predovšetkým v podobe glutamínu a glutamáu. ATP vytvorené v matrix prechádzajú do cytoplazmy výmenou za ADP. Ak prebieha anabolický metabolizmus, exportujú sa z mitochondrie predovšetkým oxalacetát a citrát ako prekurzory glukoneogenézy a biosyntézy mastných kyselín. Transport spřažený s hydrolýzou ATP (aktívny transport v užšom slova zmysle) nemá pre mitochondriu väčší význam. Hnacou silou väčšiny transportných dejov sú protónový gradient a membránový potenciál na vnútornej membráne. Vďaka 10-100 krát väčšej koncentrácii H + v medzimembránovom priestore a nerovnomernému rozloženiu iónov je potenciál matrix o 180-200 mV zápornejší ako vonku z mitochondrie. Tým sú zvýhodnené všetky presuny, pri ktorých sa premiesia záporný náboj do medzibunkového priestoru alebo kladný náboj do matrix. To je prípad napr. ATP/ADP-translokázy alebo trikarboxylátového transportéru. Pyruvát vznikajúci v cytoplazme sa do matrix dostáva antiportom proti OH - . Ide o takmer elektroneutrálny dej. Ióny OH - však v medzibunkovom priestore nevratne reagujú s prítomnými iónmi H + za vzniku H 2 O. Vďaka tomu sa udržuje gradient OH - . Protónovým gradientom je poháňaný aj kotransport fosfátu a H + pomocou fosfátového transportéru. NADH nemá vo vnútornej membráne žiadny transportér, musí sa teda z cytoplazmy do matrix dostať nepriamo. Malátový člunek je aktívny napr. v srdci, pečeni a ľadvinách. V cytoplazme sa pomocou NADH redukuje oxalacetát na malát účinkom malátdehydrogenázy. Malát potom vstupuje do matrix antiportom proti 2-oxoglutarátu. Miochondriálny izoenzým MAH potom regeneruje oxalacetát a NADH. NADH sa potom oxiduje v dýchacom reťazci. Oxalacetát nemá na vnútornej membráne mitochondrií žiadny transportér, ktorým by mohol mitochondrie opustiť. Najprv sa preto trasaminuje aspartátaminotransferázou na aspartát. Ten opúšťa mitochondrie a v cytoplazme sa mení opäť na oxalacetát a glutamát, transportovaný späť do matrix. Súhrne dochádza k presunu NADH z cytoplazmy do matrix bez toho, aby sa pritom spotrebovalo ATP. Glycerolfosfátový člunek je aktívny v kostrovom svalstve a v mozgu vyšších živočíchov. V tomto deji sa NADH využíva k redukcii medziproduktu glykolýzy, glyceron-3-fosfátu na glycerol-3-fosfát. Ten prechádza cez porín do medzimembránového priestoru a na vonkajšej strane membrány sa znova oxiduje na glyceron-3-fosfát pomocou glycerol-3-fosfodehydrogenázy. Redukčné ekvivalenty sa cez ubichinon prenášajú do dýchacieho reťazca. Dýchací reťazec je súčasťou oxidatívnej fosforylácie. Katalyzuje postupný transport elektrónov z NADH a redukovaného ubichinónu (QH 2 ) na molekulárny kyslík. Vďaka veľkému rozdielu redoxných potenciálov donoru (NADH alebo QH 2 ) a akceptoru (O 2 ) je táto reakcia výrazne exergonická. Získaná energia sa z väčšej časti používa na vytvorenie protónového gradientu naprieč vnútornou mitochondriálnou membránou a ten sa nasledovne použije na syntézu ATP pomocouATP-syntázy. Elektrónový transportný reťazec obsahuje tri veľké bielkovinové komplexy (komplex I, III a IV) vnorené do vnútornej mitochondriálnej membrány a dve pohyblivé prenášačove molekuly, ubichinon (koenzým Q) a cytochorom c. K dýchaciemu reťazcu sa ako komplex II priradzuje aj sukcinátdehydrogenáza, ktorá je súčasťou citrátového cyklu. ATP-syntáza sa niekedy tiež označuje ako komplex V, nepodieľa sa však na transporte elektrónov. Komplexy dýchacieho reťazca sa skladajú z mnohých podjednotiek. Obsahujú redoxné kofaktory naviazané na bielkovinu. Patria k ním flavíny (FMN a FAD), FeS-clustry (v I, II a III) a hemové skupiny (v II, III, IV). Z viac ako 80 polypeptidov dýchacieho reťazca je mitochondriálnym genómom syntetizovaných iba 13. Všetky ostatné sa kódujú v jadre a po syntéze v cytoplazme musia byť do mitochondrie importované. Do dýchacieho reťazca vstupujú elektróny z rôznych zdrojov. Pri oxidácii NADH putujú skrz komplex I cez FMN a FeS-cluster na ubichinon (Q). Elektróny získané oxidáciou sukcinátu, acyl-CoA a ďalších substrátov sa prenášajú cez sukcinátdehydrogenázu a iné mitochondriálne dehydrogenázy na FADH viazané na enzýme a ďalej predáva na komplex III, odkiaľ putujú cez dve hemové skupiny typu b, jeden FeS-cluster a hem c 1 na malý hemoproteín, cytochrom c. Z neho sa transportujú na komplex IV, cytochrom-c-oxidázu. Jej redoxne aktívnymi časťami sú 2 atómy medi a hemy. Cez ne sa elektróny konečne prenesú na kyslík. Dvojelektrónovou redukciou 1/2 O 2 vzniká, pri najmenšom formálne, silne zásaditý anión O 2- , ktorý reaguje s dvomi protónmi za vzniku vody. Vďaka vlastnostiam komplexov I, III a IV sprevádza prenos elektrónov vznik protónového gradientu. Transport protónov komplexami I, III a IV prebieha usmernene z matrix do mitochondriálneho priestoru. Súčasne s transportom elektrónov dýchacím reťazcom sa zvyšuje koncentrácia H + medzi membránami, tj. Hodnota pH klesá asi o 1. Na každú novo vytvorenú molekulu H 2 O sa do medzimembránového priestoru prečerpá asi 10 iónov H + . Ak je vnútorná membrána celistá, umožňuje ich návrat do matrix iba ATP-syntáza. Tým vzniká regulačne významné spřažení elektrónového transportu a tvorby ATP. Aj napriek tomu, že komplexy I až V sú súčasťou mitochondriálnej membrány, nie sú v bezprostrednom kontakte a elektróny medzi nimi prenáša ubichinon a cytochrom c. Ubichinon sa v membráne môže voľne pohybovať vďaka svojmudlhému nepolárnemu reťazcu. Vo vode rozpustný cytochrom c sa nachádza na vonkajšej strane membrány. Oxidácia NADH komplexom I prebieha na vnútornej strane membrány a v priestore matrix. Na rovnakej strane sa nachádzajú aj najdôležitejšie zdroje NADH, citrátový cyklus a β-oxidácia. V matrix prebieha aj redukcia O 2 a tvorba ATP. Vzniknuté ATP sa transportuje do medzimembránového priestoru proti ADP a potom postupuje porínmy do cytoplazmy. V dýchacom reťazci sa prenášajú elektróny z NADH alebo ubichinónu na O 2 . Energia, ktorá sa pri tom získa, sa využíva k vytvoreniu protónového gradientu naprieč vnútornou mitochondriálnou membránou. Návrat protónov z medzimembránového priestoru späť do matrix je potom spojený so syntézou ATP. Elektróny uvoľnené z NADH prechádzajú na kyslík postupne. Pritom prechádzajú najmenej desiatimi redoxnými systémami. Hlavné z nich sú zabudované v komplexoch I, III, IV ako prostetické skupiny. Veľký počet koenzýmov, ktoré sa na transporte elektrónov podieľajú, je na prvý pohľad prekvapivý. Voľná entalpia ΔG, tj. uvoľnená energia pri redoxných reakciách závisí iba na rozdielu redoxných potenciálov donoru a akceptoru. Vložením ďalších redoxných systémov sa zisk energie z reakcie nemení. V prípade dýchacieho reťazca odpovedá rozdiel štandardných potenciálov donoru (NAD + /NADH, E 0 = -0,32 V) a akceptoru (O 2 /H 2 O, E 0 = +0,82 V) energetického rozdielu viac ako 200 kJ/mol. To je príliš veľa a energia je preto rozdelená do menších „dávok“, ktorých veľkosť je daná redoxnými potenciálmi jednotlivých medziproduktov. Vďaka tomu je účinnosť využitia energie v dýchacom reťazci pomerne vysoká, okolo 60%. Redoxnými potenciálmi jednotlivých redoxných systémov dýchacieho reťazca je určená cesta elektrónov medzi súčasťami dýchacieho reťazca. Aby transport mohol prebiehať spontánne, musia totiž byť zoradené do redoxnej rady tak, aby ich redoxné potenciály stúpali. Na komplexe I sa elektróny prenášajú z NADH+H + na FMN a ďalej prechádzajú na FeS-cluster. Tie sú stabilné len vo vnútri bielkovín. Podľa typu obsahujú 2 až 6 iónov železa, ktoré sa komplexne viažu na SH-skupiny cysteinových zvyškov. Ubichinon (koenzým Q) je pohyblivý prenášač, ktorý prijimá elektróny z komplexov I a II a z ETF a prenáša ich na komplex III. Elektróny prenáša aj niekoľko typov hemových skupín. Hemy typu b odpovedajú hemoglobínu. Na bielkovinu cytochromu c sa kovalentne viaže na hem c. Hem a obsahuje izoprenylovaný tetrapyrolovýkruh, ktorý nesie formylovú skupinu. V komplexe IV reagujú ióny medi (Cu B ) a hem a 3 priamo s kyslíkom. ATP-syntáza, ktorá dokáže transportovať H + (komplex V), je komplikovaný „molekulárny stroj“. Skladá sa z dvoch častí, protónového kanálu, ktorý prechádza membránou (F O podľa „oligomycin-senzitívneho“) a katalytického jednotky (F 1 ), ktorá vyčnieva do matrix. F O je zostavená z 12 peptidov c, prechádzajúcich membránou a z jednej podjednotky a. „Hlava“ F 1 je zostavená z troch podjednotiek α a troch β-podjednotiek, medzi ktorými sa nachádzajú tri aktívne centra. „Hřídel“ medzi F O a F 1 sa skladá z podjednotiek γ a ε. Ďalšie 2 polypeptidy, b 2 a δ, tvoria „stator“, ktorým sú podjednotky α a β prichytené k F O . Katalytický cyklus môžeme rozdeliť do troch fázi. Každé z troch aktívnych centier nimi postupne prechádza. Najprv sa naviaže ADP a P i , potom sa vytvorí anhydridová väzba a nakoniec sa uvoľní produkt. Vždy, keď prejdú protóny kanálom tvoreným F O do matrix, prejdú všetky tri aktívne centra do ďalšieho stavu. Je možné ukázať, že energia transportu protónov sa premieňa najprv rotáciou podjednotky γ. Vďaka tomu sa cyklicky mení konformácia podjednotiek α a β, ktoré sa voči F O takmer nepohybujú a tieto zmeny konformácie poháňajú tvorbu ATP. Odbúravanie živín a tvorba ATP musia odpovedať neustále meniacemu sa energetickým nárokom organizmu. Produkcia ATP musí odpovedať jeho spotrebe tiež preto, že celkové množstvo koenzýmov v organizme je malé. V ľudskom tele sa denne vytvorí asi 65 kgATP, celkový obsah adeninových nukleotidov (AMP, ADP a ATP) je však iba 3-4 g. Každá molekula ADP sa teda za deň niekoľkotisíckrát fosforyluje na ATP a opäť defosforyluje. Jednoduchý regulačný metabolizmus, ktorý „automaticky“ prispôsobuje ATP jeho spotrebe, sa označuje ako riadenie dýchania. Spočíva v tom, že citrátový cyklu, dýchací reťazec a syntéza ATP sú spojené spoločnými koenzýmami. Pokiaľ bunka spotrebuje malo ATP, nie je v mitochondriách dostatok ADP. Bez ADP však ATP-syntáza nemôže znižovať protónový gradient na vnútornej mitochondriálnej membráne. Tým sa spomalí transport elektrónov v dýchacom reťazci, takže sa NADH prestane oxidovať na späť na NAD + . Výsledný vysoký pomer NADH/NAD + konečne inhibuje citrátový cyklus a spomaľuje odbúravanie substrátov AH 2 . Analogicky veľká spotreba ATP stimuluje degradáciu živín a dýchací reťazec. Ak rýchlejšie prebieha oxidácia substrátov a transport elektrónov, ak tvorbe elektrónového gradientu bráni napr. rozpojenie dýchacieho reťazca. Namiesto ATP potom vzniká teplo. Látky, ktoré funkčne oddelia oxidáciu a fosforyláciu sa označujú ako rozpojovače. Znižujú protónový gradient – ióny H + sa vrátia z medzimembránového priestoru do mitochondriálnej matrix bez toho, aby prešli ATP-syntázou. Rozpojenie dýchacieho reťazca spôsobí napr. poškodenie vnútornej mitochondriálnej membrány alebo látky rozpustné v tukoch, ktoré môžu transportovať protóny cez membránu – napr. 2,4-dinitrofenol. Ako telu vlastný rozpojovač funguje bielkovina UCP-1 (uncoupling protein 1 alebo „termogenín“). Ide o mitochondriálny iónový kanál, ktorý sa vyskytuje v hnedom tukovom tkanive. Hnedý tuk nájdeme u novorodencov a zvierat, ktoré hybernujú. Slíži výhradne pre tvorbu tepla. Chladom sa cez noradrenalín aktivuje hormonsenzitívna lipáza. Rýchlejšia lipolýza vytvorí v adipocytoch veľké množstvo voľných mastných kyselín, ktoré aktivujú transport H + pomocou UCP-1. Tým sa stane odbúravanie mastných kyselín nezávislé na hladine ADP, tj. Začne prebiehať maximálnou rýchlosťou a tvorí sa len teplo. Ukazuje sa, že UCP proteíny sú aj v iných bunkách a riadia ich hormóny ako tyroxín. Podieľajú sa na regulácii výťažku ATP a tzv. bazálneho metabolizmu. Ďalší spoločný regulačný mechanizmus, ktorý riadi aktivitu anabolických a katabolických dráh v závislosti na prísunu ATP, je založený na aktivite zvláštnej proteínkinázy aktivovanej adenozínmonofosfátom (AMP). Túto tzv. proteínkinázu závislú na AMP (AMPK) nájdeme hlavne v pečeni, svaloch a CNS. Anabolické dráhy a endergonické deje, ako je svalová kontrakcia, spotrebujú veľa ATP a zvyšujú intracelulárnu hladinu ADP. Ak je koncentrácia ADP vysoká, začne adenylátkináza premieňať ADP na ATP a AMP. AMP aktivuje AMPK, ktorá potom aktivuje množstvo kľúčových enzýmov intermediárneho metabolizmu. Inhibujú sa tak anabolické dráhy, ktoré spotrebúvajú ATP a naopak sa aktivujú katabolické dráhy, ktoré ATP produkujú. Ak sa opäť zvýši hladina ATP, znižuje sa množstvo AMP a s ním aj aktivita kinázy. V pečeni AMPK stimuluje napr. β-oxidáciu a ketogenézu, zatiaľ čo syntéza mastných kyselín je inhibovaná kvôli inaktivácii acetyl-CoA karboxylázy . V svaloch AMPK stimuluje hlavne spotrebu glukózy prostredníctvom aktivácie Glut-4 a inhibuje tvorbu glykogénu. II/6. Tzv. „makroergní“ sloučeniny, fosforylace na substrátové úrovni, pohon endergonních reakcí. Nukleotidový koenzým adenozíntrifosfát (ATP) slúži vo všetkých bunkách ako najdôležitejšia zásobná forma chemickej energie. Hydrolýza ATP je výrazne exergonická. Energia, ktorá sa pri nej uvoľní (ΔG) sa vďaka energetickému spřahování zužitkuje pre endergonické procesy, ako sú napr. biosyntézy, pohyb a transportné deje. Ďalšie nukleotidtrifosfáty (GTP, CTP a UTP) majú podobné chemické vlastnosti, v metabolizme však majú iné úlohy. ATP je nukleotidtrifosfát zložený z nukleozidu adenozínu, na ktorého 5 ́-OH skupinu je pripojený reťazec troch fosfátových zvyškov. Označujú sa ako α, β a γ. Fosfát α je pripojený k ribóze fosfoesterovou väzbou. Oproti tomu väzby medzi jednotlivými fosfátmi sú o veľa labilnejšie, ide o fosfoanhydridové väzby, Vlastným účinným koenzýmom je komplex ATP s iónom Mg 2+ , ktorý sa koordinačne viaže na fosfátové zvyšky α a β; pre jednoduchosť sa však hovorí len o ATP. Štruktúrny vzorec ATP s jednoduchými a dvojitými väzbami vo fosfátových zvyškoch neukazuje presne rozloženie náboja. Kyslíkové atómy všetkých fosfátov majú približne rovnaký záporný náboj, pričom atómy fosforu v strede sú nabité kladne. Dôvodom pre labilitu fosfoanhydridových väzieb sú odpudivé sily medzi záporne nabitými kyslíkovými atómami, ktoré pri odštiepení fosfátového zvyšku čiastočne zmiznú, Okrem toho sa fosfátový anión, ktorý vznikne hydrolýzou ATP, lepšie hydratuje a výraznejšie mezomérne stabilizuje ako odpovedajúci zvyšok v ATP. To všetko prispieva silne exergonickému priebehu hydrolýzy ATP. Zmena voľnej ΔG 0 hydrolýzy fosfoanhydridovej väzby je pri pH 7 a za štandardných podmienok medzi -30 až -35 kJ.mol -1 . Na túto hodnotu má len malý vplyv, ktorá z anhydridových väzieb ATP sa rozštiepi. Samotná hydrolýza difosfátu má ΔG 0 o niečo väčšie ako -30 kJ.mol -1 . Naopak štiepenie esterovej väzby medzi ribózou a fosfátom vydá len -9 kJ.mol -1 . Skutočná ΔG hydrolýzy ATP je v bunke ešte podstatnejšie vyššia, lebo koncentrácia ATP, ADP a P i je oveľa nižšia než za štandardných podmienok (= 1 mol/l) a ATP je v nadbytku voči ADP. Hodnotu ΔG ovplyvňuje aj pH a koncentrácia Mg 2+ . Fyziologický energetický zisk z hydrolýzy ATP na ADP a anorganický fosfát (P i ) sa pohybuje okolo -50 kJ/mol. Len málo zlúčenín obsahuje fosfátové zvyšky s chemickým potenciálom, ktorý by bol dostatočný, aby sa vďaka nemu mohlo ADP fosforylovať za súčasnej syntézy ATP. Deje, ktoré udelia anorganickému fosfátu až tak vysoký chemický potenciál, označujeme ako fosforylácie na substrátovej úrovni. Stretneme sa s nimi len v priebehu glykolýzy a v citrátovom cykle. Energeticky bohatou zlúčeninou fosforu je tiež kreatínfosfát, ktorý vzniká v svaloch z ATP a dokáže ATP opäť regenerovať. Väčšina bunkového ATP vzniká iným spôsobom (tj. nie prenosom fosfátových zvyškov z organických molekúl na ADP), ale oxidatívnou fosforyláciou. Ide o proces, ktorý prebieha v mitochondriách (v rastlinách aj v chloroplastoch) a je energeticky spojený s protonovým gradientom na membráne. Tento gradient H + vzniká vďaka dýchaciemu reťazcu a slúži ako zdroj energie pre enzým ATP-syntázu, ktorý dokáže na ADP priamo napojiť anorganický fosfát. Na rozdiel od fosforylácii na substrátovej úrovni je oxidatívna fosforylácia závislá na dostupností kyslíku (prebieha iba aeróbne). Energetickým spřahováním sa rozumie mechanizmus, ktorým sa proces závislý na energii (tj. Endergonický) funkčne prepojuje s druhým dejom, ktorý mu dodáva energiu (je exergonický). Oba deje potom z termodynamického hľadiska môžu prebiehať spontánne. Napr. vo vreckovej svítilne je endergonické vydávanie svetla spřažené s exergonickou chemickou reakciou. Exergonický tok elektrónov sa využíva pre endergonický dej. Endergonické deje všetkých možných typov sa v živých bunkách spřahují s jednou konkrétnou reakciou, štiepením adenozíntrifosfátu (ATP) na ADP a podobné molekuly preto označujeme ako makroergické zlúčeniny. Tento výraz je zle chápaný: väzbové energie medzi atómami v ATP nie sú väčšie ako v iných molekulách. Pri prenose fosfátu z ATP na iné molekuly sa však premení veľké množstvo energie (merané ako ΔG). Aby sme mohli posúdiť potenciál prenosu skupiny z makroergickej zlúčenín, porovnávame zmeny voľnej entalpie ΔG 0 ́ jej hydrolýzy. To však neznamená, že v energeticky spřažených reakciách naozaj dochádza len výhradne k hydrolýze ATP. Keby vedľa seba prebiehali hydrolýza ATP a endergonický proces, uvoľnila by sa pri hydrolýze energia ako teplo bez toho, aby ovplyvnila priebeh enedrgonického deja. Aby sme mohli hovoriť o chemickom spřahovaní, musia byť oba deje sprevádzané spoločným medziproduktom. Ako príklad by sa dala uviesť glutamínsyntetázová reakcia. Priamy prenos NH 4 + na glutamát je endergonický (ΔG 0 ́ = +14 kJ/mol) takže za štandardných podmienok nemôže prebiehať spontánne. V bunke prebieha postupne v dvoch krokoch, ktoré sú oba exergonické. Najprv sa na glutamát prenesie fosfátový zvyšok γ z ATP. Pritom vzniká makroergický zmiešaný anhydrid kyselín. V druhom kroku je fosfátový zvyšok substituovaný NH 3 a vzniká glutamín a voľný fosfát. Energetická bilancia sumárnej reakcie (ΔG 0 ́ = -17 kJ/mol) odpovedá súčtu zmien voľných entalpií priamej tvorby glutamátu(ΔG 0 ́ = +14 kJ/mol) a hydrolýzy ATP (ΔG 0 ́ = -31 kJ.mol.l -1 ), aj keď v skutočnosti vlstne k hydrolýze ATP vôbec nedošlo. V bunkách je len niekoľko málo metabolitov, ktoré môžu preniesť fosfát na ADP v exergonickej reakcii a vytvoriť tak ATP. Prenos anorganického fosfátu alebo esterovo viazaného fosfátu na ADP zo zlúčeniny s vysokým potenciálom prenosu fosfátu sa označuje ako fosforylácia na substrátovej úrovni. V jednom kroku glykolýzy, reakcii glyceraldehyd-3- fosfátdehydrogenázy sa oxiduje aldehydová skupina glceraldehyd-3-fosfátu na karboxylovú skupinu. Súčasne sa na molekulu produktu naviaže anorganický fosfát, takže vzniká zmiešaný anhydrid (1,3-bisfosfoglycerát). Fosofenolpyruváthydratáza (enoláza) katalyzuje odštiepenie vody od 2-fosfoglcerátu. Vo vzniknutom enolfosfáte (fosfoenolpyruvátu) má fosfátový zvyšok, v porovnaní s 2- fosfoglycerátom, extrémne vysoký potenciál (ΔG 0 ́ pre hydrolýz je -62 kJ/mol). Treťou reakciou tohto typu je vznik sukcinylfosfátu, ktorý prebieha v rámci citrátového cyklu ako jeden z krokov reakcie katalyzovanej sukcinyl-CoA-ligázou (thiokinázou). V tomto prípade opäť anorganický fosfát vstupuje do zmiešanej anhydridovej väzby a odtiaľ sa prenáša na GDP. Sukcinylfosfát je pritom len medziprodukt, ktorý sa neuvoľňuje z enzýmu. Termín fosforylácia na substrátovej úrovni sa používa nejednotne. Niektorí autori ním označujú reakcie, pri ktorých sa fosfát dostane na vysokú potenciálnu hladinu, iní tak označujú nasledujúcu reakciu, v ktorej sa z makroergického medziproduktu tvorí ATP alebo GTP. Okrem ATP, ktorá je najvýznamnejšou makroergnou žlúčeninou, existujú aj iné makroergné zlúčeniny. Ostatné nukleozidtrifosfáty sú menej univerzálne a používajú sa pre špecifické účely. Napr. UTP slúži k aktivácií sacharidov a pre ich vstup do metabolických dráh. Enolfosfáty obsahujú –OH skupinu, ktorá sa estericky viaže na fosfát. Najdôležitejší predstaviteľ, fosfoenolpyruvát (PEP), je makroergnou zlúčeninou s energeticky najväčším potenciálom ΔG (až -61,9 kJ/mol). Preto je tiež reakcia premeny PEP na pyruvát nevratnou reakciou glykolýzy. Acylfosfáty obsahujú anhydridovú väzbu –COOH s fosfátom. Patria nim karbamoylfosfát (využíva sa v močovinovom cykle) alebo 1,3-bisfosfoglycerá (medziprodukt glykolýzy). Medzi ďalšie makroergné zlúčeniny patria guanindifosfáty (napr. kreatinfosfát) alebo thioestery a thioétery (deriváty HS-CoA, SAM). Niekedy sa môžeme stretnúť s pojmom nízkoenergetické fosfáty. Podľa klasickej definície je makroergná zlúčenina taká, ktorá dokáže po zánik väzby uvoľniť energiu minimálne 25 kJ/mol. Medzi nízkoeneretické fosfáty patrí napr. glukóza-6-fosfát a uvoľní menej energie, medzi 9-20 kJ/mol. II/7. Citrátový cyklus, amfibolický charakter, průběh, regulace. Citrátový cyklus (tiež nazývaný aj Krebsov cyklus) hraje viacero úloh v metabolizme. Ide o finálnu metabolickú dráhu, kde končí oxidatívny metabolizmus sacharidov, aminokyselín a mastných kyselín tým, že ich uhľovodíkové skelety sú premieňané na CO 2 . Táto oxidácia poskytuje energiu na vznik väčšiny ATP u takmer všetkých živočíchov, vrátane človeka. Krebsov cyklus prebieha výlučne v mitochondriách a teda v blízkosti reakcií elektrónového transportu (dýchacieho reťazca, otázka II/5), ktorý oxiduje redukované koenzýmy vznikajúce v cykle. Krebsov cyklus je aeróbnou dráhou, preto je vyžadovaná prítomnosť O 2 ako finálneho elektrónového akceptoru. Väčšina katabolyckých metabolických dráh v tele končia v Krebsovom cykle. Reakcie ako napr. katabolyzmus niektorých aminokyselín vytvára medziprodukty Krebsovho cyklu a preto ich označujeme ako tzv. anaplerotické reakcie. Taktiež samotný Krebsov cyklus produkuje metabolity pre množstvo syntetických reakcií. Napr. ide o vytvorenie glukózy z uhľovodíkovej kostry niektorých aminokyselín alebo o syntézu niektorých aminokyselín a hemu. Preto by Krebsov cyklus nemal byť pokladaný za uzavretý cyklus, ale otvorený cyklus do ktorého podľa potreby vstupujú a aj z neho vystupujú látky. Tento fakt, že Krebsov cyklus môže poskytovať anabolicé aj katabolické reakcie, nazývame ako amfibolický charakter Krebsovho cyklu. Prvým krokom citrátového cyklu je naviazanie karboxylovej skupiny z acetyl koenzýmu A (CoA), oxalacetát je regenerovaný v poslednom kroku citrátového cyklu. Preto vstup jedného acetyl-CoA do jednej otáčky Krebsovho cyklu nevedie k produkcii alebo spotrebe metabolitov cyklu. Dva uhlíky, ktoré vstúpili do cyklus v podobe acetyl-CoA, sú vyvážené dvomi molekulami CO 2 vychádzajúcimi z cyklu. Pyruvát, ktorý je konečným produktom aeróbnej glykolýzy, musí byť transportovaný do mitochondrie pred tým ako vstupuje do citrátového cyklu. Tento dej je sprostredkovaný pomocou špecifického pyruvátového prenášača, ktorý napomáha pyruvátu prejsť cez vnútornú mitochondriálnu membránu. V mitochondriálnej matrix je pyruvát premenený na acetyl-CoA pomocou pyruvát dehydogenázového komplexu, ide o multienzýmový komplex. Je veľmi dôležité zdôrazniť, že pyruvát dehydrogenázový komplex nie je súčasťou citrátového cyklu, ale je hlavným zdrojom acetyl-CoA. Pyruvát dehydrogenázový komplex (PDH komplex) je multimolekulárny agregát troch enzýmov – pyruvát dehydrogenázy (PDH), dihydrolipoyl transacetylázy a dihydrolipoyl dehydrogenázy. Každý z týchto enzýmov katalyzuje časť reakcie. Ich fyzická väzba vedie čiastkové reakcie správnym smerom bez uvoľnenia metabolitov. Okrem týchto enzýmov obsahuje komplex aj dva regulačné enzýmy – pyruvát dehydrogenázovú kinázu a pyruvát dehydrogenázovú fosfatázu. PDH komplex obsahuje 5 koenzýmov, ktoré sa chovajú ako prenášače alebo oxidanty pre čiastkové reakcie. PDH obsahuje tiamín pyrofosfát (TPP), dihydrolipoyl transacetyláza obsahuje kyselinu lipoovú (L) a CoA a dihydrolipoyl dehydrogenáza obsahuje FAD a NAD + . Kovalentná modifikácia pomocou dvoch regulačných enzýmov spôsobujú alternatívne aktiváciu alebo inaktiváciu PDH. cAMP dependentná PDH kináza fosforyluje a teda inhibuje PDH, pričom PDH fosfatáza defosforyluje a teda aktivuje PDH. Kináza sama o sebe je alostericky aktivovaná pomocou ATP, acetyl CoA a NADH. Preto je PDH komplex v prítomnosti vysoko energetických signálov. Pyruvát funguje ako inhibítor PDH kinázy, preto ak je koncentrácia pyruvátu zvýšená je PDH maximálne aktívna. Vápenáte ióny je silným aktivátorom PDH fosfatázy, ktorá stimuluje aktivitu PDH. Tento fakt je zvlášť dôležitý v kostrovom svalstve, kde uvoľnenie Ca 2+ počas kontrakcie stimuluje PDH komplex a teda aj produkciu energie. Aj keď je kovalentná regulácia kinázou a fosfátazou kľúčová, komplex tiež podlieha produktovej inhibícii (NADH, acetyl-CoA). Prvá reakcia (1.) cyklu je kondenzácia acetyl-CoA a oxalacetátu za vzniku citrátu, ktorá je katalyzovaná citrát syntázou. Táto aldolová kondenzácia má rovnováhu značne posunutú na stranu syntézy citrátu. U ľudí nie je citrát syntáza allosterickým enzýmom a preto je inhibovaná jej produktom – citrátom. Koncentrácia substrátu je ďalším spôsobom regulácie tohto enzýmu. Naviazanie oxalacetátu spôsobuje konformačnú zmenu enzýmu, čím sa vytvorí väzobné miesto pre acetyl-CoA. Citrát okrem toho, že je metabolit citrátového cyklu, je zdrojom acetyl-CoA pre tvorbu mastných kyselín (otázka II/ 23). Citrát tiež inhibuje fosfofruktokinázu, enzým glykolýzy (otázka II/17) a aktivuje acetyl-CoA karboxylázu, enzým biosyntézy mastných kyselín. V ďalšom kroku (2.) je citrát izomerovaný na izocitrát pomocou akonitázy (akonitáthydratáza), ktorá sa radí medzi Fe-S proteíny. Akonitáza je inhibovaná pomocou fluóroacetátu, látky používanej ako jed na krysy. Fluóroacetát je premenený na fluóroacetyl-CoA, ktorý kondenzuje s oxalacetátom za vzniku fluórocitrátu – inhibítoru akonitázy, čím vzniká hromadenie citrátu. V nasledujúcom kroku (3.) izocitrát dehydrogenáza katalyzuje ireverzibílnu oxidatívnu dekarboxyláciu izocitrátu za vzniku α- ketoglutarátu. Táto reakcia produkuje prvú molekulu NADH z troch produkovaných v cykle a tiež dáva vzniku prvému CO 2 . Ide o prvý z kľúčových krokov Krebsovho cyklu. Tento enzým je alostericky aktivovaný pomocou ADP (nízkoenergetický signál) a Ca 2+ a je inhibovaný pomocou ATP a NADH, ktorých koncentrácia je zvýšená, ak má bunka nadbytočné zásoby energie. V tomto kroku (4.) je α-ketoglutarát premenený na sukcinyl-CoA pomocou α-ketoglutarát dehydrogenázového komplexu (multimolekulárny agregát troch enzýmov). Mechanizmus tejto oxidatívnej dekarboxylácie je veľmi podobný ako pri premene pyruvátu na acetyl-CoA pomocou PDH komplexu. Táto reakcia produkuje druhú molekulu CO 2 a druhý NADH cyklu. Potrebné koenzýmy pre túto reakciu sú tiamín pyrofosfát, kyselina lipoová, FAD, NAD + a CoA. Každý z nich funguje ako súčasť katalytického mechanizmu analogicky ako pri PDH komplex. Rovnováha tejto reakcie je značne posunutá v smere succinyl-CoA – vysokoenergetického tioesteru podobného acetyl-CoA. α-Ketoglutarát dehydrogenázový komplex je inhibovaný jeho produktami, NADH a succinyl-CoA, a je aktivovaný pomocou Ca 2+ . Avšak, ma rozdiel od PDH komplexu nie je regulovaný pomocou reverzibílnej fosforylácie. α-Ketoglutarát je tiež produkovaný oxidatívnou deamináciou alebo transamináciou glutamátu (anión kyseliny glutámovej). Ďalší krok (5.) citrátového cyklu predstavuje štiepenie vysokoenergetickej tioesterovej väzby succinyl-CoA za vzniku succinátu pomocou sukcinát thiokinázy. Táto reakcia je spojená s fosforyláciou guanozín difosfátu (GDP) na guanozín trifosfát (GTP). GTP a APT sa dajú navzájom premieňať pomocou nuklotid difosfát kinázovou reakcie: GTP + ADP ↔ GDP + ATP. Tvorba GTP pomocou sukcinát tiokinázy je ďalším príkladom fosforylácie na substrátovej úrovni. Sukcinyl-CoA je tiež produkovaný z propionyl-CoA odvodeného z metabolizmu mastných kyselín s nepárnym (lichým) počtom uhlíkov a tiež metabolizmu niektorých aminokyselín. Nasledujúcim krokom (6.) je oxidácia sukcinátu na fumarát pomocou sukcinát dehydrogenázy, za súčasnej redukcie FAD (koenzým) na FADH 2 . Sukcinát dehydrogenáza je jediným enzýmom citrátového cyklu, ktorý sa nachádza vo vnútornej membráne mitochondrií. Ako taký tiež funguje ako Komplex II v elektrónovom reťazci dýchacieho reťazca. V tejto reakcii sa ako elektrónový akceptor využíva FAD a nie NAD + , lebo redukujúce schopnosti sukcinátu nie sú dostačujúce na redukciu NAD + . V tomto kroku (7.) je fumarát hydratovaný na malát reverzibílnou reakciou katalyzovanou fumarázou (fumarát hydratáza). Fumarát je tiež produkovaný v ornitínovom cykle, pri syntéze purínov a počas katabolyzmu aminokyselín – fenylalanínu a tyrozínu. Posledným krokom (8.) je oxidácia malátu na oxalacetát pomocou malát dehydrogenázy. Táto reakcia produkuje tretí a posledný NADH cyklu. ΔG 0 reakcie je pozitívna, ale reakcia je posúvaná smerom k oxalacetátu pomocou vysoko exergonickej citrát syntázovej reakcie. Oxalacetát je tiež produkovaný transamináciou kyseliny asparágovej. Do cyklu vstupujú dva atómy uhlíku vo forme acetyl-CoA a taktiež z cyklu vystupujú dva atómy uhlíku vo forme CO 2 . Štyri páry elektrónov sú presúvané počas jednej otáčky cyklu: tri páry elektrónov redukujú tri NAD + na NADH a jeden pár redukuje FAD na FADH 2 . Oxidácia jedného z NADH pomocou elektrónového reťazca vedie ku vzniku asi troch molekúl ATP, pričom oxidáciou FADH 2 vzniknú asi dve molekuly ATP. Celkový zisk ATP počas jednej otáčky Krebsovho cyklu je asi 12 molekúl ATP. Krebsov cyklus je regulovaný pomocou viacerých enzýmov. Najdôležitejšími z nich sú tie, ktoré katalyzujú reakcie s veľmi zápornou ΔG 0 : citrát syntáza, izocitrát dehydrogenáza a α-ketoglutarát dehydrogenázový komplex. Redukčné ekvivalenty potrebné pre oxidatívnu fosforyláciu sú tvorené PDH komplexom a Krebsovým cyklom, pričom oba procesy sú regulované zmenou koncentrácie ADP. II/8. Obecné mechanismy přeměny aminokyselin, deaminace, transaminace, dusíková bilance. Pri odbúravaní bielkovín vzniká aminodusík, ktorý na rozdiel od uhlíku, nemôže byť využitý k oxidatívnym pochodom a tvorbe energie. Keďže aminoskupiny z väčšiny aminokyselín nemôžu byť využívané k ďalším biosyntézam, prenášajú sa transamináciou na 2-oxoglutarát. Z takto vzniknutého glutamátu sa v druhom kroku uvoľňuje deamináciou NH 4 + , ktorý sa nakoniec zabuduje do močoviny a spolu s ňou je vylúčený. Z reakcií, pri ktorých dochádza k prenosu –NH 2 , sú obzvlášť významné transaminácie. Sú katalyzované aminotransferázami („transaminázami“) a podieľajú sa na katabolických a anabolických dráhach metabolizmu aminokyselín. Pri transaminácií sa aminoskupina z aminokyseliny prenáša na 2-oxokyselinu. Z aminokyseliny pritom vzniká 2-oxokyselina a z pôvodnej 2-oxokyseliny vzniká aminokyselina. V priebehu reakcie preberá skupinu –NH 2 dočasne koenzým pyridoxalfosfát, ktorý sa tak mení na pyridoxaminfosfát. V neprítomnosti substrátu sa aldehydová skupina pyridoxalfosfátu kovalentne viaže na lyzínový zvyšok transaminázy. Tento typ zlúčenín sa označuje ako aldimin alebo „Schiffova báze“. V priebehu reakcia aminokyselina 1 vytlačí lyzínový zvyšok za vzniku nového aldiminu. Potom sa izomáciou presunie dvojitá väzba. Nakoniec dochádza k hydrolýze takto vzniknutého ketimínu, pričom vzniká 2-oxokyselina a pyridoxaminofosfát. V druhej časti reakcie prebiehajú rovnaké reakcia v obrátenom poradí. Pyridoxaminfosfát a druhá 2-xoxkyselina vytvoria ketimín, ktorý sa izomerizuje na aldimin. Nakoniec sa druhá aminokyselina odštiepi a tým sa koenzým regeneruje. Ak dochádza k uvoľneniu skupiny –NH 2 z aminokyseliny v podobe amoniaku, hovoríme o deamináciu. Deaminácia môže prebiehať rôznymi mechanizmami. Pri hydrolytickej deaminácií sa hydrolyticky odštiepuje amidová skupina z bočného reťazca glutamínu pôsobením glutaminázy (2). Vzniká glutamát a amónny ión NH 4 + . Analogickou reakciou rozkladá asparagináza asparagín na aspartát a NH 4 + . Veľmi významnou je oxidatívna deaminácia. V ľudskom metabolizme jej podlieha iba glutamát. α-aminoskupina aminokyseliny sa najprv oxiduje na iminoskupinu; redukčné ekvivalenty sa prenášajú na NAD a NADP. V druhom kroku sa iminoskupina hydrolyticky odštiepi. Rovnako ako pri transaminácií vzniká 2-oxokyselina. Oxidatívna deaminácia glutamátu prebieha predovšetkým v pečeni. Je katalyzovaná glutamátdehydrogenázou (3) a tvoria sa pri nej 2-oxoglutarát a NH 4 + . Eliminačná deaminácia spôsobuje premenu serínu a threonínu na pyruvát resp. 2-oxobutyrát a NH 4 + . Pri tejto reakcií katalyzovanej serindehydratázou alebo threonindehydratázou sa najprv eliminuje molekula H 2 O z bočného reťazca aminokyseliny. Tvorí sa nenasýtený medziprodukt, ktorý sa spontánne premení na ketimín. Ten v druhom kroku príjme H 2 O a ako v predchádzajúcom prípade hydrolyzuje na NH 3 a pyruvát (resp. 2-oxobutyrát). K eliminačnej deaminácie dochádza v prvom kroku tiež pri odbúravaní histidínu. V tomto prípade však reakcia prebieha iným mechanizmom než deaminácia serínu a threonínu. Existuje dynamická medzi tvorbou a odbúravaním tkanivových proteínov. U zdravých ľudí pri vyváženej strave je príjem dsíku a jeho výdaj v rovnováhe. Za patologických situácií vedúcich k poškodeniu organizmu, po chirurgických zákrokoch alebo pri dlhtrvajúcom strese dochádza k metabolickej odpovedi, pri ktorej je prevaha katabolizmu nad anabolzmom. Vzniká tak negatívna dusíková bilancia. Najjednoduchší približný výpočet získame porovnaním prívodu N obsiahnutého v proteínoch s obsahom N močoviny vylúčenej za 24 hod močom (dU-urea):  N-rovnováha (v g) = (prívod bielkovín/6,25) – (dU – urea v g) + 2,5  Proteínová rovnováha = príjem proteínov – straty proteínov (=(dU-urea v g + 4) x 6,25) Organizmus nedokáže skladovať proteínydo zásoby ako vprípade glykogénu pri sacharidoch alebo triacylglycerolov pri tukoch. Existuje iba tzv. pohotovostná rezerva aminokyselín, ktorá u človeka činí 70-80 g a pri hladovaní sa vyčerpá behom niekoľkých málo hodín. Odporúčaný príjem proteínov u 70 kg jedinca je 1g/kg hmotnosti, čo zodpovedá 11g N za 24h. II/9. Koenzymy oxidoredukčních, karboxylačních a dekarboxylačních reakcí. Všetky oxidoreduktázy sú závislé na spolupôsobení koenzýmov. Koenzýmy s redoxnou funkciou môžu pôsobiť buď ako voľné koenzýmy (L) alebo ako prostetické skupiny (P). Po naviazaní prenášajú rôzne typy „redoxných ekvivalentov“ (e - , e - + H + alebo H - ). Široko rozšírenými koenzýmy dehydrogenáz sú pyrimidínové nukleotidy NAD + a NADP + . Transportujú hydridové ióny (2e - a 1 H + ) a sú vždy voľné. NADH prenáša redukčné ekvivalenty z katabolických metabolických dráh do dýchacieho reťazca a podieľa sa tak na energetickom metabolizme. NADPH je naproti tomu najdôležitejšie redukčné činidlo pri biosyntézach. Vzniká predovšetkým v pentózovom cykle a je nutné napr. k biosyntéze mastných kyselín a cholesterolu alebo k biotransformáciách. Flavínové koenzýmy FMN a FAD obsahujú ako redoxne aktívne skupiny flavín (izoaloxazín), cyklický systém s tromi dusíkatými jadrami, ktorý pri redukcii môže prijať až 2 elektróny a 2 protóny. FMN a FAD nesú flavín na fosforylovanom cukronom alkohole ribitole (Rit). FAD obsahuje FMN naviazané na AMP. Z funkčného hľadiska sú obe koenzýmy porovnateľné. Nájdeme ich v dehydrogenázach, oxidázach a monooxygenázach. Na rozdiel od pyrimidínových nukleotidov vznikajú pri reakciách flavínov radikálové medziprodukty. Preto, aby nedošlo k poškodeniu bunkových súčastí, sú flavíny vždy viazané na bielkovinu enzýmu ako prostetickej skupiny. Funkcia ubichinonu (koenzýmu Q) ako prenášača redukčných ekvivalentov v dýchacom reťazci je opísaná v otázke II/5. Behom redukcie prechádza benzochinon Q v aromatický hydrochinol (ubichinol, QH 2 ). Izoprenoidný bočný reťazec ubichinonov môže mať rôznu dĺžku. Drží molekulu v membráne, v nej sa môže voľne pohybovať. Fotosyntéza zahŕňa podobné koenzýmy (plastochinony). Kyselina L-askorbová (vitamín C) je silné redukčné činidlo. Nešpecificky ako antioxidant chráni pres oxidatívnym poškodeniam. Súčasne je to ale aj nenahraditeľný kofaktor rozličných monooxygenáz a dioxygenáz. Kyselina askorbová sa podieľa na hydroxylácií prolínových a lyzínových zvyškov pri syntéze kolagénu, na syntéze katecholamínov a žlčových kyselín, rovnako ako na degradácií tyrozínu. Redukovaná forma koenzýmu je relatívne silnou kyselinou, ktorá tvorí soli, askorbáty. Oxidovaná forma sa označuje ako kyselina dehydroaskorbová. V kyseline lipoovej pôsobí ako oxidoredukčne aktívna skupina vnútromolekulový disulfidický mostík. Pri redukcií prechádza na odpovedajúci dithiol. Kyselina lipoova sa na enzým spravidla viaže ako prostetická skupina prostredníctvom zvyšku lyzínu (R) a označuje sa potom ako liponamid. Liponamid sa zúčastňuje oxidatívnej dekarboxylácie 2-oxokyselín. Podobný systém disulfid/dithiol má aj peptidický koenzým glutathion. Fe-S klastre sa vyskytujú ako prostetické skupiny v oxidoreduktázach, ale sú aj súčasťou lyáz (napr. v akonitáze v Krebsovom cykle a iných). Fe-S klastre sa skladajú z 2-4 atómov železa naviazaných na cysteínové zvyšky proteínu (-SR) a tiež s atómami anorganickej síry (S). Tieto štruktúry sú stabilné iba vo vnútri proteínov. V závislosti na počte atómov síry a železa rozlišujeme [Fe 2 S 2 ], [Fe 3 S 4 ] a [Fe 4 S 4 ] klastre. Fe-S klastre sú významné najmä v dýchacom reťazci, kde sa nachádzajú v takmer všetkých komplexoch okrem komplexu IV. Hemové koenzýmy s redoxnými účinkami sa nachádzajú v dýchacom reťazci, fotosyntéze či monooxygenázach a peroxidázach. Hemoproteíny s redoxnou funkciou sa označujú ako cytochromy. V cytochromoch sa mení oxidačné číslo železa (medzi +2 a +4) – na rozdiel od hemoglobínu a myoglobínu. Existuje niekoľko tried hemov (a, b a c), líšia sa substituentami na R 1 až R 3 . Hemoglobín, myoglobín a hemoenzýmy obsahujú hem b. Dve hemové skupiny typu a sa nachádzajú v cytochrome c, kde je na bielkovinu viazaný kovalentnými thioesterovými väzbami so zvyškami cysteinu. Nukleozidfosfáty sú nielen prekurzory pre biosyntézu nukleových kyselín, mnohé z nich majú aj funkciu koenzýmov. Slúžia k uchovaniu energie a pomocou energetického spřahovaní umožňujú priebeh endergonických dejov. Metabolity sa často stávajú reaktívnejšími („aktivovanými“) pripojením fosfátových zvyškov (fosforyláciou). Spojením s nukleoziddifosfátovými zvyškami (predovšetkým UDP a CDP) tak vznikajú napr. prekurzory pre syntézu polysacharidov a lipidov, Endergonické spojovanie ligázami je vždy závislé na nukleozidtrifosfátoch. Acylové zvyšky sa pravidelne aktivujú prenesením na konezým A. Tento koenzým obsahuje pantetein viazaný cez anhydrid kyseliny fosforečnej na 3 ́-fosfo-ADP. Pantetein sa skladá z troch častí spojených amidovými väzbami – pantoinátu, β-alaninu a cysteaminu. Posledný menovaný je biogénny amín, ktorý vzniká dekarboxyláciou aspartátu alebo cysteinu. Zlúčenina kyseliny pantoinovej a β-alanínu (pantotenát) má pre človeka povahu vitamínu. Reakciami thiolovej skupiny cysteamínových zvyškov s karboxylovými kyselinami vznikajú thioestery, napr. acetyl- CoA. Táto reakcia je výrazne endergonická a preto sa spřahuje s exergonickými dejmi. Thioestery predstavujú aktívnu formu karboxylových kyselín, pretože acylový zvyšok v acyl-CoA má vysoký chemický potenciál a ľahko sa prenesie na iné molekuly. často sa preto uplatňujú v metabolizme. Tiamindifosfát (TPP) má schopnosť sa v spolupráci s enzýmom aktivovať hydroxyalkylovú skupinu z aldehydu alebo ketónu a túto skupinu potom preniesť na inú molekulu. Tohto typu prenosu sa využíva napr. v transketolázovej reakcií. Hydrxyalkylové zvyšky sa zúčastňujú aj dekarboxylácie oxokyselín. Potom sa uvoľňujú buď ako aldehyd alebo ich dehydrogenázy 2-oxokyselín prenášajú na liponamidový zvyšok. Funkčnou časťou TPP je thiazolový kruh, obsahujúci síru a dusík. Pyridoxalfosfát je najdôležitejší koenzým metabolizmu aminokyselín. Jeho úloha v transaminácií je popísaná v otázke II/8. Pyridoxalfosfát sa pravidelne zúčastňuje aj ďalších reakcií aminokyselín, ako je dekarboxylácia alebo dehydratácia. Aldehydová forma väčšinou nebýva voľná. V neprítomnosti substrátu sa na aldehydovú skupinu kovalentne viaže ε- aminoskupina lyzínu a vzniká aldimín (Schiffova báza). Pyridoxaminfosfát je medziproduktom transaminačnej reakcie. Späť na aldehydovú formu sa vracia reakciou s 2-oxokyselinou. Biotín je koenzým všetkých karboxyláz. Podobne ako pyridoxalfosfát sa viaže karboxylovou skupinou na lyzínový zvyšok karboxylázy za vzniku amidovej väzby. Vznik tejto väzby katalyzuje špecifický enzým. Biotín reaguje s hydrogénkarbonátom (HCO 3 - ) na N-karboxybiotín; spotrebováva pritom ATP. Z tejto aktivovanej formy sa prenáša oxid uhličitý CO 2 na ďalšie molekuly, čom sa v nich vytvárajú karboxylové skupiny. Príkladom takejto reakcie závislej na biotíne môže byť tvorba oxalacetátu z pyruvátu alebo syntéza malonyl-CoA z acetyl-CoA. „Aktivovaný metyl“ v podobe S-adenozyl-methionínu (SAM) je potrebný pre množstvo metylčaných reakcií, napr. pre syntézu kreatínu, na premenu noradrenalínu na adrenalín či metyláciu DNA: SAM pochádza z degradácie proteogénnej aminokyseliny methionínu, na ktorú sa prenesie adenozylový zvyšok molekuly ATP. Po odovzdaní aktivovanej metylovej skupiny zostane S- adenozylhomocysteín (SAH), ktorý sa potom v dvoch krokoch môže premeniť späť na metionín. Najprv vzniká odštiepením adenozinového zvyšku neproteinogénna aminokyselina homocysteín. Na ten sa potom pomocou N 5 -metyl-THF znovu prenesie metylová skupina. Inou možnosťou je odbúravanie homocysteínu na propionyl-CoA. Tetrahydrofolát (THF) je koenzým, ktorý môže prenášať C 1 -zvyšky rôznych oxidačných čísel. Vzniká z kyseliny listovej dvojstupňovou hydrogenáciou heterocyklického pterínového kruhu. Prenášané C 1 jednotky sa viažu na N-5, N-10 alebo na obe uvedené dusíkové atómy. THF a jeho deriváty hrajú ústrednú úlohu v metabolizme jednouhlíkatých zvyškov: (a) N 5 -formyl-THF a (b) N 10 -formyl-THF. Formylový zvyšok je v oboch zlúčeninách naviazaný v oxidačnom stupni karboxylovej kyseliny. V syntéze purínových báz prináša N 10 -formyl-THF 2 uhlíkové atómy pre purínový cyklus. (c) N 5 , N 10 -metenyl-THF a (d) N 5 , N 10 -metylen-THF. Obe prenášajú C 1 uhlíky v podobe aldehydu. N 5 , N 10 -metylen-THF vzniká prevažne z THF a serínu, ktorý sa pri tom premieňa na glycín. Prenášajú hlavne metylové skupiny tymidinových nukelotidov a je preto nenahraditeľný pri syntéze DNA. Dihydrofolát, ktorý pri reakcii vzniká, sa regeneruje cez THF opäť na N 5 , N 10 -metylen-THF. Uvedený sled reakcií je miestom pôsobenia niektorých významných cytostatík. (e) N 5 -metyl-THD. Táto zlúčenina, ktorej metylová skupina je na mieste alkoholu, vzniá redukciou N 5 , N 10 -metylen-THF. Prenáša metylovú skupinu metylkobalamínu a je preto hlavne nevyhnutná pre spätnú syntézu metionínu z homocysteínu. Folátové koenzýmy sú dôležité pre syntézu DNA a tým aj pre proliferáciu buniek. Veľké množstvo kyseliny listovej sa preto nachádza predovšetkým v bunkách, ktoré sa rýchlo delia, napr. v krvotvorných bunkách kostnej drene. Metabolizmus THF preto ponúka možnosti, ako chemoterapeuticky zasiahnuť proti nádorom. Podobne sulfonamidové antibiotika zastavujú rast mikroorganizmov, v ktorých pôsobí na syntézu folátov. Chemicky najkomplikovanejšou skupinou koenzýmov tvoria kobalamíny. Súčasne ide o jedinú súčasť výživy, ktorá obsahuje významný stopový prvok kobalt. Vyššie organizmy nedokážu kobalamínové koenzýmy sami syntetizovať a sú preto závislé na príjme vitamínu B 12 (kobalamínu) ako ich prekurzoru. Nedostatok kobalamínu často nie je spôsobený nedostatočným prívodom vitamínu, ale chýbaním „vnútorného faktoru“ – glykoproteínu, ktorý sa tvorí v žalúdku a je nutný pre resorpciu vitamínu B 12 v tenkom čreve. Nedostatok vitamínu B 12 sa lieči väčšinou podávaním stabilnejšieho kyanokobalamínu. Kľúčovou zložkou kobalamínu je korínový kruh, ktorý patrí medzi tetrapyroly. Do jeho stredu sa koordinačnou väzbou viaže kobaltový ión. Na koniec jedného z postranných reťazcov sa viaže nukleotid s neobyčajnou bázou, dimetylbenzimidazolom. Ligandy kovového iónu sú 4 dusíky pyrolových kruhov, dusík dimetylbenzimidazolu a metalorganicky, tj. prevažne kovalentne viazaná skupina X. V ľudských kobalamínoch ju tvorí metylová skupina v metylkobalamínu. Metylkobalamín slúži ako koenzým metyltransferáz. V ľudskom metabolizmu slúži výhradne k regenerácií homocysteínu na metionín („remetyláciou“) v cytoplazme. Adenozylový zvyšok slúži ako skupina X v adenozylkobalamínu (koenzýmu B 12 ). V mitochondriách pôsobí táto zlúčenina ako koenzým rôznych izomeráz, ktoré katalyzujú preskupenie molekúl radikálovým mechanizmom. Homolytickým štiepením väzby medzi kovom a adenozylovou skupinou vzniká radikál. V živočíšnom metabolizme je jedinou reakciou tohto typu izomerácia metylmalonyl-CoA na sukcinyl-CoA, ktorou končí odbúravanie mastných kyselín s nepárnym (lichým) počtom uhlíkov a rozvetvených aminokyselín valínu a izoleucínu. Ú§II/10. Tvorba amoniaku, jeho detoxikace, ureosyntetický cyklus a jeho regulace, hyperamonémie. Amoniak sa tvorí vo všetkých tkanivách pri metabolizme viacerých látok a vylučuje sa predovšetkým premenou na močovinu (ureu) v pečeni. Avšak, hladina amoniaku v krvi muší byť udržiavaná na veľmi nízkych hodnotách, lebo už len malé zvýšenie jeho koncentrácií (hyperamonémia) môže byť toxické pre CNS. Preto existujú metabolické mechanizmy, ktorými je amoniak transportovaný z periférnych tkanív do pečene, pričom sa udržiavajú nízke hladiny amoniaku v krvi. Aminokyseliny sú kvantitatívne najvýznamnejším zdrojom amoniaku, pretože západný štýl stravovania obsahuje veľké množstvo proteínov a teda ajaminokyselín, ktoré sa transportujú do pečene a podliehajú transaminácií za vzniku amoniaku. Avšak, veľké množstvo amoniaku môže vznikať aj z iných zdrojov. Ľadviny produkujú amoniak z glutamínu pomocou ľadvinnej glutaminázy a glutaminát dehydrogenázy. Väčšina amoniaku je vylučovaná močom vo forme NH 4 + , čo predstavuje dôležitý mechanizmus na udržiavanie telesnej acidobázickej rovnováhy pomocou exkrécie protónov. Amoniak sa tiež získava hydrolýzou glutamínu pomocou črevnej glutaminázy. Bunky črevnej sliznice získavajú glutamín buď z krvi alebo trávením proteínov v potrave. Črevný glutamínový metabolizmus produkuje citrulín, ktorý je transportovaný do ľadvín a je použitý na syntézu arginínu. Amoniak tiež môže vznikať z močoviny pomocou bakteriálnej ureázy v lumen čreva. Tento amoniak sa absorbuje z čreva cestou portálnej vény a takmer celé množstvo amoniaku je odstraňovaný pečeňou premenou na ureu. Amíny prijaté potravou a monoamíny, ktoré fungujú ako hormóny alebo neurotransmitery, dávajú vznik amoniaku účinkom aminoxidázy. V katabolyzme purínov a pyrimidínov vzniká amoniak uvoľnením aminoskupiny naviazanej na kruhy. Aj keď sa amoniak konštantne produkuje v tkanivách, nachádza sa v krvi iba v malých množstvách, Tento fakt je spôsobený jednak rýchlym odstraňovaním amoniaku pečeňou a druhak aj tým, že mnoho tkanív, hlavne svalstvo, uvoľňuje dusík z aminokyselín skôr vo forme glutamínu alebo alanínu, než vo forme voľného amoniaku. Vznik močoviny v pečeni je kvantitatívne najdôležitejšia cesta vylučovania amoniaku. Močovina sa transportuje krvou z pečene do ľadvín, kde sa vylučuje glomerulárnou filtráciou. Amidový dusík z kyseliny glutámovej predstavuje netoxickú rezervnú a transportnú formu amoniaku. ATP-dependentný vznik glutamínu z glutamátu a amoniaku glutamín syntetázou prebieha hlavne v svaloch a pečeni, ale tiež je veľmi dôležitý v CNS, kde je hlavným mechanizmom odstraňovania amoniaku z mozgu. Glutamín sa nachádza v plazme vo vyššej koncentrácií ako iné aminokyseliny, čo súvisí s jeho transportnou funkciou. Glutamín je z obehu odstraňovaný pečeňou, ľadvinami a deamináciou glutaminázou. V pečeni je vzniknutý NH 3 detoxikovaný premenou na ureu a v ľadvinách sa môže vylučovať močom. U človeka existujú 2 mechanizmy prenosu amoniaku z periférnych tkanív do pečene pre následnú premenu na močovinu. Prvým, ktorý sa uplatňuje vo väčšine tkanív, využíva glutamín syntázu na spojenie amoniaku s glutamátom za vzniku glutamínu – netoxickej transprtonej formy amoniaku. Glutamín je transportovaný krvou do pečene, kde je následne rozštiepený na glutamát a voľný amoniak. Druhý mechanizmus, významný hlavne vo svaloch, využíva transamináciu pyruvátu (konečného produktu aerobnej glykolýzy) na alanín. Alanín sa následne transportuje krvou do pečene, kde sa premieňa znova transamináciou na pyruvát. V pečeni môže byť pyruvát využitý na glukoneogenézu (syntéza glukózy) alebo môže vstúpiť do krvného obehu a vrátiť sa späť do svalu a byť využitý v tzv. glukózo-alanínovom cykle. Močovina je hlavnou odpadnou formou aminoskupín odvodených od aminokyselín a predstavuje asi 90% dusíkatých látok v moči. Jeden dusíkový atóm v močovine pochádza z voľného amoniaku a druhý z aspartátu. Glutamát je priamym prekurzorom jak amónneho (z oxidatívnej deaminácie glutamát dehydrogenázou), tak aspartátového dusíka (z transaminácie oxalacetátu pomocou AST). Uhlíkový a kyslíkový atóm v močovine pochádzajú z CO 2 . Močovina sa produkuje v pečeni v tzv. močovinovo m cykle (tiež ornitínový cyklus alebo malý Krebsov cyklus) a následne je transportovaný krvou do ľadvín, kde sa vylučuje do moči. Prvé 2 reakcie ornitínového cyklu prebiehajú v mitochondriách a zvyšok reakcií prebieha v cytoplazme. Formácia karbamoylfosfátu pomocou karbamoylfosfát syntázy I je riadený štiepením dvoch molekúl ATP. Amoniak zakomponovaný do karbymoylfosfátu je poskytnutý hlavne oxidatívnou deamináciou glutamátu mitochondriálnou glutamát dehydrogenázou. Nakoniec sa dusíkový atóm z tohto amoniaku sa stáva jedným z dusíkov močoviny. Karamoylfosfát syntáza I využíva N- acetylglutamát ako pozitívny allosterický aktivátor. Karbamoylfosfát syntáza II za zúčmäastňuje v biosyntéze pyrimidínov, avšak nevyužíva N-acetylglutamát a nachádza sa v cytoplazme (otázka II/37). Karbamoylová časť karbamoylfosfátu sa prenáša na ornitín pomocou ornitín transkarbamoylázy (OTC), pričom sa uvoľňuje vysokoenergetický fosfát (P i ), Vzniká tak citrulín, ktorý sa následne prenáša do cytoplazmy. Ornitín a citrulín sú bázické aminokyseliny, ktoré sa zúčastňujú na ornitínovom cykle a prenášajú sa cez mitochondriálnu membránu kotransportom. Nepatria medzi proteinogénne aminokyseliny, lebo nie sú kódované žiadnym kodónom. Ornitín sa regeneruje v každej otáčke ornitínového cyklu, podobne ako je oxalacetát regenerovaný v Krebsovom cykle. Argininosukcinát syntetáza spája citrulín s aspartátom za vzniku argininosukcinátu. α-aminoskupina aspartátu predstavuje druhý dusík, ktorý je nakoniec zapojený do močoviny. Formácia argininosukcinátu je poháňaná hydrolýzou ATP na AMP a pyrofosfát. Toto je 3. a posledná molekula ATP spotrebovaná pri syntéze močoviny. Argininosukcinát je štiepený argininosukcinát lyázou za vzniku arginínu a fumarátu. Arginín vzniknutý touto reakciou slúži ako priamy prekurzor močoviny. Fumarát vzniknutý v ornitínovom cykle je hydratovaný na malát, ktorý môže vstupovať do viacerých metabolických dráh. Malát napr. môže byť transportovaný do mitochondrie pomocou malátového člunku, znovu vstupuje do Krebsovho cyklu, premieňa sa na oxalacetát, ktorý môže vstupovať do glukoneogenézy. Alternatívne oxalacetát môže byť premenený na aspartát transamináciou a môže vstúpiť do ornitínového cyklu. Argináza štiepi arginín na ornitín a na močovinu. Tento enzým sa nachádza výhradne iba v pečeni a preto je možné syntetizovať močovinu iba v pečeni. Močovina je následne transportovaná krvou do ľadvín, kde sa vylučuje do moču. Časť močoviny difunduje z krvi do čreva, kde sa rozkladá na CO 2 a NH 3 pomocou bakteriálnej ureázy. Tento amoniak je čiastočne vylučovaný stolicou a čiastočne sa reabsorbuje do krvi. U pacientov so zlyhanými ľadvinami je zvýšená hladina močoviny v krvi, čo podporuje zvýšený transport z krvi do čreva. Črevný účinok urinázy na túto ureu sa stáva klinicky významným zdrojom amoniaku, ktorý prispieva k hyperamonémií často pozorovanej u týchto pacientov. Podanie neomycínu ústami redukuje počet črevných baktérií zodpovedných za produkciu amoniaku. Štyri vysokoenergetické fosfátové väzby sú spotrebované pri syntéze každej molekuly močoviny, preto je syntéza močoviny ireverzibilná s vysokým záporným ΔG. N-acetylglutamát je esenciálny aktivátor karbamoylfosfát syntázy I - kľúčový krok ornitínového cyklu. N-acetylglutamát je syntetizovaný z acetyl-CoA a glutamátu pomocou N-acetylglutamát syntázy, v reakcií, ktorej aktivátorom je arginín. Preto intrahepatálna koncentrácia N-acetylglutamátu sa zvyšuje po požití jedál bohatých na bielkoviny, čo poskytuje substrát (glutamát) a aj regulátor syntézy N- acetylglutamátu. Toto vedie k zrýchleniu syntézy urei. Patobiochémia Kapacita ornitínového cyklu presahuje normálne hladiny podukcie amoniaku v tkanivách a tak sa udržuje nízka koncentrácia amoniaku v krvi (5-35 μmol/l). Avšak, keď sú pečeňové funkcie oslabené,napr. kvôli genetickému defektu ornitínovému cyklu alebo ochorením pečene, koncentrácia amoniaku v krvi môže vzrasť až na 1 000 μmol/l – vzniká tak hyperamonémia. Hyperamonémia je život ohrozujúca situácia, lebo amoniak má priamu neurotoxický efekt na CNS. Napr. zvýšenie hladiny amoniaku v krvi spôsobuje príznaky otravy amoniakom, medzi ktoré patria záchvevy, poškodenie reči, ospalosť, zvracanie, mozgový edém a rozostrené videnie. Vysoké koncentrácie amoniaku môžu spôsobiť kómu a smrť. Ochorenie pečene je častá príčina získanej hyperamónie u dospelých a môže byť spôsobená vírusovou hepatitidou alebo hepatotoxínmi ako napr. alkohol. Cirhóza pečene môže spôsobiť vznik kolaterálneho obehu okolo pečene. Výsledkom je vlievanie sa portálnej krvi priamo do systematickej cirkulácie a nemá prístup k pečeni. Tým pádom je premena amoniaku na močovinu veľmi silne potlačená, čím sa zvyšuje hladina amoniaku v krvi. Vrodená hyperamonémia je genetický defekt jedného z 5 enzýmov ornitínového cyklu. Bola popísaná s výskytom 1:25 000 narodených. Porucha ornitín transkarbomylázy, ktorá je X-viazaná, je načastejším typom tohto ochorenia, ktorá prednostne postihuje mužov, ale môže sa prejavovať aj u žien prenášačok. Všetky ďalšie poruchy ornitínového cyklu vykazujú autozomálne recesívnu dedičnosť. V každom prípade zlyhanie syntézy urei vedie k hyperamonémií počas prvých týždňov života. Hyperamonémia z dôvodu poruchy arginázy je menej fatálna, lebo arginín obsahuje 2 odpadné dusíky, ktoré môžu byť vylúčené v moči. Historicky mali poruchy ornitínového cyklu majú vysokú morbiditu a mortalitu. Liečba zahŕňa restrikciu bielkovín v potrave, aby sa predišlo ich katabolizmu. Podávanie zlúčenín, na ktoré sa kovalentne viažu aminokyseliny, čím dusíkaté látky sú vylučované močom, napomáha prežitiu. Napr. fenylbutyrát podaný orálne sa premieňa na fenylacetát, ktorý sa kondenzuje s glutamínom za vzniku fenylacetylglutamínu, ktorý je vylučovaný v močí. II/11. Metabolismus aminokyselin skupiny pyruvátu a oxalacetátu, zapojení těchto aminokyselin do metabolických procesů. Medzi aminokyseliny skupiny pyruvátu patrí glycín, alanín, serín, threonín, tryptofan a cysteín. Medzi aminokyseliny skupiny oxalacetátu patrí asparagín a kyselina asparágová. Glycín je neesenciálna aminokyseliny, ktorá ako jediná nemá asymetrický uhlík. Je premieňaný enzýmom serinhydroxymetyltranserázou na serín, kde kofaktor tetrahydrofolát predáva C1 uhlíkatý zvyšok (CH 2 -OH). Následne zo serínu vzniká pyruvát. Táto reakcia vyžaduje N 5 ,N 10 -metylentetrahydrofolát. Reakcia môže prebiehať obomi smermi. Glycín sa môže tiež degradovať tzv. systémom štiepiacim glycín na CO 2 a NH 4 + za prítomnosti NAD + tetrahydrofolátu. Vzniká tu N 5 ,N 10 -metylentetrahydrofolát. Pri defekte tohto komplexu vzniká neketonická hyperglycinémia, ktorá sa prejavuje ťažkou mentálnou poruchou. Glycín sa tiež premieňa na glyoxylát, ktorý sa oxiduje na oxalát a ten pri vyšších koncentráciách vytvorí nerozpustný komplex s vápenatým katiónom – oxalát vápenatý, z ktorého následne môžu vznikať močové konkrementy. Syntéza glycínu de novo je možná zo serínu, respektíve z 3-fosfoglycerátu. Glycín je inhibčným neurotransmiterom a je významným prekurzorom pre syntézu mnohých ďalších látok ako napr:  porfyríny: sukcinyl-CoA reaguje s glycínom za vzniku kyseliny Δ-aminolevulovej  puríny – uhlík y dusík na pozícii 4,5 a 7 purínového jadra pochádzajú z molekuly glycínu  glutathion – tripeptid γ-glutamylcysteinylglycín (GSH), ktorý pôsobí ako redukujúca látka, podieľa sa na udržiavani oxidoredukčného prostredia, predovšetkým v erytrocytoch a je nutný pre stabilizáciu erytrocytárnej membrány. Pri detoxikácií sa uplatňuje pri konjugačných reakciách, kedy zvyšuje rozpustnosť produktu vo vode. Podieľa sa na transporte aminokyslín cez bunkovú membránu. Je kofaktorom množstva reakcií a je súčasťou niektorých leukotrienov. Ako redukujúca látka udržuje stabilitu hlavne erytrocytárnej membrány a sulhydrylová skupina je schopná redukovať peroxidy vznikajúce pri transporte kyslíku. Oxidovaná forma predstavuje dve molekuly GSH (GSSG) spojené disulfidickou väzbou, ich regenerácia je možná za účasti NADPH. Bežný pomer v erytrocytoch medzi GSH a GSSG je 100:1. Syntéza glutathionu prebieha dvomi reakciami, z ktorých každá vyžaduje jednu molekulu ATP a syntéza je regulovaná množstvom, respektíve dostupnosti cysteínu.  keratín – prvá reakcia tvorby kreatínu vyžaduje molekulu glycínu a arginínu Ďalej je glycín využívany pre konjugačné reakcie, s kyselinou cholovou vytvára kyselinu glykocholovu a s kyselinou benzoovou reaguje za vzniku kyseliny hippurovej. Serín sa môže metabolizovať spätnou reakciou katalyzovanou enzýmom serinhydroxymetyltransferázou na glycín, transamináciu sa premieňa na 3-hydroxypyruvát a následne na 3- fosfoglycerát. Serín je syntetizovaný z 3-fosfoglycerátu. Táto syntéza prebieha cez 3-fosfopyruvát pôsobením enzýmu fosfoglycerátdehydrogenázy s kofaktorom NAD + , Ďalej aminotransferázovou reakciou vzniká 3-fosfoserín a posledným krokom je pôsobenie fosfatázy s odštiepením anorganického fosfátu. Je nutné zdôrazniť, že aj keď rektanty aj produkty pri syntéze a degradácií sú zhodné, jednotlivé reakcie medzi krokmi, či intermediálne metabolity sú rôzne. Serín sa môže metabolizovať neoxidatívnou deamináciou, kedy pôsobením seríndehydratázy s kofaktorom pyridoxalfosfátom vzniká opäť pyruvát a uvoľní sa amoniak. Serín je prekurzorom aminokyseliny selenocysteínu. Selenocystín vzniká kotranslačne. Má špecifickú tRNA ser . Najprv reaguje seryl-tRNA ser a selenid za vzniku selenocysteinyl tRNA. Selenocysteín je významnou zložkou enzýmu glutathionreduktázy. Dekarboxylácia serínu je významná v tom, že pri nej vznika etanolamin; ten po trojnásobnej metylácií vytvorí cholín, prekurzor acetylcholínu, neurotransmiteru prenosu na nervovosvalovej platniče a v sympatických gangliách. Serín sa uplatňuje aj pri biosyntéze fosfolipidov a sfingozínu, vytvára 2. a 8. uhlík purínov a metylovú skupinu tymínu. Alanín vzniká v organizme pri transaminačných reakciách (glutamát-alanín) a ďalej pri degradácií tryptofánu. Transamináza alaninaminotransferáza (ALT) sa vyskytuje v cytozole buniek a jej aktivitu stanovujeme v sére pri poškodení pečene. Alanín je hlavnou frakciou aminodusíku krvnej plazmy, ale tiež významnou súčasťou bakteriálnej steny. Tryptofán je esenciálnou aminokyselinou, ktorá je metabolizovaná kynurenin-anthranilátovou cestou: najprv je rozštiepený 5-členný heterocyklus (pyrol), potom je bočný reťazec skrátený a následne je benzénové jadro rozštiepené a molekula je learizovaná. Prvým krokom je rozštiepenie pyrrolového jadra enzýmom tryptofanpyrrolázoub za vzniku N-formylkynurenínu. Tento enzým sa vyskytuje v pečeni a je indukovaný glukokortikoidmi a glukagónom. V ďalšej reakcií vzniká kyselina mravčia a kynurenin. Kynurenin sa môže ďalej metabolizovať tromi cestami, z ktorých dominantná je reakcia katalyzovaná kynureninhydroxylázou za vzniku 3- hydroxykynureninu. Táto cesta ďalej pokračuje cez 3- hydroxyanthranilát za odštiepenia alanínu enzýmom kyanureninázou. Kynurenín môže byť tiež transaminovaný na kynurenát a 3-hydroxykynurenin sa môže transminovať na xanthurenát. Oxidáza rozštiepi benzénové jadro v molekule 3- hydroxyanthranilátu za vzniku 2-amino-3- karboxymukonátsemialdehydu. Semialdehyd sa ďalšími reakciami premieňa na aminomukonát, α-ketoadipát a glutary- CoA a následne sa molekula skracuje až na konečný produkt, ktorým je acetacetát. Semialdehy kyseliny 2-aminomukonovej sa môže neenzymaticky cyklizovať na kyselinu pikolinovú. Tryptofán je prekurzorom približne 50% pyrimidínových nukleotidov v organizme, ktoré tvorí z 2-amino-3-karboxymukonátsemialdehydu, ktorý sa spontánne nenzymaticky cyklizuje na cholinát. Cholinát je pôsobením chinolinátfosfotibozyltransferázy naviazaný na ribonukleotid a zároveň prebieha dekarboxylácia, ktorou konečným produktom je nikotinamid. Kynutreninhydroxyláza je inhibovaná estrogénmi u žien a preto sú náchylnejšie k pelagre, deficitu niacínu. Z kynureninu vzniká množstvo neurotransmiterov – kyselina kynurenová a jej amín – kynuramín a chinolinát. Chinolinát je antagonistom a kynurenát antagonistom niektorých glutámových (excitačných receptorov). Z tryptofanu vzniká ďalší významný neurotransmiter, serotonín (5-hydroxytryptamín). Prvou reakciou je hydroxylácia tryptofánu tryptofan-5-monooxygenázou za účasti tetrahydrobiopterínu s následnou dekrboxyláciou. Serotonín v mozgu pôsobí prostredníctvom serotonínových receptorov (5-HT receptory), okrem toho ovplyvňuje kontrakciu hladkých svalov v artériách a bronchioloch. Dekarboxyláciu tryptofanu vzniká tryptamin ako regulačná molekula, o ktorej funkcií zatiaľ vieme iba málo. Melatonín, látka indukujúca spánok, je N-acetyl-5-methoxytryptamin tvorený v epifýze a v retine. Najprv nastáva N-acetylácia, ktorá je nasledovaná O-metyláciou. Melatonin má cirkadiánny rytmus, je syntetizovaný predovšetkým v noci. V dutine brušnej môže vzniknúť malý nádor, karcinoid, ktorý produkuje serotonín. V moči nachádzame koncentrácie metabolitu serotonínu – kyselinu 5-hydroxyindoloctovú. Tryptofán je nedostatočne vstrebávaný vo čreve a rozkladaný črevnými baktériami na indol, indolakrylovú a indolpyrohroznovú alebo indoloctovú kyselinu, ktoré sa následne vylučujú močom z organizmu. Táto choroba sa označuje ako Hartnupová choroba. Ide o poruchu transportu neutrálnych aminokyselín (hlavne tryptofánu) v kartáčovom leme tenkého čreva a renálnych tubuloch. Metabolizmus cysteínu je popísaný v otázke II/14 a metabolizmus threonínu je popísaný v otázke II/12. Lyzín je výlučne ketogénnou aminokyselinou. Táto aminokyselina je nezvyčajná tým, že žiadna z jej aminoskupín nepodlieha transaminácií v prvom kroku katabolizmu. Lyzín je konečne premenený na acetoacetyl-CoA. Lyzín je prekurzorom karnitínu (otázka II/16). Asparagín je hydrolyzovaný asparaginázou za vzniku amoniaku a aspartátu (kyseliny asparágovej). Aspartát stráca svoju aminoskupinu transamináciou za vzniku oxalacetátu. Niektoré rýchlo sa deliace leukocyty nie sú schopné syntézy dostatočného množstvo asparagínu pre svoj rast. Tým sa stáva asparagínesenciálnou aminokyselinou pre tieto bunky a teda vyžadujú dostatočný príjem z krvi. Asparagináza, ktorá hydrolyzuje asparagín na aspartát, môže byť dodávaná do tela pre liečbu leukémie. Asparagináza znižuje hladinu asparagínu v plazme, čím odoberá živiny pre rakovinové bunky. Asparagín obsahuje amoniak naviazaný amidovou väzbou na β-karboxyle a syntetizuje sa z aspartátu asparagín syntázou. Reakcia využíva glutamát ako zdroj amidu a vyžaduje ATP a rovnováha je posunutá smerom k vzniku asparagínu. Aspartát vzniká z oxalacetátu transamináciou. II/12. Metabolismus uhlíkového skeletu aminokyselin skupiny 2-oxoglutarátu, sukcinyl-CoA, s rozvětveným řetězcem, zapojení aminokyselin do metabolických procesů. Medzi aminokyseliny skupiny 2-oxoglutarátu (α-ketoglutarátu) patrí arginín, histidín, prolín, glutamín a kyselina glutámová. Medzi aminokyseliny skupiny sukcinyl-CoA patrí methionín, valín, izoleucín a threonín. Rozvetvené aminokyseliny sú valín, leucín a izoleucín. Arginín je syntetizovaný v ornitínovom cykle, avšak pre tvorbu proteínov vzniká v ľadvinách, kde je nízka aktivita arginázy, premieňajúcej arginín na ornitín. Arginín sa podieľa na syntéze kreatínu (otázka II/16), oxidu dusnatého (otázka IV/10) a agmatinu, látky s antihypertenznými vlastnosťami. Argininfosfát sa vyskytuje v intervertebrálnych svaloch a má podobnú funkciu ako kreatinfosfát. Arginín sa štiepi arginázou na ornitín, ktorý sa následne premieňa na glutamát a nakoniec na 2-oxoglutarát. Histidín sa metabolizuje neoxidatívnou deamináciou pomocou histidázy na urokonát, ktorý je ďalej premieňaný cez N-formininoglutamát až na glutamát (ktorý sa ďalej metabolizuje na 2-oxoglutarát) a formiminotetrahydrofolát. Urokaná je tiež vylučovaný do potu a chráni pokožku pred pôsobením UV-žiarenia. Vysoké koncentrácie urokanátu boli nájdene u černochov. Histidín je substrát pre tvorbu karnosinu (spolu s β- alaninom) a anserinov – dipeptidov nájdených v svalstve, ktoré aktivujú myozínovú ATP-ázu. Ich funkcia zatiaľ nie je úplne známa. Dekarboxyláciou histidínu histidíndekarboxylázou vzniká histamín (otázka II/15). Histamín pôsobí prostredníctvom H 1 a H 2 receptorov. Vo vysokých koncentráciách sa vyskytuje v žírných bunkách, v azurofilných granulách a uvoľňuje sa do okolia pri alergickej reakcií. Tento účinok je sprostredkovaný cez hisamínové receptory typu I, ktoré vyvolávajú ontrakciu hladkého svalstva v bronchoch a vazodilatáciu menších ciev. H 2 receptory v žalúdočnej sliznici stimulujú tvorbu HCl. Prolín a ornitín vznikajú v organizme z 2-oxoglutarátu reakciou za prítomnosti ATP a NADH za vzbiku glutamát-5- semialdehydu. Semialdehyd spontánne cyklizuje na Δ-1-pyrrolin-5- karboxylátu a následným pôsobením reduktázy vzniká prolín. Pokiaľ prebehne transaminácia glutamátového semialdehydu, vzniká ornitín. Prolín je degradovaný spätnou reakciou cez glutamát-5-semialdehyd na 2-oxoglutarát, čim je udržiavaná rovnováha týchto aminokyselín. Prolín je predovšetkým obsiahnutý v proteínoch pojivového tkaniva. Býva posttranslačne modifikovaný hydroxyláciou na 3- alebo 4- hydroxyprolín. Prolinhydroxyláza aktivuje molekulárny kyslík – jeden z jeho atómov je zavedený do prolínového zvyšku a druhý interaguje s 2-oxoglutarátom, ktorý sa oxidačne dekarboxyluje. Hydroxylácia prolínu v proteínoch zvyšuje ich rigiditu hlavne v kolagénových vláknach, tj. čím viac hydroxyprolínu daný proteín obsahuje, tým menej je elasticky a pružný. Glutamín sa premieňa na glutamát a amoniak pôsobením enzýmu glutaminázy. Glutamát sa následne premieňa na 2-oxoglutarát trnasamináciou alebo oxidatívnou deamináciou pomocou glutamát dehydrogenázy. Kyselina glutámová (glutamát) má kľúčové postavenie v metabolizme aminokyselín. Podieľa sa na transaminačnej, glutamátdehydrogenázovej, glutaminsyntázovej, glutaminázovej a iných reakciách. Základné reakcie slúžiace syntéze aj degradácií je transaminácia, kedy produktom aj zdrojom je 2-oxoglutarát. Glutamát je zdrojom pre syntézu glutathionu a kyseliny γ- aminomaslovej (GABA), významného inhibičného mediátora v CNS. GABA receptory sú niekoľkých typov (GABA A , GABA B ), skladajú sa zo 4 podjednotiek a pôsobia ako chloridový kanál. Metabolizmus methionínu je popísaný v otázke II/14. Threonín je esenciálnou aminokyselinou, ktorá sa najčastejšie rozkladá pomocou threoninaldolázy na glycín a acetaldehyd, ktorý sa ďalej premieňa na acetát a ďalej na acetyl- CoA. Alternatívne sa threonín premieňa na α-ketobutyrát, z ktorého ďalej vzniká succinyl-CoA. Metabolizmus valínu, leucínu a izoleucínu je menej obvyklý. Prvé dve reakcie sú zhodné pre všetky tri aminokyseliny: najprv vzniká transamináciou zodpovedajúca α-ketokyselina, tá podlieha oxidatívnej dekarboxylácií mitochondriálnym komplexom za vzniku thioesteru acyl-CoA. Posledná spoločné reakcia je opäť dehydrogenácia s tvorbou nenasýteného thioacyl-CoA. Pri týchto reakciách vznikách NADH, čo je významný zdroj energie. Aminotransferázy sa vyskytuu v roch formách izoenzýmov a sú lokalizované v cytozole a mitochondriách. Dve z troch aminotransferáz sú schopné transaminovať všetky tri rozvetvené aminokyseliny a jedna je špecifická iba pre leucín. Majú vyššiu koncentráciu v svalstve než v pečeni a pri hladovaní sa zvyšuje aktivita týchto transamináz iba v svalovine a nie v pečeni. Prvý krok je transamináciaa vznik α-keto-rozvetvenej-kyseliny. Nasleduje oxidatívna dekarboxylácia na vnútornej mitochondriálnej membráne komplexom podobným pyruvátdehydrogenázovému komplexu za prítomnosti CoA s tvorbou NADH a CO 2 . Tento enzýmový komplrx je zhodný pre všetky 3 aminokyseliny. Z uhlíkového skeletu potom vzniká thioester nasýteného acyl-CoA, ktorý je dehydrgenovaný; vzniká thioester nenasýteného acyl-CoA- Ďalej nasledujú reakcie, ktoré v prípade valínu a izoleucínu si sú podobné – vzniká propionyl-CoA a acetyl-CoA. Propionyl- CoA je premieňaný ďalej na sukcinyl-CoA. Leucín je premieňaný kaskádou reakcií až na acetacetát a acetyl-CoA. Jedným z medziproduktov je β-hydroxy-β-metyl-glutaryl-CoA (HMG-CoA), ktorý tiež vzniká pri syntéze sterolov v cytozole. HMG-CoA pri degradácií leucínu sa tvorí však v mitochondriách. Patobiochémia Histidinémia sa prejavuje mentálnou retardáciou, poruchami reči, avšak závažnosť poruchy enzýmu nemusí korelovať so závažnosťou klinického stavu. Porucha metabolizmu prolínu, hyperprolinémia dvoch typov, je spojená s malformáciou ľadvín, vývodových ciest močových, poruchami sluchu až hluchotou (Alportov syndróm) s mentálnou retardáciou. Choroba javorového sirupu (maple sirup urine disease, leucinóza) je vrodené metabolické ochorenie spôsobené defektom komplexu oxidatívnej dekarboxlácie. Vyskytuje sa u 5-10 narodených z milióna živo narodených detí. Prejavuje sa zvracaním, poruchou výživy už v prvom týždni života, letargiou, psychickou aj fyzickou retardáciou. Typickou známkou je žltohnedá farba moču a jeho typický zápach, pripomínajúci javorový sirup alebo pálený cukor. II/13. Katabolismus aromatických aminokyselin, poruchy. Medzi aromatické aminokyseliny patrí fenylalanín a tyrozín. Koncovým produktom metabolizmu týchto aminokyselín, ktorý sa ďalej metabolizuje v citrátovom cykle je fumarát. Fenylalanín je esenciálna aminokyselina. Približne 75% prijatého fenylalanínu je hydroxylaných na O 2 a tyrozín fenylalaninhydroxylázou. Tento enzým je lokalizovaný v pečeni, má kofaktor tetrahydrobiopterín a jeho regenerácia sa uskutočňuje pomocou NAD + a O 2 . Hydroxylácia je nevratná. V prípade poruchy tohto enzýmu vzniká najčastejšie vrodené ochorenie metabolizmu aminokyselín – fenylketonuria (hyperfenylalanémia). Fenylalanin je iba transaminovaný na fenylpyruvát a ďalej oxidovaný na fenylacetát. Tieto metabolity sa u zdravých jedincov vyskytujú iba v stopovom množstve v moči. Tyrozín môže byť metabolizovaný v mnohých cestách, pri ktorých vznikajú katecholamíny (otázka III/24), hormóny štítnej žľazy (otázka III/28), melaníny (otázka III/18) a tyramín. Tyrozín je degradovaný transaminačnou reakciou na hydroxyfenylpyruvát enzýmom tyrozínaminotransferázou. Tento enzým je inducibilným vplyvom glukokortikoidov a zvýšeným príjmom tyrozínu. ďalším medziproduktom je kyselina homogentisová. Homogentisátoxygenáza rozštiepi aromatický kruh a molekula sa linerizuje za vzniku maleinylacetátu s následnou izomeráciou z cis- na trans-izomér – fumarylacetacetát. Táto molekula je nakoniec rozštiepená na fumarát a acetacetát. Patobiochémia Fenylketonuria (PKU), spôsobená poruchou enzýmu fenylalaninhydroxylázy, je najčastejšou vrodenou poruchou metabolizmu aminokyselín (1:15 000). Biochemicky ju charakterizuje zvýšená hladina fenylalanínu (a znížena hladina tyrozínu) v krvi. Hyperfenylalnémia môže byť spôsobená tiež poruchou v ďalších enzýmoch, potrebných na syntézu BH 4 alebo poruchou dihydropteridinreduktáze, ktorá obnovuje BH 4 z BH 2 . Tieto poruchy nepriamu zvýšia koncentráciu fenylalanínu, lebo fenylalaninhydroxyláza využíva BH 4 ako koenzým. BH 4 sa tiež uplatňuje ako koenzým tyrozínhydroxlázy a tryptofanhydroxylázy, ktoré katalyzujú reakcie syntézy neurotransmiterou ako napr. serotonínu alebo katecholamínov. Jednoduché obmedzenie fenylalanínu v strave v tomto prípade nezvráti dopady na CNS, kvôli nedostatku neurotransmiterov. V tomto prípade hyperfenylalanémie sa využíva dopĺňanie BH 4 alebo L-DOPA a 5-hydroxytryptofanu (produkty metabolizmu postihnuté poruchou tyrozínhydroxylázy a tryptofánhydroxylázy), no reakcia organizmu nemusí byť vždy priaznivá. Pri klasickej fenylketonurii sa vyskytujú zvýšené hladiny fenylalanínu v tkanivách, plazme a moči. Fenyllaktát, fenylacetát a fenylpyruvát (fenylketón...od čoho pochádza názov choroby), ktoré sa za normálnych okolnosti v organizme takmer nevyskytujú, sú tiež zvýšené. Tieto metabolity dodávajú moču charakteristický plesnivý (zatuchutý) zápach. Ďalšími typickými príznakmi klasickej PKU je mentálna retardácia, neschopnosť chodiť alebo hovoriť, hyperaktivita, mikrocefalia, záchvaty, trasenia a poruchy rastu a vývoja. Pacient s neliečenou PKU prejavuje známky mentálnej retardácie do 1.roku života a zriedkavo dosiahne IQ vyššie ako 50 (v dnešnej dobe je to vďaka skríningu novorodencov iba zriedkavý úkaz). Pacienti s PKU často vykazujú známky nedostatku pigmentácie (svetle vlasy, svetlá pokožka a modré oči). Hydroxylácia tyrozínu tyrozinázou, čo je 1. krokom syntézy melanínu, je blokovaná vysokými hladinami fenylalanínu. Skorá diagnóza PKU je dôležitá, lebo choroba sa dá liečiť diétou. Pretože u novorodencov sa neprejavujú príznaky, sú nutné laboratórne vyšetrenia na zvýšené hladiny fenylalanínu v krvi. Avšak, novorodenci s PKU často majú normálne hladiny fenylalanínu v krvi pri narodení, lebo prebytočný fenylalanín sa degraduje matkou cez placentu. Normálne hladiny fenylalanínu môžu pretrvávať až kým je novorodenec je vystavený proteínom v strave po 24-48h. Preto sa skríningové testy robia až po tejto dobe, aby sa predišlo falošnej negativite. V prípade novorodencov s pozitívnym skríningovým vyšetrením sa diagnóza potvrdzuje kvantitatívnym stanovením hladiny fenylalanínu. Klasická PKU je dedičná choroba spôsobená jednou zo 100 rôznych mutácií v géne pre fenylalanínhydroxylázu (PAH). Frekvencia akejkoľvek mutácie sa líši v rôznych populáciách a choroba je často dvojnásobne heterozygotná, čo znamená, že PAH gén má rôzne mutácie na každej alele. Aj napriek týmto faktom je možná prenatálna diagnóza PKU pomocou DNA analýzy. Väčšina prirodzených proteínov v strave obsahuje fenylalanín a je nemožné uspokojiť nároky tela na bielkoviny konzumovaním normálnej stravy bez presiahnutia limitu fenylalanínu. Preto v prípade PKU je koncentrácia fenylalanínu v krvi udržiavaná v blízkosti normálnej hladiny konzumáciou syntetických doplnkov aminokyselín so zníženým obsahom fenylalanínu, doplnené o niektoré prírodné potraviny (ako napr. ovocie, zeleninu a niektoré cereálie) s nízkou hladinou fenylalanínu. Príjem fenylalanínu je prispôsobený tolerancií jedinca, ktorá sa stanovuje meraním hladiny fenylalanínu v krvi. Čím skôr sa začne s diétou, tým väčšia je prevencia poškodenia CNS. Odporúčaná doba začiatku diéty je 7-10 deň od narodenia, aby sa predišlo mentálnej retardácií. Pretože fenylalanín je esenciálnou aminokyselinou, neodporúča sa aj príliš drastická diéta, ktorá by viedla k veľmi nízkej hladine fenylalanínu v krvi, čo by spôsobilo poškodenie vývoja a nervového systému. U pacientov s PKU nie je možné syntetizovať tyrozín a preto sa stáva esenciálnou aminokyselinou a teda musí sa prijímať stravou. Nedodržiavanie tejto diéty pred 8- rokom života je spojené s nízkym IQ. Dospelí pacienti s PKU vykazujú zníženie IQ po nedodržiavaní diéty. Preto sa odporúča dodržiavanie diéty počas celého života. Pacienti s PKU by sa tiež mali vyhýbať aspartámu (umelému sladidlu), lebo tiež obsahuje fenylalanín. Ak žena s PKU nedodržuje počas tehotenstva odporúčanú diétu, jej dieťa je potom postihnuté „syndrómom materskej PKU“. Vysoká hladina fenylalanínu v krvi matky vyvolá mikrocefaliu, mentálnu retardáciu a vývojové vady srdca u plodu (fenylalanin je teratogén). Niektoré z týchto reakcií na vysokú hladinu fenylalanínu sa objavia počas prvých mesiacov tehotenstva. Preto je dôležitá kontrola hladiny fenylalanínu v krvi, ktorá musí byť regulovaná počas celej doby tehotenstva. Alkaptonúria je vzácna metabolická porucha, ktorá vzniká poškodením v enzýme homogentisatoxidáze, čím sa hromadí kyselina homogentisova, ktorá vzniká pri degradácií tyrozínu. Táto choroba má tri hlavné symptómy: homogentisovú aciduriu (zvýšená hladina kyseliny homogentisovej v moči, ktorá oxidáciou sfarbí po čase moč do čierna), artritídu veľkých kĺbov a čiernu pigmentáciu chrupaviek a kolagénového tkaniva. Pacienti s alakptonuriou sú často asymptomatický až do 40. roku života. Čierne zafarbenie plienok občas môže určovať ochorenie u novorodencov, ale väčšinou sa neprejavuje až do vyššieho veku. Diéta obmedzujúca proteíny – hlavne obmedzenie fenylalanínu a tyrozínu- pomáha znížiť hladinu kyseliny homogentisovej a znížiť tak aj množstvo pigmentu v tkanivách. Aj napriek tomu, že alkaptonúria nie je život ohrozujúca, sprevádzajúca artritída môže spôsobiť problémy s pohybom. Novorodenecká hypertyrozinémia sa veľmi často vyskytuje u nedonosených detí, ale väčšinou sa v priebehu niekoľkých mesiacov upravuje. II/14. Metabolismus sirných aminokyselin. Medzi sírne aminokyseliny patrí cysteín a methionín. Cysteín je neesenciálnou aminokyselinou obsahujúcou atóm síry. Vzniká z homocysteínu a serínu. Metabolizmus cysteínu závisí na potrebe buniek. Hlavným metabolitom je cysteinsulfát vznikajúci oxidáciou –SH skupiny; ten je ďalej metabolizovaný cez taurín na sulfát (SO 4 2- ) a pyruvát. Taurín je aminokyselina, ktorej funkcia nie je úplne jasná. Predpokladá sa, že má význam pre vývoj mozgu. Taurín sa konjuguje so žlčovými kyselinami, ovplyvňuje fluiditu žlče a zvyšuje clearence cholesterolu v pečeni. Sulfit môže byť oxidovaný na sulfát a môže byť použitý pre tvorbu 3 ́-fosfoadenozín-5 ́-fosfosulfátu (PAPS, aktívny sulfát), ktorý je zdrojom sulfátových skupín v organizme napr. pri detoxikačných reakciách. Cysteín môže podliehať transaminácií s následnedným vznikom pyruvátu a thiosulfátu. Cysteín je nevyhnutnou aminokyselinou pre vytváranie terciárnej štruktúry proteínov (tvorba disulfidických mostíkov), je súčasťou glutathionu, vo veľkom podiele je zastúpený napr. v proteínoch vlasov (v keratínu). Dekarboxyláciou cysteínu vzniká cysteamin, ktorý je súčasťou koenzýmu A. Methionín je esenciálna aminokyselina, ktorá je degradovaná bunkou v závislosti na potrebe energie alebo iných metabolitov. Pri nadbytku methioninu je uhlíkový skelet využitý ako zdroj energie alebo pre glukoneogenézu a síra je zachovaná v cysteíne. Prvá reakcia je katalyzovaná methioninadenosyltransferázou. Všetky fosfátové skupiny sú uvoľnené a vzniká S-adenosylmethionín (SAM), kde sulfoniový ión je veľmi reaktívny, resp. vzniká relatívne nestabilná štruktúra, a metylová skupina je veľmi ľahko uvoľňovaná. SAM je významným donorom metylovej skupiny pre biochemické reakcie. Metylácia zo SAM je ireverzibilná, napr. pri syntéze katecholamínov, cholínu, kreatínu,... Po uvoľnení metylovej skupiny vzniká S-adenosylhomocysteín, ktorý je rozštiepený adenosylhomocysteinázou na homocysteín (molekula väčšia o jednu uhlíkovú skupinu než cystín) a adenosín. Molekulu síry sa organizmus snaží uschovať a tak dochádza k syntéze cystathionu, kedy s homocysteínom reaguje serín za prítomnosti enzýmu cystathionin-β-syntázy s kofaktorom pyridoxal fosfátom. Cystathionin je rozštiepený cystathinázou na cysteín (presun atómu síry), α-ketobutyrát a amoniak. Presunu atómu síry hovoríme transsulfurácia. Alfa-ketobutyrát je dekarboxylovaný multienzymovým komplexom a cez propionyl-CoA vzniká sukcinyl-CoA. V prípade potreby energie je homocysteín metabolizovaný homocysteindesulfhydrazou na α-ketobutyrát, amoniak a sirovodík. Resyntéza methionínu vyžaduje enzým homocysteinmethyltransferázu, ktorá má kofaktor vitamín B 12 a metylová skupina pochádza z N 5 -metyltetrahydrofolátu. Patobiochémia Cystinuria je porucha membránového transportéru cystínu a bazických aminokyselín (lyzínu, arginínu, ornitínu) s následnou zvýšenou exkréciou do moči. Nízka rozpustnosť cystinu vedie k tvorbe kryštálikov a konkrementov v močových cestách. Prevenciou môže byť alkalizácia moči. Cystín sa v organizme premieňa na cysteín cystínreduktázou. Závažnejšie ochorenie je cystinóza, pri ktorej sa cystín akumuluje v lyzozómoch v ľadvinách a ďalších orgánoch. Ide o poruchu transportu cystínu na lyzozomálnej membráne. Táto akumulácia v ľadvinách vedie až k ich zlyhaniu. Hyperhomocysteinémia je choroba, ktorej príčinou je geneticky podmienený defekt cystathionin-β-synthasy alebo porucha remetylácie homocysteinu. Na vzniku tejto poruchy sa môže podieľať aj nedostatok kyseliny listovej, vitamínu B 12 a B 6 . Hyperhomocysteinémia je nezávislý rizikový faktor ischemickej choroby srdca. II/15. Biosyntéza, biodegradace a funkce nejdůležitějších biogenních aminů. Medzi základné biogenné amíny patria katecholamíny (dopamín, adrenalín, noradrenalín), histamín, serotonín, melatonín, GABA, etanolamín (a jeho deriváty – cholín a acetylcholín), cysteamín, β-alanín a tryptamín. Všetky vznikajú premenou aminokyselín. Katecholamíny a ich metabolizmus sú popísané v samostatnej otázke – otázka III/24. Histamín je chemický mediátor, ktorý usmerňuje veľké množstvo bunkových odpovedí, ako napr. alergické a zápalové (zánětlivé) reakcie, sekréciu HCl v žalúdku a zrejme slúži aj ako neurotransmiter v určitej časti mozgu. Ide o silný vazodilatátor. Histamín sa syntetizuje dekarboxyláciou histidínu pomocou histamín dekarboxylázy, ktorá vyžaduje prítomnosť pyridoxal fosfátu (PLP). Hneď ako je histamín nasyntetizovaný, tak je buď ukladaný do zásob alebo je rýchlo degradovaný pomocou degradačných enzýmov – histamín-N- metyltransferázou (hlavne v CNS) alebo diamín oxidázou (aj v iných tkanivách). Histamín sa ukladá v granulách žírnych buniek a bazofilov, odkiaľ je uvoľnený vplyvom rôznych stimulov (žiarenie, alergén, lieky,...). Serotonín (tiež 5-hydroxytryptamín – 5HT) je syntetizovaný a ukladaný v rôznych miestach organizmu. Zatiaľ najväčšie množstvo serotonínu bolo nájdené v črevnej mukóze. Menšie množstvá sa nachádzajú v CNS, kde hraje úlohu neurotransmiteru a tiež v trombocytoch. Serotonín je syntetizovaný z tryptofánu hydroxyláciou pomocou tryptofán hydroxlázy za prítomnosti tetrohydropterínu (analogicky ako v metabolizme fenylalanínu). Produkt tejto reakcie, 5-hydroxytryptofán, je následne dekarboxylovaný dekarboxylázou za prítomnosti PLP na serotonín. Serotonín sa degraduje pôsobením enzýmu monoamín oxidázy (MAO). Serotonín má viacero fyziologických funkcii ako napr. vnímanie bolesti, reguláciu spánku, chuti do jedla, teploty tela, krvného tlaku, kognitívnych funkcii a nálady (spôsobuje pocit radosti). Melatonín je hormón, ktorý vzniká v epifýze zo serotonínu acetyláciou a následnou metyláciou. Podnetom na syntézu je najmä svetlo (hlavne modrá zložka). Melatonín reguluje denný rytmus, je antioxidantom a hraje úlohu v imunite a regulácii hladkej svloviny. Tryptamín vzniká dekarboxláciou tryptofánu. Ide o regulačnú molekulu, o ktorej funkcii sa vie zatiaľ málo. GABA (kyselina γ-aminomaslová) je hlavný inhibičný neurotransmiter v CNS. Vzniká dekarboxyláciou glutamátu enzýmom glutamátdekarboxylázou za prítomnosti PLP. GABA sa postupne degraduje až na sukcinát, ktorý môže vstúpiť do citrátového cyklu. Cystamín je súčasťou koenzýmu A, ktorá vzniká dekarboxyláciou cysteínu. β-alanín vzniká dekarboxláciou aspartátu, ale tvorí sa aj pri odbúravaní pyrimidínových bází. Ide taktiež o súčasť koenzýmu A. Etanolamín vzniká dekarboxláciou serínu. Následnou trojnásobnou metyláciou vzniká cholín, ktorý je prekurzorom acetylcholínu. Enzým cholínacetyltransferáza katalyzuje tvorbu acetylcholínu z acetyl-CoA a cholínu. Etanolamín a cholín sú súčasťou fosfolipidov – fosfatidylcholínu a fosfatidyletanolamínu. Acetylcholín pôsobí ako neurotransmiter. II/16. Konverze aminokyselin do specializovaných produktů: kreatin, S-adenosylmethionin, karnitin, taurin a jejich význam. Kreatínfosfát (alebo fosfokreatín) je fosforylovaný derivát kreatínu nachádzajúceho sa v svalovine, je vysokoenergetická zlúčenina, ktorá predstavuje malú, ale rýchlo mobilizovateľnú zásobu rezervu vysokoenergetických fosfátov, ktoré môžu byť reverzibilne prenesené na ADP, aby sa udržala stála hodnota ATP v bunke počas prvých minút intenzívnej svalovej kontrakcie. Kreatín sa syntetizuje z glycínu a guanidínovej skupiny arginínu a metylovej skupiny zo SAM. Kreatín je reverzibilne fosforylovaný na kreatínfosfát kreatínkinázou za použitia ATP ako zdroja fosfátu. Prítomnosť kreatinkinázy (hlavne izoenzýmu MB) v plazme indikuje poškodenie myokardu a používa sa pri diagnostike infarktu myokardu (otázka III/20). Kreatín a kreatínfosfát sa spontánne zacyklujú pomalou, ale stálou reakciou za vzniku kreatinínu, ktorý sa potom vylučuje v moči. Množstvo kreatinínu vylúčeného je priamo úmerné obsahu kreatin foasfátu v tele a teda môže byť použité na stanovenie svalovej hmoty. Ak je z akéhokoľvek dôvodu svalová hmota redukovaná (napr. paralýzou alebo svalovou dystrofiou) znižuje sa obsah kreatinínu v moči. Ďalej, každé zvýšenie kreatinínu v krvi je citlivým indikátorom ľadvinovej malfunkcie, lebo kreatinín je normálne rýchlo odstraňovaný z krvi a vylučovaný. Priemerný dospelý človek vylúči asi 15 mmol kreatinínu za deň. S-adenosylmetionín (SAM) alebo aktívny metionín je nukleozid, schopný metylovať iné látky a preto je nevyhnutný v mnohých metabolických dráhach (cholín, kreatin, adrenalin,...). Táto vlastnosť je daná prítomnosťou atómu síry s kladným nábojom. Po nevratnej strate metylovej skupiny vzniká S- adenosylhomocysteín (SAH) – jednoduchý thioéter, ktorý sa ďalej metabolizuje (otázka II/14). SAM vzniká kondenzáciou methionínu s adenozín trifosfátom (ATP) príslušnou transferázou. Syntéza SAM je náročná na energiu a je poháňaná hydolýzou všetkých 3 fosfátových skupín ATP. Karnitín je zlúčenina dôležitá pre ko-transport stredných a dlhých mastných kyselín do mitochondrie (otázka II/25). Prekurzorom karnitínu je lyzín. Karnitín nie je syntetizovaný priamo z lyzínu, ale z lyzínových zvyškov v rúznych proteínoch, kedy najprv prebehne trojnásobná metylácia a následnými ďalšími štyrmi reakciami vzniká karnitín. Taurín je derivát cysteínu. Vzniká z neho dekarboxyláciou a oxidáciou sulfhydrylovej skupiny na sulfónovú skupinu. V organizme je významný pre 2.fázu biotransformačných reakcií. Konjugáciou niektorých látok s taurínom sa zvyšuje ich rozpustnosť vo vode a tým sa uľahčuje ich vylučovanie. S taurínom sú konjugované aj niektoré žlčové kyseliny (napr. kyselina taurocholová). Sulfonová skupina je relatívne silne kyslá, takže je prakticky vo všetkých prostrediach bežných v organizme ionizovaná, čo je významné pre emulgačnú funkciu týchto žlčových kyselín. II/17. Glykolýza, regulace, oxidace pyruvátu, pyruvátdehydrogenázový komplex. Glykolýza je využívaná všetkými tkanivami na rozklad glukózy a vzniku energie (vo forme ATP) a metabolitov pre ďalšie metabolické dráhy. Glykolýza je akýmsi „dopravným uzlom“ metabolizmu sacharidov, lebo v podstate všetky cukry, či už prijaté potravou alebo syntetizované v organizme, môžu premeniť na glukózu. Konečným produktom glykolýzy v bunkách s mitochondriami a dostatočným prístupom kyslíka je pyruvát. Táto metabolická dráha sa nazýva aeróbna glykolýza, lebo vyžaduje prístup kyslíku na reoxidáciu NADH vzniknutého počas oxidácie glyceraldehyd-3- fosfátu. Aeróbna glykolýza predchádza oxidatívnej dekarboxylácii pyruvátu na acetyl-CoA, ktorý je hlavným metabolitom pre začiatok citrátového cyklu. Alternatívne môže byť pyruvát redukovaný na laktát, pričom NADH sa oxiduje na NAD + . Táto premena glukózy na laktát sa nazýva anaeróbna glykolýza, lebo sa odohráva bez prístupu kyslíka. Anaeróbna glykolýza umožňuje produkciu ATP aj v bunkách, ktorým chýbajú mitochondrie (napr. erytrocyty) alebo majú nedostatok kyslíka. Glukóza nemôže samovoľne vstupovať do bunky, ale musí byť cez membránu prenesená jedným z dvoch transportných systémov, a to buď Na + -independentným sprostredkovaným difúznym systémom alebo Na + -monosacharidovým kotransporterovým systémom. Na + -independentný sprostredkovaný difúzny systém je sprostredkovaný pomocou rodiny 14- ich glukózových transportérov na bunkovej membráne, označených ako GLUT-1 až GLUT-14. Tieto transportéry existujú v dvoch konformačných štádiách. Extracelulárna glukóza sa naviaže na transportér, čím zmení jeho konformáciu a prenesie glukózu cez membránu. Glukózové transportéry majú tkanivovú špecifickosť. Napr. GLUT-3 je hlavným glukózovým transportérom v neurónoch. GLUT-1 je rozšírený na erytrocytoch a hemato-encefalickej bariére, ale veľmi málo sa vyskytuje na svalových bunkách. GLUT-4 je rozšírený na adipocytoch a kostrovom svale, tieto transportéry sú závislé na inzulíne. Počas sprostredkovanej difúzie sa glukóza pohybuje v závislosti na koncentračnom gradiente – z miesta s vysokou koncentráciou glukózy do miesta s nižšou. Napr. GLUT-1, GLUT-3 a GLUT-4 sú primárne prispôsobené na príjem glukózy z krvi. Naopak GLUT-2, ktorý sa nachádza v pečeni a ľadvinách, môžu transportovať glukózu do týchto buniek za zvýšenej hladiny glukózy v krvi alebo ju transportovať z buniek, keď je hladina glukózy nízka (napr. pri hladovaní). GLUT-5 je špecifický v tom, že ide o primárny transportér fruktózy v tenkom čreve a testes. Na + -monosacharidový kotransporterový systém predstavuje aktívny transportný proces prenosu glukózy proti koncentračnému gradientu, a teda z miesta s nízkou koncentráciou glukózy (mimo bunky) do miesta s vysokou koncentráciou glukózy (v bunke). V tomto systéme je prenos glukózy spojený s prenosom Na + do bunky. Prenášačom je Na + -dependentný glukózový transporter. Tento typ transportu sa odohráva najmä v epitelových bunkách čreva, renálnych tubuloch a bunkách plexus choroideus. Premena glukózy na pyruvát prebieha v dvoch fázach. Prvých päť reakcií glykolýzy predstavuje akési „získavanie zásob“ na výrobu energie. V tejto fáze sú syntetizované fosforylované formy metabolitov potrebných na vznik ATP. V druhej fáze prebieha samotná tvorba energie za vzniku dvoch molekúl ATP na jednu molekulu metabolizovanej glukózy v procese fosforylácie na substrátovej úrovni. Fosforylované molekuly sacharidov nedokážu prechádzať cez bunkovú membránu, lebo neexistuje žiaden prenášačový systém určený pre tieto látky a tiež preto, že sú príliš polárne na prestup lipidovou dvojvrstvou. Irreverzibílna fosforylácia glukózy tak uväzní molekuly sacharidov v bunke vo forme cytoplazmatického glukózy-6-fosfátu, čím je predurčený na pokračovanie v ďalšom metabolizme v bunke (ide o prvý krok glykolýzy). U cicavcov existuje viacero izoforiem enzýmu hexokinázy, ktorá katalyzuje fosforyláciu glukózy na glukózu-6-fosfát. Vo väčšine tkanív je fosforylácia glukózy katalyzovaná hexokinázou, jedným z troch kľúčových enzýmov glykolýzy. Hexokináza má širokú substrátovú špecifickosť a je schopná fosforylovať okrem glukózy aj viacero iných hexóz. Hexokináza je inhibovaná jej reakčným produktom, glukózou-6-fosfátom, ktorý sa akumuluje, ak ďalšie reakcie glykolýzy prebiehajú v nižšej miere. Hexokináza má nízke K m (a teda aj vysokú afinitu) pre glukózu. Tento fakt umožňuje účinnú fosforyláciu a nasledovný metabolizmus glukózy aj v prípade, že koncentrácia glukózy v tkanive je nízka. Hexóza má však nízke V max pre glukózu a preto nemôže udržiavať fosfát v bunke vo forme fosforylovaných hexóz alebo tiež nemôže fosforylovať viac sacharidov ako môže bunka využiť. V hepatocytoch alebo β-bunkách Langerhansových ostrovčekoch je glukokináza (tiež nazývaná hexokináza D alebo typ IV) dominantným enzýmom zodpovedným za foasforyláciu glukózy. V β-bunkách funguje glukokináza ako senzor pre glukózu, ktorý určuje prahovú koncentráciu pre sekréciu inzlínu. V pečeni tento enzým uskutočňuje fosforyláciu glukózy počas hyperglykémie. Hexokináza tiež funguje ako senzor glukózy v neurónoch a teda hrajú kľúčovú úlohu pri adrenergnej odpovedi na hypoglykémiu. Glukokináza má enzýmovú špecifickosť podobnú hexokináze. Glukokináza sa líši od hexokinázy vo viacerých dôležitých vlastnostiach. Napr. má o dosť vyššiu K m a teda vyžaduje vyššiu koncentráciu glukózy pre polovičnú saturáciu. Tým pádom glukokináza funguje iba pri zvýšenej intracelulárnej koncentrácii glukózy v hepatocytoch, čo nastáva napr. v krátkej dobe po konzumácii jedla buohatého na sacharidy, pričom do pečene sa veľké množstvo glukózy dostáva cez portálny obeh. Toto zabraňuje veľkému množstvu glukózy vstúpiť do systémového obehu po konzumácii jedla bohatého na sacharidy a tak zabraňuje hyperglykémii počas absorbčej periódy. Glukokinázová aktivita nie je priamo inhibovaná glukózou-6-fosfátom ako v prípade ostatných hexokináz, ale je inhibovaná nepriamo pomocou fruktózy-6-fosfátu (ktorá je v rovnováhe s glukózou-6-fosfátom, produktom glukokinázy) a je nepriamo stimulovaná pomocou glukózy (substrát glukokinázy) na základe podobného mechanizmu. Glukokinázový regulačný proteín (GKRP) v pečeni reguluje aktivitu glukokinázy pomocou reverzibilnej väzby. V prítomnosti fruktózy-6-fosfátu je glukokináza presunutá do jadra, kde sa viaže na regulačný proteín a tým inaktivuje expresiu enzýmu. Ak sa zvýši hladina glukózy v krvi (a tým aj v hepatocyte), tak je glukokináza uvoľnená z regulačného proteínu a vracia sa späť do cytoplazmy, kde fosforyluje glukózu na glukózu-6-fosfát. Fruktóza-1-fosfát inhibuje vznik komplexu glukokinázy s regulačným proteínom. Izomerizácia glukózy-6-fosfátu na fruktózu-6-fosfát je katalyzovaná fosfoglukózovou izomerázou (ide o druhý krok glykolýzy). Táto reakcia je veľmi vratná a preto sa nejedná a o kľúčovú reakciu glykolýzy. Ireverzibílna fosforylácia katalyzovaná fosfofruktokinízou-1 (PFK-1) je najdôležitejším kontrolným bodom a kľúčovou reakciou glykolýzy (ide o tretí krok glykolýzy). PFK-1 je kontrolovaná koncentráciou ATP, fruktózy-6-fosfátu a ďalších regulačných zlúčenín. PFK-1 je inhibovaná alostericky zvýšenými hladinami ATP. Zvýšená hladina citrátu, medziproduktu Krebsovho cyklu, tiež inhibuje tento enzým. Naopak, PFK-1 je aktivovaná alostericky zvýšenými hladinami AMP. Fruktóza-2,6-bisfosfát je najvýznamnejší m alosterickým aktivátorom PFK-1 a je schopný ju aktivovať aj keď je hladina ATP vysoká. Fruktóza-2,6-bisfosfát vzniká fosfofruktokinázou-2 (PFK-2), teda iným enzýmom ako PFK-1. PFK-2 je bifunkčný proteín, ktorý má jak kinázovú aktivitu, čím produkuje fruktózu-2,6-bisfosfát, tak aj fosfatázovú aktivitu, čím defosforyluje fruktózu-2,6-bisfosfát späť na fruktózu-6-fosfát. V pečeni je kinázová doména aktivovaná defosforyláciou a deaktivovaná fosforyláciou. Fruktóza-2,6-bisfosfát je inhibítorom fruktózy-1,6- bisfosfatázy, enzýmu glykoneogenézy. Recipročné účinky fruktózy-2,6-bisfosfát v glykolýze (aktivácia) a glukoneogenézy (inhibícia) zabezpečuje, že obe dráhy nebudú prebiehať rovnakou rýchlosťou v jeden čas, čím za medzuje vzniku cyklickej dráhy, v ktorej by sa glukóza degradovala na pyruvát a následne by sa pyruvát premieňal späť na glukózu. Znížená hladina glukagónu a zvýšená hladina inzulínu, čo nastáva napr. po zjedení jedla bohatého na sacharidy, spôsobuje zvýšenie hladiny fruktózy -2,6-bisfosfátu, a teda je aktivovaná glykolýza. Fruktóza-2,6-bisfosfát sa teda správa ako intracelulárny signál, ktorý indukuje zvýšenú hladinu glukózy. Zvýšená hladina glukagónu a znížená hladina inzulínu, čo nastáva pri hladovaní, znižuje intracelulárnu koncentráciu fruktózy-2,6-bisfosfátu, čo indukuje zníženie glykolýzy a zvýšenie glukoneogenézy. Aldoláza štiepi fruktózu-1,6-bisfosfát na dihydroxacetón fosfát a glyceraldehyd-3-fosfát. Táto reakcia je reverzibilná a nie je regulovaná. Aldoláza B, pečeňová a ľadvinná izoforma, tiež štiepi Fruktózu-1-fosfát a funguje v metabolizme fruktózy. Trióza fosfát izomeráza premieňa dihydroxyacetónfosfát na glyceraldehyd-3-fosfát. Dihydroxyacetón fosfát musí byť izomerovaný na glyceraldehyd-3-fosfát pre ďalšie kroky glykolýzy. Táto izomerácia spôsobuje celkový vznik dvoch molekúl glyceraldehyd-3-fosfátu z rozpadu jednej fruktózy-1,6-bisfosfát. Premena glyceraldehy-3-fosfátu na 1,3-bisfosfoglycerát (1,3-BPG) pomocou glyceraldehyd-3- fosfát dehydrogenázy (za použitia NAD + ako kofaktoru) je prvou redoxnou reakciou glykolýzy. Oxidácia aldehydovej skupiny glyceraldehyd-3-fosfátu na karboxylovú skupinu je spřažená s väzbou P i na karboxylovú skupinu. Vysokoenergetická fosfátová skupina na C1 v 1,3-BPG uschováva väčšinu voľnej energie vytvorenej pri oxidácii glyceraldehyd-3-fosfátu. Energia vysokoenergetického fosfátu umožňuje pokračovanie glykolýzy do ďalšieho kroku. V tomto kroku pôsobí arzén ako jed, tým, že konkuruje anorgnickému fosfátu ako substrátu pre glyceraldehyd-3- fosfát dehydrogenázu. Určitá časť 1,3-BPG sa premieňa na 2,3-bisfosfoglycerát (2,3-BPG) účinkom bisfosfoglycerát mutázy. 2,3-BPG, ktorý sa bežne nachádza vo väčšine buniek iba v stopovom množstve, sa vo väčšej koncentrácii nachádza v erytrocytoch (zvyšuje saturáciu kyslíkom) 2,3-BPG sa hydrolyzuje fosfatázou na 3-fosfoglycerát, ktorý je tiež medziproduktom glykolýzy. V erytrocytoch je glykolýza modifikovaná pridaním tohto kroku. Pri premene 1,3-BPG na 3-fosfoglycerát sa používa vysokoenergetická fosfátová skupina 1,3-BPG využíva na syntézu ATP z ADP. Táto reakcia je katalyzovaná fosfoglycerát kinázou, ktorá, na rozdiel od iných kináz, je fyziologicky reverzibilná. Pretože z jednej glukózy vznikajú dve molekuly 1,3-BPG, táto kinázová reakcia obnovuje 2 ATP, zaniknuté v minulých reakciách vzniku glukózy-6-fosfátu a fruktózy-1,6-bisfosfátu. Ďalšia reakcia glykolýzy - prešmyk fosfátovej skupiny z C3 na C fosfoglycerátu pomocou fosfoglycerát mutázy je voľne reverziblná. Dehydratácia 2-fosfoglycerátu enolázou redistribuje energiu v jej molekule, čím vzniká fosfoenolpyruvát (PEP), ktorý obsahuje vysokoenergetický enolfosfát. Aj naproti vzniku vysokoenergetického produktu, je táto reakcia reverzibilná. Premena PEP na pyruvát je katalyzovaná pyruvát kinázou, treťou ireverzibilnou reakciou glykolýzy. Rovnováha pyruvátkinázovej reakcie je posunutá v smere vzniku ATP. V pečeni je pyruvát kináza aktivovaná fruktózou-1,6-bisfosfátom, produktom fosfofruktokinázovej reakcie. Táto regulácia má význam pre spojenie dvoch kinázových reakcií: zvýšená fosfofruktokinázová aktivita zvyšuje hladiny fruktózy-1,6-bisfosfátu, ktorý aktivuje pyruvát kinázu. Fosforylácia cAMP-dependentnou proteinkinázou vedie k inaktivácii pyruvát kinázy v pečeni. Ak sa zníži glykémia, zvýšená hladina glukagónu zvyšuje intracelulárnu koncentráciu cAMP, čo spôsobí fosforyláciu a inaktiváciu pyruvát kinázy. Preto PEP nemôže pokračovať v glykolýze a vstupuje do glukoneogenézy. Toto čiastočne vysvetľuje inhibíciu glykolýzy a stimuláciu glukoneogenézy pomocou glukagónu v pečeni. Defosforylácia pyruvát kinázy pomocou fosfoprotein fosfatázou umožňuje reaktiváciu tohto enzýmu. Laktát, vznikajúci pomocou laktát dehydrogenázy, je koncovým produktom anaerobnej glykolýzy v eukaryotických bunkách. Vznik laktátu je hlavnou premenou pyruvátu v čočke a rohovke, dreni ľadvín, testes, leukocytoch a erytrocytoch, pretože tieto bunky sú buď veľmi málo zásobené krvou alebo im chýbajú mitochondrie. V pracujúcom svale, produkcia NADH presahuje icidatívnu kapacitu dýchacieho reťazca. Toto vedie k zvýšeniu pomeru NADH/NAD + , čím sa podporuje redukcia pyruvátu na laktát. Preto počas intenzívneho cvičenia sa akumuluje vo svaloch laktát a znižuje tak intracelulárne pH, čo môže viesť k vzniku kŕčov. Väčšina tohto laktátu následne difunduje do krvného riečišťa a môže byť využité v pečeni na vznik glukózy. Smer laktát dehydrogenázovej reakcie závisí na relatívnych intracelulárnych koncentráciách laktátu a pyruvátu a na pomere NADH/NAD + v bunke. Napr. v pečeni a srdci je pomer NADH/NAD + nižší ako v aktívnom svalstve. Tieto tkanivá oxidujú laktát (získaný z krvi) na pyruvát. V pečeni je pyruvát buď premenený na glukózu pomocou glukoneogenézy alebo sa oxiduje v Krebsovom cykle. Myokard výhradne oxiduje laktát na CO 2 a H 2 O v Krebsovom cykle. Zvýšená hladina laktátu v krvi, nazývaná laktátová acidóza, nastáva najmä pri zliahni obehového systému, ako napr. pri infarkte myokardu, pľúcnej embólii, nekontrolovanom krvácaní alebo pri šoku. Neschopnosť zásobiť tkanivá adekvátne kyslíkom vedie k nedostatočnej oxidatívnej fosforylácii a zníženej tvorbe ATP. Aby bunka prežila, využíva anaeróbnu glykolýzu ako náhradný systém tvorby ATP, čím vzniká aj laktát ako koncový produkt dráhy. Množstvo kyslíku potrebné pre zotavenie tkanív z tohto stavu do normálu sa nazýva kyslíkový dlh. Napriek tomu, že určité množstvo ATP sa uvoľňuje už počas glykolýzy, konečné produkty, laktát alebo pyruvát, obsahujú najväčšie množstvo energie obsiahnuté v glukóze. Na uvoľnenie tejto energie je nutný ich vstup do Krebsovho cyklu. Pri anaeróbnej glykolýze vznikajú 2 molekuly ATP na jednu molekulu glukózy premenenej na dve molekuly laktátu. Nevzniká a ani sa tu nespotrebováva žiaden NADH. Priamy energetický vznik aeróbnej glykolýzy je rovnaký ako v prípade anaeróbnej, teda 2 ATP na jednu glukózu. Okrem toho sa produkujú aj 2 molekuly NADH na jednu glukózu. Pokračovanie anaeróbnej glykolýzy vyžaduje oxidáciu väčšiny NADH v dýchacom reťazci, čím vznikajú cca 3 ATO na jednu molekulu NADH. Regulácia glykolýzy allosterickou aktiváciou alebo inhibíciou kľúčových enzýmov je krátkodobý dej – ovplyvňujú premenu glukózy na dobu minút až hodín. Nadriadené týmto čiastkovým regulačným efektom sú pomalšie a často účinnejšie homonálne vplyvy na množstvo syntetizovaných enzýmov. Tieto efekty môžu 10-20x zvýšiť aktivitu enzýmov počas nasledujúcich hodín až dní. Recipročné zmeny nastanú aj v riadení glukoneogenézy. Príjem potravy bohatej na sacharidy alebo príjem inzlínu, zvýši množstvo glukokinázy, fosfofruktokinázy a pyruvát kinázy v pečeni. Tieto zmeny odrážajú zvýšenú syntézu týchto enzýmov. Vysoká aktivita týchto enzýmov urýchľuje premenu glukózy na pyruvát, charakteristicky v čase po jedle. Naopak je syntéza týchto hormónov znížená, keď je hladina glukagónu zvýšená a inzulín je znížený, napr. pri hladovaní alebo diabete. V mitochondriálnej matrix je pyruvát premenený na acetyl-CoA pomocou pyruvát dehydogenázového komplexu, ide o multienzýmový komplex. Je veľmi dôležité zdôrazniť, že pyruvát dehydrogenázový komplex nie je súčasťou citrátového cyklu, ale je hlavným zdrojom acetyl-CoA. Pyruvát dehydrogenázový komplex (PDH komplex) je multimolekulárny agregát troch enzýmov – pyruvát dehydrogenázy (PDH), dihydrolipoyl transacetylázy a dihydrolipoyl dehydrogenázy. Každý z týchto enzýmov katalyzuje časť reakcie. Ich fyzická väzba vedie čiastkové reakcie správnym smerom bez uvoľnenia metabolitov. Okrem týchto enzýmov obsahuje komplex aj dva regulačné enzýmy – pyruvát dehydrogenázovú kinázu a pyruvát dehydrogenázovú fosfatázu. PDH komplex obsahuje 5 koenzýmov, ktoré sa chovajú ako prenášače alebo oxidanty pre čiastkové reakcie. PDH obsahuje tiamín pyrofosfát (TPP), dihydrolipoyl transacetyláza obsahuje kyselinu lipoovú (L) a CoA a dihydrolipoyl dehydrogenáza obsahuje FAD a NAD + . Kovalentná modifikácia pomocou dvoch regulačných enzýmov spôsobujú alternatívne aktiváciu alebo inaktiváciu PDH. cAMP dependentná PDH kináza fosforyluje a teda inhibuje PDH, pričom PDH fosfatáza defosforyluje a teda aktivuje PDH. Kináza sama o sebe je alostericky aktivovaná pomocou ATP, acetyl CoA a NADH. Preto je PDH komplex v prítomnosti vysoko energetických signálov. Pyruvát funguje ako inhibítor PDH kinázy, preto ak je koncentrácia pyruvátu zvýšená je PDH maximálne aktívna. Vápenáte ióny je silným aktivátorom PDH fosfatázy, ktorá stimuluje aktivitu PDH. Tento fakt je zvlášť dôležitý v kostrovom svalstve, kde uvoľnenie Ca 2+ počas kontrakcie stimuluje PDH komplex a teda aj produkciu energie. Aj keď je kovalentná regulácia kinázou a fosfátazou kľúčová, komplex tiež podlieha produktovej inhibícii (NADH, acetyl-CoA). II/18. Glukoneogeneze, regulace. Niektoré orgány ako napr. mozog a erytrocyty potrebujú nepretržitú dodávku glukózy. Ak nie je dostatok sacharidov v potrave, udržuje sa nejakú dobu glykémia odbúravaním jaterního glykogénu. Po vyčerpaní jeho zásob nastupuje novotvorba glukózy – glukoneogenéza. Aj za ňu zodpovedá predovšetkým pečeň. Vysokú glukoneogenetickú aktivitu majú aj tubulárne bunky ľadvín. Prekurzormi pre glukoneogenézu sú predovšetkým glukogénne aminokyseliny, vznikajúce prevažne proteolýzou vo svaloch. Ďalším významným prekurzorom je laktát, vznikajúci v erytrocytoch a svaloch pri nedostatku O 2 . Pre glukoneogenézu môže slúžiť aj glycerol uvoľnený pri odbúravaní tukov. Naproti tomu premena mastných kyselín na glukózu nie je u živočíchov možná. Vďaka glukoneogenéze môže organizmus denne vytvoriť aj niekoľko stoviek gramov glukózy. Veľ dielčích reakcií glukoneogenézy je katalyzovaných enzýmami, ktoré sa podieľajú aj na glykolýze. Určité enzýmy (tu označené ako 12-15) sú na druhú stranu špecifické pre glukoneogenézu a syntetizujú sa, až keď je ich treba, účinkom kortizolu a glukagónu. Zatiaľ čo glykolýza prebieha výlučne v cytoplazme, na glukoneogenéza sa podieľajú aj mitochondrie a endoplazmatické retikulum. Pre syntézu glukózy potrebuje glukoneogenéza 4 ATP a 2 GTP, tj. trikrát viac nukleosidtrifosfátov ako vytvára glykolýza. (11) Laktát ako prekurzor glukoneogenézy vzniká predovšetkým v svaloch (Coriov cyklus) a v erytrocytoch. Laktátdehydrogenáza ho oxiduje za tvorby NADH na pyruvát. (12) Prvý krok vlastnej glukoneogenézy prebieha v mitochondriách. Dôvodom pre túto „obchádzku“ je rovnovážna konštanta silne exergonickej pyruvátkinázovej reakcie (ΔG ́ = -62 kJ/mol). Hydrolýza ATP by nestačila k tomu, aby sa pyruvát priamo fosforyloval na fosfoenolpyruvát (PEP). Pyruvát preto najprv vstupuje do mitochondriálnej matrix pomocou monokarboxylátového transportéru a tam sa karboxyluje pyruvátkarboxylázou závislou na biotíne na oxalacetát. Oxalacetát je tiež medziproduktom citrátového cyklu. Všetky aminokyseliny, ktorých odbúravanie je napojené na citrátový cyklus alebo poskytujú pyruvát, sú preto glukogénne. Oxalacetát vytvorený v mitochondriách sa exportuje von do cytoplazmy pomocou malátového člunku. (13) V cytoplazme sa oxalacetát premieňa PEP-karboxylázou na fosfoenolpyruvát za spotreby GTP (nie ATP!!!!). Nasledujú korky, ktoré sú až na po fruktózu-1,6-bisfosfát vlastne obrátenými reakciami glykolýzy. Pre tvorbu 1,3-bisfosfoglycerátu sa pri tom na každý C 3 - fragment spotrebuje ďalšie ATP. Každý z fosfátových zvyškov fruktózy-1,6-bisfosfátu odštiepujú fosfatázy špecifické pre glukoneogenézu. Medzitým prebehne izomerácia fruktózy-6-fosfátu na glukózu-6-fosfát, teda ďalšia reakcia spoločná pre glykolýzu. (14) Reakcia katalyzovaná fruktózo-1,6-bisfosfatázou je dôležitým regulačným bodom celej glukoneogenézy. (15) Posledný enzým dráhy, glukózo-6-fosfatáza, sa nachádza v pečeni, ale nie vo svaloch. Ako integrálny membránový proteín je lokalizovaný na vnútornej strane hladkého endoplazmatického retikula. Transport glukózy-6-fosfátu do endoplazmatického retikula a tu vzniknutej glukózy späť do cytoplazmy zaisťuje špecifický transportér- Potom sa glukóza konečne uvoľňuje do krvi prenášačom Glut-2. Voľný glycerol, ktorý vzniká predovšetkým pri odbúravaní tukov, sa najprv fosforyluje v 3. pozícii (16). Vznikajúci glycerol-3-fosfát sa dehydrogenázou závislou na NAD + oxiduje na glyceron-3-fosfát (17) a tak vstupuje do glukoneogenézy. Rovnakou reakciou môže katalyzovať aj mitochochondriálny enzým závislý na FAD („glycerolfosfátový člunek“). II/19. Syntéza a degradace glykogenu, regulace. Glykogén slúži živočíchom ako zásobná forma sacharidov, z ktorej je v prípade potreby možné uvoľniť glukózofosfát a glukózu. Ukladanie samotnej glukózy by nebolo možné, lebo jej vysoké koncentrácie by spôsobili, že by bolo vnútorné prostredie bunky silno hypertonické a začalo by nasávať vodu. Molekula nerozpustného glykogénu má o veľa menšiu osmotickú aktivitu. Ľudský organizmus môže skladovať až 450 g glykogénu, z čoho je až 150 g v pečeni a takmer celý zvyšok v svaloch. Obsah glykogénu v ostatných orgánoch je zanedbateľný. Jaterní glykogén slúži predovšetkým k udržovaniu glykémie v postresorpčnej fáze. Z tohto dôvodu množstvo glykogénu v pečeni veľmi kolísa. Pri dlhotrvajúcom hladovaní klesá až k nule – zásobovanie orgánov glukózou potom prevezme glukoneogenéza. Svalový glykogén hraje úlohu energetickej rezervy a nepodieľa sa na udržiavaní glykémie, lebo svaly nemajú glukózo-6-fosfatázu a teda nemôžu uvoľniť glukózu do krvi. Obsah glykogénu v svaloch kolísa menej ako v pečeni. Živočíšny glykogén, podobne ako rastlinný amylopektín, je rozvetvený homopolysacharid glukózy. Glukózové zvyšky sú spojené glykozidovými väzbami väzby α1→4. Vznikajúca stromčeková štruktúra obsahuje až 50 000 zvyškov glukózy (M > 1.10 7 Da). Jaterní glykogén sa nikdy úplne neodbúra. Všeobecne sa neredukujúce konce „stromčekov“ skracujú alebo naopak pri dostatočnom množstve glukózy sa predlžujú. (1) Vznik glykozidovej väzby medzi cukrami je endergonický. Preto sa najprv z glukózy-1-fosfátu tvorí aktívna forma, UDP- glukóza. (2) Nasleduje prenos glukózového zvyšku z UDP-glukózy na neredukujúci koniec niektorej z „vetvičiek“ enzýmom glykogén- syntázou. (3) Ak rastúci reťazec dosiahne určitej dĺžky (>11 zvyškov), odštiepi sa z nej 6-7 zvyškov dlhý oligosacharid pomocou rozvetvujúceho enzýmu a pripojí sa na ten istý alebo na niektorý susedný reťazec väzbou α1→6. Vzniknuté vetvy sa ďalej predlžujú glykogén-syntázou. (4) Rozvetvená štruktúra glykogénu umožňuje rýchle uvoľňovanie cukorných zvyškov. Najdôležitejší enzým pre odbúravanie, glykogénfosforyláza, postupne odštiepuje z neredukujúceho konca glukózovej jednotky v podobe glukózy-1-fosfátu. Čím väčší je počet neredukujúcich koncov, tým viac molekúl fosforylázy na nej môže súčasne nasadnúť . Tvorba glukózy- 1-fosfátu je výhodná tým, že nie je treba ďalšieho ATP pre vstup glukózy do glykolýzy alebo pentózového cyklu. (5) (6) Štruktúra glykogénfosforylázy spôsobuje, že sa odbúravanie zastaví vždy 4 zvyšky pred rozvetvením. V tomto okamžiku prichádzajú na rad ďalšie dva enzýmy. Najprv glukanotransferáza prenesie trisacharid z postranného reťazca na koniec hlavného reťazca (5). Potom 1,6-glukosidáza odštiepiposledný zvyšok ako voľnú glukózu. Zostane nerozvetvený reťazec, ktorý znovu začne spracovávať fosforyláza. Za homeostázu glukózy v organizme zodpovedá hlavne pečeň. Ak sa zvýši glykémia, hepatocyty začnú glukózu odoberať z krvi a premieňajú ju na glykogén a ďalšie metabolity. Naopak pri nedostatku glukózy sa začne glykogén okamžite odbúravať a glukóza z neho uvoľnená sa začne dodávať do krvi. Rýchlosť tvorby glykogénu určuje regulácia aktivity glykogén-syntázy, jeho odbúravania potom glykogéfosforylázy. Metabolizmus glykogénu ovplyvňujú najmä 2 peptidické hormóny – inzulín a glukagón. Ak dôjde k poklesu glykémie, uvoľní sa z pankreasu glukagón, ktorý aktivuje glykogenolýzu a spomalí syntézu glykogénu. Glukagón sa viaže na receptor na plazmatickej membráne a aktivuje adenylcyklázu, čím dôjde k tvorbe druhého posla cAMP. Preoteínkináza A aktivovaná cAMP má niekoľko miest účinku: fosforyláciou inaktivuje glykogénsyntázu, čím zastaví tvorbu glykogénu. Súčasne aktivuje ďalšiu proteinkinázu, ktorá fosforyláciou premení neaktívnu formu fosforylázy na aktívnu (interkonverzia). Aktívna fosforyláza uvoľňuje z glykogénu cez medziprodukty glukózu, ktorá prechádza do krvi. Ak sa hladina cAMP opäť zníži, získavajú prevahu proteinfosfatázy, ktoré defosforylujú rôzne proteíny uvedenej kaskády. Tým zastavia odbúravanie glykogénu a opäť spustia jeho syntézu. Pri vysokej glykémii inzulín stimuluje syntézu glykogénu a zastavuje glykogenolýzu. Cez medziprodukty inhibuje proteinkinázu GSK-3, a tým bráni inaktivácii glykogensyntázy. Naviac inzulín bráni účinku glukagónu tým, že aktivuje cAMP-fosfodiesterázu, ktorá znižuje hladinu cAMP. Nakoniec inzulín aktivuje niektoré proteinfosfatázy a prepína tak metabolizmus glykogénu z katabolického na anabolický režim. II/20. Pentózový cyklus, regulace. Pentózový cyklus (tiež hexózomonofosfátová dráha alebo pentozofosfátová dráha) je oxidatívna metabolická dráha, ktorá prebieha v cytoplazme a rovnako ako glykolýza vychádza z glukóza-6-fosfátu. Dodáva dva významné metabolity pre anabolické deje: NADPH potrebné napr. pre biosyntézu mastných kyselín alebo izoprenoidov a ribózu-5-fosfát, prekurzor pre biosyntézu nukleotidov. V oxidatívnej časti cyklu sa glukóza premieňa na ribulózu-5-fosfát. Vzniká pri tom 1 CO 2 a 2NADPH. Zložitejšia regeneračná časť premieňa, podľa aktuálnych metabolických nárokov, časť pentózofosfátu späť na hexózofosfát alebo je napojená na glykolýzu, Vo väčšine buniek sa v pentózovom cykle odbúravaná menej než 10% glukózy-6-fosfátu. (1) Oxidatívna časť začína oxidáciou glukózy-6-fosfátu pomocou glukózy-6-foafátdehydrogenázy. Ide o kľúčový enzým dráhy, ktorý je regulovaný nadbytkom NADP + (stimuluje) a nadbytkom NADPH (inhibuje). Vzniká pritom prvý NADPH. Druhým produktom je 6-fosfoglukonolaktón, vnútorný ester (laktón) 6-fosfoglukonátu. (2) Laktón sa štiepi špecifickou hydrolázou a vzniká 6-fosfoglukonát s voľnými karboxylovámi skupinami. (3) Posledný enzým oxidatívnej časti, fosfoglukonátdehydrogenázy, odštiepi karboxylovú skupinu na C-3 na oxoskupinu. Súčasne vzniká druhé NADPH a ketopentóza ribulóza-5-fosfát. Izomeráciou sa tvorí základná látka pre syntézu nukleových kyselín, ribóza-5-fosfát. Regeneračná časť pentózového cyklu je významná tým, že prispôsobuje čistú produkciu NADPH a pentózofosfátov ich aktuálnej spotrebe bunkou. Väčšinou je treba o veľa viac NADPH než pentózofosfátov. Dôjde najprv k premene 6 ribulóza-5-fosfátov na 5 molekúl fruktózy-6-fosfátu a následne sa z nich regeneruje 5 glukózo-6-fosfátov. Tie môžu znova vstúpiť do oxidačnej časti cyklu a stať sa základným materiálom pre tvorbu ďalších molekúl NADPH. Opakovaním týchto reakcií sa molekula glukózy-6-fosfátu postupne oxiduje na 6 CO 2 a vzniká pri tom 12 NADPH. Celkovo sa pri tomto priebehu netvorí žiaden pentózofosfát. Ak bunka potrebuje okrem NADPH aj energiu vo forme ATP, môže produkty regeneratívnej fázy pentózového cyklu (t.j. fruktóza-6-fosfát a glyceral- 3-fosfát) využiť v glykolýze a ďalej v citrátovom cykle a dýchacom reťazci odbúrať na CO 2 a H 2 O. V tomto prípade vznikne zo 6 mólov glukózy-6- fosfátu 12 mólov NADPH a asi 150 mólov AP. Aktivita cyklu je regulovaná inzulínom. Jeho pôsobením sa nielen zvyšuje rýchlosť odbúrávabím glukózy, ale zvyšuje sa aj hladina NADPH pre syntézu mastných kyselín a izoprenoidov. Reakcie regeneračnej fázy cyklu sú ľahko vratné. Je preto možné aj tvorba pentózofosfátov z hexózofosfátov. Stáva sa tak pri veľkej spotrebe pentózofosfátov, napr. behom replikácie DNA v S- fázi bunkového cyklu. Pre preusporiadanie látok v regeneračnej fázy pentózového cyklu sú zvlášť významné dva enzýmy, ktoré prenášajú C 2 a C 3 -fragmenty z jedného fosoforylovaného cukru na druhý. Transketoláza (6) katalyzuje prenos C 2 štiepov. Týmto spôsobom napr. z dvoch C 5 -cukrov vznikne C 7 -ketóza sedoheptulóza-7-fosfát a glyceral-3- fosfát alebo všeobecne (5 + 5 = 7 + 3). Koenzýmom reakcie je tiamíndifosfát (TPP), ktorý sa zúčastňuje aj reakcii dehydrogenáz oxokyselín. Podobne, ale bez účasti TPP, katalyzuje transaldóza (7) prenos C 3 -fragmentoc. Premieňa heptózofosfát a triózofosfát na tetrózofosfát a hexózofosfát (7 + 3 = 4 + 6). II/21. Metabolismus galaktózy a fruktózy, poruchy. Fruktóza a galaktóza sa vyskytujú v značnom množstve v potrave (najmä vo forme disacharidov) a preto významne prispievajú do energetického metabolizmu. Okrem toho je galaktóza významnou súčasťou štruktúrnych sacharidov bunky. Fruktóza predstavuje zdroj asi 10% kalórii potravy v Západnom Svete (cca 55g/deň). Hlavným zdrojom fruktózy je disacharid sacharóza, ktorá pri štiepení v čreve uvoľňuje rovnaké množstvo fruktózy a glukózy. Fruktóza sa tiež nachádza ako voľný monosacharid v ovocí, mede a kukuričnom sirupe, ktorý sa používa na sladenie limonád a rôznych jedál. Vstup fruktózy do bunky nie závislý na inzulíne a taktiež nepodnecuje sekréciu inzulínu (na rozdiel od glukózy). Aby mohla fruktóza sa zapojiť do metabolických dráh, musí sa najprv fosforylovať pomocou hexokinázy alebo fruktokinázy (tiež nazývanej ketohexokináza). Hexokináza fosforyluje glukózu vo väčšine buniek tela a tiež niektoré iné hexózy môžu byť substrátom tohto enzýmu. Avšak, hexokináza má nízku afinitu pre fruktózu. Preto, ak nie je koncentrácia fruktózy značne zvýšená, je iba malé množstvo fruktózy zmenené na fruktózu-6-fosfát pomocou hexokinázy. Fruktokináza predstavuje hlavný mechanizmus fosforylácie fruktózy. Nachádza sa v pečeni (kde sa spracováva väčšina fruktózy z potravy), ľadvinách a mukóze tenkého čreva, kde premieňa fruktózu na fruktózu-1-fosfát za použitia ATP ako zdroja fosfátovej skupiny (v týchto troch tkanivách sa tiež nachádza aldoláza B). Fruktóza-1-fosfát nie je fosforylovaná na 1,6-bisfosfát ako je tomu v prípade fruktózy-6-fosfátu, ale je štiepená pomocou aldolázy B (tiež nazývaná ako fruktóza-1-fosfát aldoláza) na dihydroxyacetón fosfát (DHAP) a glyceraldehyd. V ľudskom tele existujú tri typy aldoláz – typ A, B a C, ktoré sú produktmi troch rôznych génov. Aldoláza A (nachádza sa vo väčšine tkanív), aldoláza B (v pečeni) a aldoláza C (v mozgu) štiepia fruktózu-1,6-bisfosfát produkovaný počas glykolýzy na DHAP a glycerladehyd-3-fosfát, ale iba aldoláza B štiepi frukózu-1-fosfát. DHAP sa priamo môže vstúpiť do glykolýzy alebo glukoneogenézy, pričom glyceraldehyd môže byť súčasťou mnohých metabolických dráh. Rýchlosť metabolizmu fruktózy je vyššia ako metabolizmu glukózy, lebo triózy vznikajúce z fruktózy-1-fosfátu obchádzajú fosfofruktokináz 1, ktorá predstavuje hlavný regulačný krok glykolýzy. Manóza, C-2 epimér glukózy, je dôležitým komponentom glykoproteínov. Hexokináza fosforyluje manózu, čím vzniká manóza- 6-fosfát, ktorá je hneď reverzibilne izomerizovaná na fruktózu-6-fosfát pomocou fosfomanózovej izomerázy. Keďže človek prijíma potravou iba malé množstvo manózy, väčšina jej intracelulárnej koncentrácie vzniká fruktózy alebo už existujúcej manózy vzniknutej degradáciou štruktúrnych sacharidov. Väčšina cukrov je fosforylovaných hneď po ich vstupe do buniek. Preto sú uväznené vo vnútri bunky, lebo organické fosfáty nemôžu prechádzať membránou bez špecifických transportérov. Alternatívnym mechanizmom metabolizmu monosacharidov je ich premena na cukorné alkoholy redukciou karbonylovej skupiny na hydroxylovú skupinu. Aldózová reduktáza redukuje glukózu na sorbitol (glucitol). Tento enzým sa nachádza vo viacerých tkanivách ako napr. šošovke (čočke), sietnici, Schwannových bunkách periférnych nervov, pečeni, ľadvinách, placente, erytrocytoch, vaječníkoch alebo bunkách glandula vesiculosa. V bunkách pečene, ovárii a glandula vesiculosa sa vyskytuje ešte ďalší enzým, sorbitol dehydrogenáza, ktorý oxiduje sorbitol za vzniku fruktózy. Dvoj reakčná dráha premeny glukózy na fruktózu v bunkách glandula vesiculosa je významná pre spermie, ktoré využívajú fruktózu ako hlavný sacharidový zdroj energie. Dráha premeny sorbitolu na fruktózu v pečeni poskytuje mechanizmus, ktorým každý sorbitol môže byť premenený na substrát, ktorý môže vstúpiť do glykolýzy alebo glukoneogenézy. Pretože inzulín nie je potrebný na vstup do buniek spomínaných vyššie, počas hyperglykémie môže do nich vstúpiť veľké množstvo glukózy, napr. pri nekontrolovanom diabete. Zvýšená intracelulárna koncentrácia glukózy a adekvátne množstvo NADPH spôsobuje nadmernú produkciu sorbitolu aldózovou redukázou, ktorý následne nie je schopný prechádzať membránami a preto zostáva uväznený v bunkách. Tento stav sa zhoršuje v neprítomnosti sorbitolovej dehydrogenázy, ktorá sa vyskytuje v nízkych koncentráciách alebo chýba úplne napr. v sietnici, šošovke (čočce), ľadvinách alebo neurónoch. V dôsledku toho sa hromadí v týchto bunkách sorbitol, ktorý má veľké osmotické účinky, čím spôsobuje zväčšovanie buniek v dôsledku zadržiavania vody bunkami. Tento jav má súvislosť s patologickými zmenami spôsobenými diabetom, ako napr. vznik katarakty, periférna neuropatia a mikrovaskulárne problémy spôsobujúce nefropatiu a retinopatiu. Galaktóza je prijímaná organizmom vo forme disacharidu laktózy. Určité množstvo galaktózy vzniká lyzozomálnou degradáciou komplexných sacharidov, napr. v glykoproteínoch alebo glykolipidoch, ktoré sú dôležitými súčasťami membrány. Podobne ako v prípade fruktózy, aj galaktóza vstupuje do bunky nezávisle na inzulíne. Podobne ako fruktóza, galaktóza musí byť fosforylovaná pred tým ako bude ďalej metabolizovaná. Väčšina tkanív obsahuje špecifický enzým pre tento proces, galaktokinázu, ktorý produkujt galaktózu-1-fosfát, pričom je zdrojom fosfátu ATP. Galaktóza-1-fosfát nemôže vstúpiť do glykolýzy, kým nie je premenená na UDP-galaktózu. V tejto reakcii UDP-glukóza reaguje s galaktóza-1-fosfátom za vzniku UDP-galaktózy a glukózy-1-fosfátu. Reakcia je katalyzovaná pomocou glaktóza-1-fosfát uridyltransferázy (GALT). Aby mohla UDP-galaktóza vstúpiť do hlavnej dráhy metabolizmu glukózy, musí byť premenená na jej C-4 epimér, UDP-glukózu pomocou hexóza-4-epimeráza. Táto „nová“ UDP-glukóza (vzniknutá z pôvodnej UDP-galaktózy) môže byť súčasťou mnohých biosyntetických procesov, okrem iného môže byť použitá na už spomenutú reakciu s UDP- galaktózou. UDP-galaktóza môže slúžiť ako donor galaktózovej skupiny v množstve syntetických reakcií ako napr. syntéza laktózy, glykoproteínov, glykolipidov a glykosaminoglykanov. Ak nie je galaktóza prijímaná potravou (napr. ak nemôže byť uvoľnená z laktózy pri deficiencii β-galaktozidázy pri laktózovej intolerancii), požiadavky tkanív na UDP-galakózu môžu byť vyvážené premenou UDP-glukózy pomocou UDP-hexóza-4-epimerázy, ktorá vznikla z glukózy-1-fosfátu. Patobiochémia 1)Poruchy metabolizmu fruktózy Deficiencia jedného z kľúčových enzýmov potrebných pre vstup fruktózy do hlavných metabolických dráh môže viesť k benígnemu stavu, ktorý je výsledok deficiencie fruktokinázy (esenciálna fruktosúria, autosomálne recesívna, výskyt 1:130 000) alebo môže viesť k ťažkému narušeniu metabolizmu pečene a ľadvín ako dôsledok deficiencie aldolázy B (dedičná intolerancia fruktózy – HFI). Dedičná intolerancia fruktózy je automsomálne recesívna porucha, ktorá sa vyskytuje u 1:20 000 narodených a prejavuje sa, keď je novorodenec odstavený od materského mlieka a začne byť kŕmené stravou obsahujúcou fruktózu a sacharózu. Fruktóza-1-fosfát sa hromadí, čo má za následok zníženie hladiny anorganického fosfátu (P i ) a teda aj ATP, čím porastie hladina AMP. V neprítomnosti P i sa degraduje AMP, čím vzniká hyperuricemia (a laktačná acidóza). Znížená hladina hepatálneho ATP ovplyvňuje glukoneogenézu (to spôsobuje hypoglykémiu so zvracaním) a syntézu proteínov (spôsobuje zníženie hladiny koagulačných faktorov a iných dôležitých proteínov). Postihnuté sú tiež ľadvinové funkcie. Diagnostika HFI môže využívať dôkazu fruktózy v moči, ďalej imunochemickej metódy ELISA alebo DNA testov. V niektorých krajinách je HFI súčasťou novorodeneckého skríningu. Liečba HFI spočíva hlavne v odstránení sacharózy, sorbitolu a fruktózy z potravy, čím sa predchádza zlyhaniu pečene a smrti. Jedinci s HFI vykazujú averziu ku sladkému jedlu, čo má za následok absenciu zubného kazu. 2)Poruchy metabolizmu galaktózy GALT chýba u jedincov s klasickou galaktosémiou. Toto autosomálne recesívne ochorenie má incidenciu asi 1:30 000 narodených. Pri nedostatku GALT nemôže vstupovať galaktóza do glykolýzy. Hneď ako novorodenec dostane mlieko (ktoré obsahuje okrem iného aj laktózu), začne zvracať, odmieta stravu a objavujú sa kŕče. Neskôr sa pridávajú poruchy pečene a ľadvín, ktoré môžu skončiť smrťou, ak nie je ochorenie rozpoznané. V krvi a postihnutých orgánoch sa okrem voľného cukru hromadia aj iné metabolity ako napr. galaktóza-1-fosfát a cukorný alkohol galaktitol. Ten poškodzuje predovšetkým očnú šošovku (čočku) a inhibuje syntézu glykogénu. Väčšine následkov galaktosémie sa dá predchádzať dietou chudobnou na galaktózu. II/22. Metabolismus kyseliny glukuronové a její význam v organismu. Kyselina D-glukurónová (štruktúrne ide o glukózu s úplne oxidovanou hydroxylovou skupinou na karboxylovú skupinu na 6. uhlíku) a jej C-5 epimér, kyselina L-idurónová, patria medzi urónové kyseliny, ktoré sú významnými komponentmi glykosaminoglykánov. Kyselina glukurónová je potrebná pre detoxikačné procesy mnohých nerozpustných látok, ako je napr. bilirubín, steroidy a určité lieky vrátane morfínu. Rastliny a cicavce (s výnimkou morčiat a primátov vrátane človeka) využívajú kyselinu glukurónovú ako prekurzor kyseliny askorbovej (vitamínu C). Metabolická dráha urónových kyselín tiež umožňuje vstup D-xylulózy prijatej z potravy do hlavnej metabolickej dráhy sacharidov. Kyselina glukurónová môže byť v menšej miere prijatá potravou. Tiež môže byť prijatá z lyzozomálneho rozkladu glykosaminoglykánov. Konečným produktom metabolizmu kyseliny glukurónovej u človeka je D- xylulóza-5-fosfát, ktorý môže vstúpiť do metabolizmu hexóz, kde produkuje medzičlánky glykolýzy – glyceraldehyd-3-fosfát a fruktózu-6-fosfát. Aktivovaná forma kyseliny glukurónovej, ktorá je využívaná pri syntéze glykosaminoglykánov a iných reakciách, je kyselina UDP- glukurónová, ktorá vzniká oxidáciou UDP-glukózy. Priebeh premeny glukózy na kyselinu UDP-glukurónovú je popísaný vedľa. Syntéza kyseliny L-idurónovej prebieha po naviazaní kyseliny D-glukurónovej do sacharidového reťazca. Uronosyl-5- epimeráza spôsobuje epimerizáciu D-sacharidu na L-sacharid. II/23. Biosyntéza mastných kyselin. AK organizmus prijme potravou nadbytok využiteľnej energie, začnú sa tvoriť mastné kyseliny. Hlavnou surovinou je glukóza a bielkoviny. Biosyntéza mastných kyselín prebieha predovšetkým v pečeni a v tukovom tkanive. Jednotlivé kroky sú katalyzované multifunkčným enzýmovým systémom – syntázou mastných kyselín. Nachádza sa v cytoplazme a ako výchozí molekulu využíva acetyl-CoA. Acetylový zvyšok sa v cyklicky prebiehajúcej reakcií sedemkrát predĺži o C 2 . Ako redukčné činidlo slúži NADPH. Koncovým produktom je nasýtená C 16 mastná kyselina, kyselina palmitová. Tá sa následne môže premieňať na ďalšie mastné kyseliny. Kľúčovým enzýmom syntézy mastných kyselín je acetyl-CoA-karboxyláza (1). Karboxyláciou acetyl-CoA závislou na ATP dodáva malonyl-CoA potrebný pre ďalšie kroky. Karboxyláza je predradená syntáze mastných kyselín, obsahuje biotín, je regulovaná inzulínom, aktivuje sa defosforyláciou a deaktivuje ju AMP-K. Ako alosterický aktivátor na ňu pôsobí citrát, naopak palmitoyl-CoA, koncový produkt dráhy, ju alostericky inhibuje. Vlastná syntéza mastných kyselín prebieha cyklicky za katalýzy multifunkčnou syntázou mastných kyselín. Prvý cyklus začína prenosom acetylového zvyšku na periférnu cysteínovú skupinu (Cys-SH) (2). Súčasne dochádza k prenosu malonylového zvyšku z malonyl- CoA na 4-fosfopantethienovú skupinu (Pan-SH) (3). Reťazec sa predĺži kondenzáciou acetylového (poprípade v neskorších cykloch acylového) zvyšku s malonylovou skupinou za súčasnej dekarboxylácie (4). Nasledujúce reakčné kroky (redukcia 3-oxoskupiny (5), dehydrogenácia 3-hydroxyacylu (6) a jeho ďalšia redukcia (7)) sú v princípe obrátením β-oxidácie s rozdielom, že pre redukciu sa namiesto NADH používa NADPH. Dodávateľom NADPH sú reakcie pentózového cyklu (otázka II/20) a tzv. malátový enzým. Predlžený acylový zvyšok sa nakoniec prenáša na periférny cysteín a celý cyklus sa môže opakovať pripojením ďalšieho malonylového zvyšku na Pan-SH. Po siedmich cykloch, tj. Keď acylový zvyšok dosiahne 16 C atómov, sa hydrolyticky odštiepi palmitát (8). Reakcie syntézy mastných kyselín (2) – (8) prebiehajú na kompaktnom enzymatickom systéme, syntáze mastných kyselín. U vyšších živočíchov sa skladá z dvoch identických peptidových reťazcov, ktoré spolu vytvárajú dimérv tvare písmena X. Každý peptidový reťazec (272 kDa) katalyzuje všetkých sedem reakcií potrebných pre syntézu palmitátu. Každá podjednotka môže viazať acylové zvyšky thioesterovou väzbou na dvoch rôznych skupinách – SH: na periférnom cysteínovom zvyšku (Cys-SH) a na centrálnej 4 ́-fosfopantetheinovej skupine (Pan-SH), ktorá obsahuje koenzým A. Pan-SH kovalentne naviazaná na časť bielkoviny sa označuje ako acyl-carrier protein (ACP). Slúži ako dlhé rameno, ktoré predáva substrát z jedného reakčného centra do druhého, pričom obe podjednotky syntázy mastných kyselín spolu spolupracujú, preto je enzým funkčný len ako dimér. Priestorovo sú jednotlivé enzýmovo aktivity (2) – (8) rozdelené do domén. Aktivity (2) a (3) katalyzujú vstup substrátov acetyl- CoA/acyl-CoA a malonyl-CoA. Nasleduje kondenzácia reaktantov (4), takže dochádza k predlžovaniu reťazca. Ďalšie kroky sú redukcia oxoskupiny, odštiepenie vody a redukcia dvojitej väzby C=C. V poslednom kroku sa vznikajúca mastná kyselina buď prenesie opäť do pôvodnej pozície (tj. Na Cys-SH) (2) alebo sa uvoľní ako produkt (8), ak dosiahne dostatočnej dĺžky. Priestorové zoskupenie reakcií, ktoré za sebou nasledujú, do jedného multifunkčného enzýmu prináša niekoľko výhod oproti samostatným enzýmom: bráni spotrebovaniu medziproduktov v iných reakciách, jednotlivé reakčné kroky prebiehajú koordinovane a plynule a vďaka obmedzeniu difúzie sú mimoriadne účinné. Produkt biosyntézy mastných kyselín, kyselina palmitová, podlieha ďalším úpravám a tak sa môže ďalej predĺžiť alebo dehydrogenovať. Kyselina palmitová sa po biosyntéze naviaže na koenzým A. Táto aktivácia (1) je závislá na ATP. Predĺženie palmitoyl- CoA a ďalších aktivovaných mastných kyselín prebieha v endoplazmatickom retikule. Acyl-CoA sa môže predĺžiť o dva uhlíky pomocou malonyl-CoA. Palmityl-CoA sa môže premeniť na stearyl-CoA (C 18 ) a potom na kyselinu arachinovú (C 20 ). Ďalšími reakciami vznikajú dlhé C 22 a C 24 mastné kyseliny. Ich tvorba je významná hlavne v mozgu, v ktorého lipidoch sú tieto mastné kyseliny zabudované. Na rozdiel od biosyntézy na syntáze mastných kyselín prebiehajú tieto kroky v endoplazmatickom retikule v oddelených krokoch. Mastné kyseliny sú potom naviazané na CoA namiesto acyl-carrier protein (ACP). K predlžovaniu o C 2 je ale tiež potrebný jeden malonyl-CoA a dve NADPH.K zabudovaniu dvojitej väzby do štruktúry mastnej kyseliny pomocou desaturáz je nutný molekulový kyslík, NADPH a cytochrom b 5 . Ľudské desaturázy mastných kyselín môžu tvoriť dvojitú väzbu medzi C-9 a C-10. Ako príklad sa dá uviesť premena kyseliny steárovej na kyselinu olejovú alebo analogickú premenu kyseliny palmitovej na kyselinu pamitoleinovú. Ďalšie pozície, na ktorých môžu u človeka vzniknúť dvojité väzby sú C-4, C-5 a C-6. Dehydrogenácia za C-9 nie je u človek možná. Vzhľadom k neschopnosti vytvoriť dvojitú väzbu v mastných kyselinách za C-9 nemôže človek tvoriť z acetylových zvyškov mastné kyseliny s viacerými nenasýtenými väzbami, ako sú kyselina linolová, linolénova a arachidónová. Ω-6 kyselina linolová a ω-3 kyselina linolénová sú preto esenciálne. Predĺžením o C 2 (2) a vytvorním dvoch dvojitých väzieb (1 a 3) však môže z ω-kyseliny linolovej vzniknúť ω-6 kyselina arachidónová. Táto polynenasýtená mastná kyselina je esenciálna iba vtedy, ak v strave chýba kyselina linolová. II/24. Tvorba ketolátek z acetyl-CoA, metabolické příčiny, význam. Mitochondrie hepatocytov dokážu premieňať acetyl-CoA vzniknutý z oxidácie mastných kyselín na ketolátky. Ako ketolátky označujeme kyselinu acetooctovú (acetoacetát), kyselinu β- hydroxymaslovú (β-hydroxybutyrát/3-hydroxybutyrát/kyselina 3—hydroxmaslová) a acetón. Kyselina acetooctová a 3-hydroxymaslová sú transportované v krvi do periférnych tkanív. Tam sú premenené znova na acetyl-CoA, ktorý môže byť následne oxidovaný v Krebsovom cykle. Ketolátky sú významným zdrojom energie pre periférne tkanivá lebo: 1) sú rozpustné vo vodných roztokoch a preto nie je nutné ich zabudovávať do lipoproteínov alebo transportovať pomocou albumínu ako iné lipidy; 2) sú produkované v hepatocytoch počas obdobia, kedy množstvo acetyl- CoA presahuje oxidačnú kapacitu hepatocytu; 3) sú využívané proporcionálne extrahepatálnymi tkanivami (napr. kostrové svalstvo, myokard alebo kôra ľadvín) vzhľadom na ich koncentráciu v krvi. Mozog tiež dokáže využívať ketolátky, aby uspokojil svoje energetické potreby, keď ich koncentrácia v krvi výrazne stúpne; týmto ketolátky šetria glukózu. Je to dôležité hlavne počas dlhodobého hladovania. Poruchy oxidácie mastných kyselín sa prejavujú všeobecne hypoketózou (kvôli zníženému množstvu acetyl-CoA) a hypoglykémiou (kvôli zvýšenej spotrebe glukózy na vznik energie). Počas hladovania je pečeň „zaplavená“ mastnými kyselinami mobilizovanými z tukového tkaniva. Zvýšená koncentrácia hepatálneho aceyl-CoA vzniknutého hlavne z degradácie mastných kyselín inhibuje pyruvátdehydrogenázu a aktivuje pyruvát karboxylázu. Vzniknutý oxalacetát je v hepatocytoch používaný skôr na glukoneogenézu než pre Krebsov cyklus. A tak je acetyl-CoA zapojený do syntézy ketolátok (ketogenéza). Oxidácia mastných kyselín znižuje pomer NAD + a NADH a zvyšuje premenu oxalacetátu na malát pomocou NADH. Týmto je acetyl-CoA posúvaný preč z glukoneogenézy smerom do ketogenézy. Prvým krokom syntézy ketolátok, formácia acetoacetyl-CoA, prebieha ako obrátená tiolázová reakcia oxidácie mastných kyselín. Mitochondriálna HMG-CoA syntáza spája tretiu molekulu acetyl-CoA s acetoacetyl-CoA za vzniku 3-hydroxy-3-metylglutaryl- CoA (HMG-CoA). HMG-CoA je tiež prekurzorom cholesterolu. HMG-CoA syntáza je kľúčovým enzýmom syntézy ketolátok a nachádza sa v dostatočnom množstve iba v pečeni. HMG-CoA je štiepený za vzniku acetoacetátu a acetyl- CoA. Acetoacetát sa môže redukovať za vzniku 3- hydroxybutyrátu s NADH ako donorom vodíku. Acetoacetát môže tiež spontánne dekarboxylovať v krvi za vzniku acetónu – prchavý, biologicky nemetabolizovateľná látka, ktorá môže byť uvoľňovaná v dychu. Rovnováha medzi acetoacetátom a 3-hydroxybutyrátom je podmienená pomerom NAD + /NADH. Pretože tento pomer je nízky počas oxidácie mastných kyselín, je preferovaná syntéza 3- hydroxybutyrátu. Produkcia voľného CoA počas ketogenézy umožňuje pokračovanie oxidácie mastných kyselín. Napriek tomu, že pečeň sústavne syntetizuje malé množstvá ketolátok, ich produkcia sa stáva o veľa vyššia počas hladovania, keď sú ketolátky využívané ako zdroj energie pre periférne tkanivá. 3-hydroxybutyrát je oxidovaný na acetoacetát pomocou 3- hydroxybutyrát dehydrogenázy, čím sa produkuje NADH. Na acetoacetát sa potom naviaže molekula CoA získaná zo sukcinylu-CoA pomocou sukcinyl-CoA:acetoacetát-CoA transferázou (thiophoráza). Táto reakcia je vratná, ale jej produkt, acetoacetyl-CoA, je aktívne odstraňovaný jeho konverziou na dve molekuly acetyl-CoA. Extrahepatálne tkanivá, medzi ktoré patrí aj mozog, ale nepatria tam bunky bez mitochondrii (napr. erytrocyty), takto efektívne oxidujú acetoacetát a 3-hydroxybutyrát. Naopak, aj keď pečeň aktívne produkuje ketolátky, chýba jej thiphoráza a teda nedokáže využívať ketolátky ako palivo. Ak je rýchlosť ketosyntézy vyššia ako rýchlosť ich spotreby, ich koncentrácia v krvi (ketonemia) a prípadne aj v moči (ketonuria) začne stúpať. Tento stav je najčastejšie pozorovaný pri nekontrolovanom diabete mellite typu 1. U diabetických jedincov s ťažkou ketózou, exkréciou ketolátok v moči, môže dosiahnuť koncentráciu až 5,000 mg/24 hod, a ich koncentrácia v krvi až 90 mg/dl (fyziologická hodnota je menej ako 3 mg/dl). Častým príznakom diabetickej ketoacidózy je zápach acetónu v dychu, ktorý vzniká jeho zvýšenou syntézou. Zvýšená koncentrácia ketolátok v krvi spôsobuje acidémiu. Karboxylová skupina ketolátok má pK a okolo 4. Preto každá ketolátka stráca protón počas jej cirkulácie v krvi, čím znižuje telesné pH. Taktiež exkrécia glukózy a ketolátok v moči spôsobuje dehydratáciu tela. Preto zvýšená koncentrácia H + v zníženom objeme plazmy môže spôsobiť závažnú acidózu (ketoacidózu). Ketoacidóza môže byť pozorovaná aj počas hladovania. II/25. Oxidace mastných kyselin, energetický výtěžek, karnitinový systém. Mastné kyseliny sa po vstupe do bunky aktivujú a vzniká acyl-CoA. Existuje niekoľko acyl-CoA-syntáz, ktoré sa líšia substrátovou špecifitou a lokalizáciou. Aj ďalšia dráha, ktorou sa mastná kyselina odbúrava, závisí na jej type. Mastné kyseliny s krátkym (C 4 -C 6 ) a stredne dlhým reťazcom (C 8 -C 10 ) prechádzajú pomocou monokarboxylového transportéru do mitochondrie a jej matrix sa aktivujú na acyl-CoA. Mastné kyseliny s dlhým reťazcom (C 12 -C 18 ) sa aktivujú na acyl-CoA na vonkajšej mitochondriálnej membráne a potom sa transportujú cez vnútornú membránu pomocou karnitínového systému. V matrix sa mastné kyseliny s krátkym, stredne dlhým a dlhým reťazcom sa odbúravajú β-oxidáciu, Mastné kyseliny s veľmi dlhým reťazcom (viac ako C 18 ) a s rozvetveným reťazcom sú transportované do peroxizomov, kde sa metabolizujú. Mastné kyseliny s dlhým reťazcom (C 12 -C 18 ) majú vo vnútornej mitochondriálnej membráne skupinovo špecifický transportný systém. Acylové skupiny prenášajú na vonkajšej mitochondriálnej membráne karnitínacyltransferáza I (1a) na karnitín. Vytvorený acylkarnitín sa potom dostáva do mitochondriálnej matix výmenou za voľný karnitín pomocou acylkarnitín/karnitínového antiportu. Mitochondriálnyizoenzým karnitínacyltransferáza II potom katalyzuje prenos acylového zvyšku späť na CoA. Tento karnitíový systém určuje rýchlosť odbúravania mastných kyselín v mitochondriách. Malonyl-CoA inhibuje karnitinacyltransferázu a tým aj vstup mastných kyselín do matrix. Tvorba maloyl-CoA acetyl-CoA-karboxylázou je presne a orgánovo špecificky riadená. V mitochondriálnej matrix sa mastné kyseliny odbúravajú sledom oxidativných reakcií. Vytvárajú reakčnú špirálu, ktorá aktivované mastné kyseliny postupne rozloží na C 2 -štepy, aktivovanou kyselinou octovou (acetyl-CoA). V priebehu tohto deja sa vždy oxiduje skupina CH 2 acylového zvyšku na C-3 (β-pozícia) na ketoskupinu; podľa toho sa celý proces označuje ako β- oxidácia. Vznikajúce redukované koenzýmy vstupujú do dýchacieho reťazca. Priestorovo a funkčne je β-oxidácia tesne napojená na citrátový cyklus a dýchací reťazec. (1) Prvým krokom β-oxidácie je dehydrogenácia acyl-CoA na C-2 alebo C-3. Vzniká nenasýtený Δ 2 -enoyl-CoA s dvojitou väzbou v pozícii trans. Obe H-atómy sa prenášajú acyl-CoA-dehydrogenázou obsahujúci FAD na elektrontransferázový flavoproteín (ETF). ETF- dehydrogenáza (5) ich ďalej predáva na ubichinon (CoQ), súčasť dýchacieho reťazca. (2) Nasleduje adícia molekuly vody na dvojitú väzbu enoyl- CoA (hydratácia), pričom vzniká β-hydroxyacyl-CoA. (3) V nasledujúcej reakcii sa skupina –OH na C-3 oxiduje (dehydrogenuje) na karbonylovú skupinu. Vzniká β- ketoacyl-CoA. Redukčné ekvivalenty sa prenášajú na NAD + , ktorý pokračuje do dýchacieho reťazca. (4) Nakoniec β-ketoacyl-CoA rozštiepi acyltransferáza na acetyl-CoA a acyl-CoA kratší o 2 uhlíky (tzv. thioklastrické štiepenie). β-oxidácia je katalyzovaná rôznymi koenzýmami, ktoré sa špecializujú na rôzne dlhé mastné kyseliny. Aby došlo k úplnemu odbúraniu mastných kyselín s ďalším reťazcom, musí celý cyklus prebehnúť niekoľko krát – napr. pre stearyl-CoA (C18:0) osemkrát. Kompletným oxidatívnym odbúravaním molekuly kyseliny palmitovej vznikne asi 106 molekúl ATP, čo odpovedá energii 3300 kJ/mol. Tak vysoký energetický zisk robí z tukov ideálnu zásobnú formu metabolickej energie. V mnohých orgánoch, ako sú svaly alebo ľadviny, slúži β-oxidácia mastných kyselín ako zdroj energie v dobe medzi príjmom potravy. V pečeni sa využíva pre tvorbu ketolátok. β-oxidácia neprebieha v mozgu a v erytrocytoch. Dôležitým faktorom, ktorý reguluje β-oxidáciu, je pomer NAD + /NADH. Ak dýchací reťazec nespotrebováva NADH, zastaví nedostatok NAD + citrátový cyklus a tým sa zabrzdí aj β-oxidácia. Nenasýtené mastné kyseliny väčšinou obsahujú cis-dvojitú väzbu v pozícií 9 alebo 12, napr. kyselina linolová (18:2;9,12). Jej odbúravanie prebieha rovnako ako u nasýtených mastných kyselín v mitochondriách pomocou β-oxidáciou, pokiaľ nedôjde k cis-dvojitej väzbe na C-9. Pretože enoyl-CoA-hydratáza môže metabolizovať iba substráty s dvojitou väzbou v polohe trans, premení izomeráza cis-izomér enoyl-CoA na trans-izomér (1). Potom môže odbúravanie pokračovať opäť β-oxidáciou, dokial v ďalšom cykle nevznikne kratší trans-Δ 2 -cis-Δ 4 -derivát. Ten už nie je možné izomerovať ako v predchádzajúcom prípade. Namiesto toho sa redukuje proti NADPH na trans-Δ 3 - zlúčeninu (2). Pre preusporiadanie enoyl-CoA-izomerázou (1) môže β-oxidácia prebehnúť až do konca. Mastné kyseliny s nepárnym počtom uhlíkov sa odbúrávajú ako „normálne“ mastné kyseliny β- oxidáciou v mitochondriách. V poslednom kroku namiesto acetyl-CoA vznikne propionyl-CoA. Táto aktivovaná C 3 -karboxylovaná kyselina vzniká aj v metabolizme aminokyselín, sa premieňa na sukcinyl-CoA. Odbúravanie rozvetvených mastných kyselín s metylovými bočnými reťazcami, ako napr. kyselina fytanová, začína v peroxizomoch α- oxidáciou. α-hydroxyláza pri nej hydroxyluje α- uhlík. V ďalšom oxidačnom kroku sa mastná kyselina dekarboxyluje na kyselinu pristanovú. Nasledujú reakcie peroxizomálnej β- oxidácie, pri ktorej sa striedavo tvorí acetyl-CoA a propionyl-CoA. Hneď ako sa reťazec skráti asi na 8 uhlíkov, preniese sa mastná kyselina do mitochondrie a v nej sa odbúra ako mastná kyselina so stredne dlhým reťazcom. Vzácnejšie sa môžu mastné kyseliny odbúravať aj ω-oxidáciou v endoplazmatickom retikule. Dochádza k hydroxlácií koncovej metylovej skupiny systémom cytochrom P450 a následne k jej oxidácií na karboxylovú kyselinu s 6 až 10 uhlíkmi. Tieto dikarboxylové kyseliny sú už dostatočne rozpustné vo vode, takže sa môžu odbúrať inde ako stredne dlhé mastné kyseliny albo sa vylúčia v moči. II/26. Triacylglyceroly, biosyntéza, degradace. Mono-, di- a triacylglyceroly obsahujú jednu, dve alebo tri molekuly mastných kyselín esterifikované na molekulu glycerolu. Mastné kyseliny sa na glycerol esterifikujú cez karboxylovú skupinu, čím strácajú záporný náboj a vzniká tak neutrálny tuk. Všetky tri molekuly naviazané na molekulu glycerolu väčšinou nebývajú rovnaké. Mastná kyselina na C1 je väčšinou saturovaná, na C2 býva väčšinou nesaturovaná a na C3 môže byť aj saturovaná aj nesaturovaná. Prítomnosť nesaturovanej mastnej kyseliny znižuje teplotu topenia molekuly lipidu. Pretože sú triacylglyceroly iba veľmi málo rozpustné vo vode, nemôžu vytvárať sami stabilné micely, tak sa spájajú v adipocytoch, aby vytvorili olejové kvapôčky, ktoré takmer neobsahujú vodu. Tieto cytozolové tukové kvapôčky sú hlavným zdrojom energie pre organizmus. Glycerol fosfát je počiatočným akceptorom, mastných kyselín počas syntézy triacylglycerolov. Existujú 2 dráhy vzniku glycerol fosfátu. V oboch pečeň (hlavné miesto syntézy triacylglycerolov) a tukové tkanivo využívajú prvé glykolytické reakcie, aby dali vzniku dihydroxyacetón fosfátu (DHAP) – glycerol fosfát teda môže vznikať v glukózy. Ďalším krokom je redukcia DHAP pomocou glycerol fosfát dehydrogenázy za vzniku glycerol fosfátu. V druhej dráhe, ktorá prebieha v pečeni, ale nie v tukovom tkanive, sa využíva glycerol kináza, aby premenila voľný glycerol na glycerol fosfát. Glukózový transportér v adipocytoch (GLUT-4) je závislý na inzulíne. Preto, ak je hladina glukózy v plazme nízka, a teda aj hladina inzulínu, adipocyty majú iba obmedzenú schopnosť syntetizovať glycerol fosfát a teda nemôžu produkovať triacylglyceroly. Mastné kyseliny sa musia premeniť na ich aktivovanú formu predtým, ako sa môžu zúčastniť metabolických procesov, ako napr. je syntéza triacylglycerolov. Touto aktivovanou formou sa rozumie naviazanie mastnej kyseliny na koenzým A. Táto reakcia je katalyzovaná rodinou enzýmov mastný acyl-CoA syntetáz (thiokináz; fatty acyl-CoA syntethases). Samotná syntéza molekuly triacylglycerolu z glycerolfosfátu a mastného acyl-CoA prebieha ako sled štyroch reakcií, v ktorých sa postupne na glycerol fosfát naviažu dve mastné kyseliny z ich aktivovanej molekuly a odštiepi sa fosfát a pridá sa tretia mastná kyselina. V prvom kroku naviazaním prvej mastnej kyseliny vzniká kyselina lyzofosfatidová pôsobením acyltransferázy. Druhý krok je analogicky prvému – vzniká tak kyselina fosfatidová, tiež nazývaná diacylglycerolfosfát (prekurzor fosfolipidov – otázka II/27). V treťom kroku vzniká z kyseliny fosfatidovej pôsobením fosfatázy, ktorá odštiepi fosfátovú skupinu, diacylglycerol. V poslednej reakcií vzniká analogickým spôsobom ako v prvých dvoch molekula triacylglycerolu naviazaním mastnej kyseliny na diacylglycerol. V bielom tukovom tkanive sú triacylglyceroly uschované vo forme takmer bezvodných tukových kvapôčok uložených v cytoplazme. Slúžia ako „zásobný tuk“, ktorý je schopný mobilizácie, keď telo potrebuje energiu. Malé množstvo triacylglycerolu je uložené v pečeni. Väčšina triacylglycerolov vzniknutých v pečeni je exportovaných, zbalené s inými lipidmi a apoproteínmi dávajú vznik lipoproteínovým časticiam nazývaným very-low-density lipoproteins (VLDL). Následne sú VLDL vylúčené do krvi, kde dospievajú a prenášajú lipidy do periférnych tkanív. Viac o lipoproteínoch je v otázke II/32 a II/33. Mobilizácia mastných kyselín zo zásobného tuku zahŕňa hydrolytické uvoľnenie mastných kyselín a glycerolu z molekuly triacylglycerolu (degradácia triacylglycerolov). Tento proces je iniciovaný pôsobením hormón-senzitívnej lipázy, ktorá odštiepi mastnú kyselinu z C1 a/alebo C3 triacylglycerolu. Ďalšie lipázy špecifické pre di- alebo monoacylglyceroly odstránia zvyšné mastné kyseliny. Hormón-senzitívna lipáza (HSL) je aktivovaná fosforyláciou pomocou cAMP-dependentnej proteín kinázy. cAMP v adpocyte vzniká pôsobením určitého hormónu (napr. adrenalínu alebo glukagonu) naviazaného na membránový receptor, čím aktivuje adenylátcyklázy. Tento proces je podobný aktivácií glykogén fosforylázy. Pretože acetyl-CoA karboxyláza je inhibovaná hormonálno fosforyláciou pri aktivovanej cAMP kaskáde, syntéza mastných kyselín je neaktívna, keď prebieha degradácia triacylglycerolov. Ak vzrastie hladina inzulínu a glukózy v plazme, inaktivuje sa HSL. Glycerol uvoľnený z triacylglycerolov nemôže byť metabolizovaný v adipocytoch, lebo im chýba glycerol kináza. Namiesto toho je glycerol transportovaný do pečene, kde môže byť fosforylovaný. Vzniknutý glycerol fosfát môže byť využitý na vznik DHAP, ktorý môže ďalej vstupovať do glykolýzy alebo glukoneogenézy. Voľné (neesterifikované) mastné kyseliny prechádzajú cez membránu adipocytu a viažu sa na albumín v plazme. Následne sú transportované do iných tkanív, kde sú aktivované väzbou na acetyl- CoA a následne sa oxidujú za uvoľnenia energie. Nezávisle na plazmatickej koncentrácií, voľné mastné kyseliny nemôžu byť využité ako zdroj energie v erytrocytoch, lebo neobsahujú mitochondrie. Taktiež mozog nedokáže metabolizovať mastné kyseliny, no dôvod prečo nie veľmi jasný. Viac ako 50% mastných kyselín uvoľnených z triacylglycerolov v tukovom tkanive je znova esterifikovaných na glycerol fosfát.Adipocyty neporodukujú glycerol kinázu a glycerol fosfát je produkovaný v procese glyceroneogenézy, nekompletnej glukoneogenézy: pyruvát → fosfoenolpyruvát → oxalacetát → DHAP → glycerol fosfát. Tento proces znižuje plazmatické hladiny voľných mastných kyselín spojených s obezitou a diabetom typu 2. II/27. Biosyntéza a odbourávání fosfolipidů (glycerofosfolipidů a sfingolipidů). Syntéza glycerofosfolipidov zahŕňa buď prenos kyseliny fosfatidovej z CDP-diacylglycerolu na alkohol alebo prenos fosfomonoesteru z CDP-alkoholu na 1,2-diacylglycerol. V oboch prípadoch sa látka naviazaná na CDP považuje za „aktivovaný metabolit“ a pri syntéze glycerofosfolipidu sa uvoľňuje CMP ako vedľajší produkt. Kľúčový koncept syntézy fosfoglyceridu je teda aktivácia, buď diacylglycerolu alebo alkoholu, väzbou na CDP (analogicky to prebieha v metabolizme sacharidov väzbou na UDP). Mastné kyseliny naviazané na glycerol sa môžu navzájom veľmi líšiť, čo dodáva heterogenitu tejto skupine látok. Väčšina fosfolipidov je syntetizovaných na hladkom endoplazmatickom retikule. Odtiaľ sa transportujú do Golgiho aparátu a ďalej do membrán organel alebo do cytoplazmatickej membrány alebo sú vylúčené z bunky exocytózou. Fosfatidyletanolamín (PE) a fosfatidylcholín (PC) sú najrozšírenejšími fosfolipidmi vo väčšine eukaryotických buniek. Hlavná dráha ich syntézy využíva cholín a etanolamín prijaté potravou alebo degradáciou fosfolipidov. V pečeni môže byť PC syntetizovaný tiež z fosfatidylserínu (PS) a PE. Syntéza PE a PC z už existujúceho cholínu a etanolamínu zahŕňa fosforyláciu cholínu alebo etanolamínu kinázami s následnou premenou na aktivované formy –CDP- cholín alebo CDP-etanolamín. Nakoniec je cholín-fosfát alebo etanolamín-fosfát presunutý z nukleotidu (za vzniku CMP) na molekulu diacylglycerolu. Recyklácia cholínu v tele je veľmi dôležitá pretože, aj keď človek dokáže syntetizovať cholín de novo, jeho množstvá nie sú dostatočné pre jeho potreby. Preto je cholín esenciálnou zložkou potravín s adekvátnym príjmom 550 mg pre mužov a 425 mg pre ženy. Pečeň vyžaduje mechanizmus pre syntézu PC, aj keď je hladina voľného cholínu v krvi nízka, pretože vylučuje veľké množstvo PC do žlče a pre vznik lipoproteínov. Aby poskytla dostatok PC, dekarboxyluje sa fosfatidylserín (PS) na PE pomocou PS dekarboxylázy, enzýmu využívajúceho pyridoxalfosfát ako koenzým. PE potom podlieha trom metyláciam, aby vznikol PC. Ako donor metylových skupín sa využíva S-adenosylmetionín. Primárnou dráhou vzniku PS u vyšších živočíchov prebieha na základe výmennej reakcie, kde etanolamín z PE sa vymieňa za voľný serín. Táto reakcia, aj keď je reverzibílna, je primárnym zdrojom PS potrebného pre syntézu membrán. Fosfatidylinozitol (PI) sa syntetizuje z voľného inozitolu a CDP-diacylglycerolu podľa klasického konceptu syntézy fosfolipidov. PI je nezvyčajným fosfolipidom v tom, že často obsahuje kyselinu steárovú naviazanú na C1 a kyselinu arachidónovú na C2. PI preto môže slúžiť ako zásobáreň kyseliny arachidonovej v membránach a môže poskytovať substrát pre syntézu eikosanoidov v prípade potreby. PI je významný aj v bunkovej signalizácií tým, že z neho vznikajú 2 druhí poslovia – IP 3 a DAG (viac otázka IV/6). PI je v membráne tiež významný v tom, že sa na neho môžu karbohydrátovým mostíkom viazať špecifické proteíny – kotviaci fosoflipid. Fosfatidylglycerol sa nachádza v relatívne veľkých množstvách v mitochondriálnej membráne a je prekurzorom kardiolipinu Je syntetizovaný dvojkrokovou reakciou z CDP-diacylglycerolu a glycerol -3-fosfátu. Kardiolipín pozostáva z dvoch molekúl kyseliny fosfatidovej naviazanej na molekulu glycerolu. Syntetizuje sa prenosom diacylglycerofosfátu z CDP-diacylglycerolu na už existujúcu molekulu fosfatidylglycerolu. Sfingomyelin, sfinogzínový fosfolipid, je hlavnou lipidovou zložkou membrán nervového tkaniva. Syntéza sfingomyelínu začína kondenzáciou palmitoyl-CoA so serínom, pričom sa vylúči CoA a karboxylová skupina serínu (v podobe CO 2 ). Táto reakcia vyžaduje pyridoxylfosfát ako koenzým. Následne sa produkt reakcie redukuje na sfinganin reakciou vyžadujúcou NADPH. Sfinganin sa následne acyluje na svojich aminoskupinách jednou z množstva rôzne dlhých mastných kyselín a následne sa desaturuje za vzniku ceramín. Fosforylcholín z fosfatidylcholínu sa prenáša na ceramín za vzniku sfingomyelínu a diacylglycerolu. Sfingomyelín v myelínových pošvách obsahuje hlavne mastné kyseliny s dlhým reťazcom ako napr. kyselinu lignocerovú alebo nervónovú, pričom sfingomyselín v šedej hmote mozgu obsahuje hlavne kyselinu steárovú. Degradácia fosfoglyceridov je sprostredkovaná fosfolipázami nachádzajúcimi sa vo všetkých tkanivách a pankreatickej šťave. Množstvo toxínov a jedov vykazuje fosfolipázovú aktivitu a niektoré patogénne baktérie produkujú fosfolipázy, čím rozpúšťajú bunkové membrány a šíria infekciu. Sfingomyselín sa degraduje lyzozomálnymi fosfolipázami – sfingolipázami. Fosfolipázy hydrolyzujú fosfodiesterové väzby fosfoglyceridov, pričom každý enzým štiepi fosfolipid na špecifickom mieste. Odstránenie mastnej kyseliny na C1 alebo C2 fosfoglyceridu dáva vznik lyzofosfoglyceridu, substrátu pre lyzofosfolipázy. Fosfolipázy sa môžu zúčastňovať vzniku druhých poslov alebo substrátov pre syntézu signálnych látok (napr. kyseliny arachidónovej). Fosfolipázy nie sú len zodpovedné za degradáciu fosfolipidov, ale aj za ich „úpravu“, napr. fosfolipázy A 1 a A 2 odstraňujú špecifické mastné kyseliny z membránových fosfolipidov, pričom tieto mastné kyseliny môžu byť nahradené inými pomocou mastný acyl-CoA transferázy. Sfingomyelín sa degraduje sfingomyelinázou, lyzozomálnym enzýmom, ktorý hydrolyticky odštiepuje fosforylcholín za vzniku ceramidu. Ceramid je následne štiepený ceramidázou na sfingozín a voľné mastné kyseliny. Patobiochémia Niemann-Picková chooba (typu A aj B) je autozomálne recesívne ochorenie spôsobené neschopnosťou degradácie sfingomyelínu. Defektný enzým je sfingomyelináza – typ fosfolypázy C. V ťažkej novorodeneckej forme (typ A) je pečeň a slezina, primárne miesta úschovy lipidov, sú ohromne zväčšené. Lipidy pozostávajúce prevažne zo sfingomyelínu sa nemôžu degradovať. Novorodenci s týmto ochorením vykazujú rýchlu a progresívnu neurodegeneráciu ako následok ukladania sfyngomyelínu v CNS a umierajú vo veľmi skorom veku. Menej závažná forma (typ B) spôsobuje malé až žiadne poškodenie nervového tkaniva, ale pľúca, slezina, pečeň a kostná dreň sú poškodené, čím vzniká chronická forma tejto choroby s prognózou dožitia sa dospelosti. Aj keď Niemann-Picková choroba sa vyskytuje u všetkých etník, typ A vykazuje vyšší výskyt u Aškenázskych Židov ako v celkovej populácií. II/28. Biosyntéza prostaglandinů, thromboxanů a leukotrienů. Ako eikosanoidy označujeme skupinu autkrinne a parakrinne pôsobiacich signálnych látok odvodených od mastných kyselín C 20 (grécky eikosi = 20). Ako mediátory ovplyvňujú značný počet fyziologických procesov. Metabolizmus eikosanoidov je preto dôležitým cieľom mnohých liečiv. Eikosanoidy môžu vznikať v takmer všetkých somatických bunkách. Východziou látkou sú membránové fosfolipidy, kyselina arachidonová (20:4) alebo iné viacnásobné nenasýtené C 20 mastné kyseliny. Najprv fosfolipáza A 2 (PLA 2 ) uvoľní z týchto fosfolipidov arachidonát. Aktivita PLA 2 je pod hormonálnou kontrolou, napr. ju tlmí prostredníctvom proteínu lipokortin glukokortikoidy. Vzniknutý arachidonát už sám pôsobí ako signálna látka, ale významnejší účinok majú jeho metabolity. Od arachidonátu k eikosanoidom vedú dve dráhy. Kľúčovým enzýmom prvej dráhy (glykooxygenázová dráha) je prostaglandín-H 2 -syntáza. V prvej dvojkrokovej reakcií ovplyvní cyklizáciu arachidonátu na prostaglandín H 2 (PGH 2 ). Prvý krok PGH-syntázy katalyzovaný aktivitou cyklooxygenázy (COX) zavedie do mastnej kyseliny kyslík. Druhým krokom je peroxidázová reakcia. V závislosti na ďalšej enzymatickej výbave sa z PGH 2 rôzne prostaglandíny, prostacyklíny a trombaxany súhrne označovaných ako prostanoidy. Pre prostaglandíny je charakteristická prítomnosť izocyklického päťčlenného cyklu, pre prostacyklíny ešte jeden dodatočný päťčlenný kruh s ďalším O a pre trombaxany šesťčlenný kruh obsahujúci O. Druhá cesta (lipoperoxidázová dráha) je katalyzovaná 5- lipoxygenázami, ktoré z kyseliny arachidónovej vytvorí hydroxy- a hydroxyperoxymastné kyseliny, z ktorých odštiepením vody a ďalšími prenosnými reakciami vzniknú leukotrieny, deriváty mastných kyselín s otvorenými reťazcami. Eikosanoidy pôsobia prostredníctvom membránových receptorov v bezprostrednom okolí svojho vzniku ako na bunku, ktorá ich tvorí (autokrinne), tak na bunky susedné (parakrinne). Mnoho iných účinkov je sprostredkovaných 7-helix-receptormi a druhými poslami, akými sú cAMP, vápenaté ióny a inozitolfosfáty. Eikosanoidy ovplyvňujú – podľa svojho charakteru – tlmivé alebo stimulačné kontrakcie hladkej svaloviny, krvný tlak, dýchanie a činnosť čreva alebo dělohy. V žalúdku prostaglandíny inhibujú prostredníctvom G-proteínov sekréciu HCl. Súčasne podporujú tvorbu hlienu chrániaceho žalúdočnú sliznicu pred kyselinou. Prostaglandíny tiež zasahujú do metabolizmu kostí a do činnosti sympatiku. V imunitnom systéme sú prostaglandíny dôležité pre priebeh zánětlivé reakce a tiež priťahujú leukocyty do miesta infekcie. Tiež na vzniku bolesti a horúčky sa eikosanoidy významne podieľajú. Trombaxany stimulujú agregáciu trombocytov a ďalšie reakcie súvisiace na zrážanie krvi. K inaktivácií eikosanoidov dochádza behom sekúnd až minút mechanizmami enzymatickej redukcie a dehydratácie hydroxylových skupín. Následkom rýchleho štiepenia je rozsah ich účinku veľmi obmedzený. PGH-syntáza sa vyskytuje v konstitutívnej form (tzv. COX-I) a vo forme indukovateľnej mediátormi zánětu (tzv- COX-II). Acetylsalicylát a ďalšie nesteroidné antiflogistika (NSA, nonsteroidal antiinflammatory drugs) tlmí aktivitu jednej alebo oboch PGH-syntáz a tým, aj syntézu väčšiny eikosanoidov. Tak je možné vysvetliť ich bolesť tíšiace, horúčku znižujúce a protireumatické účinky. Acetylsalicylát totiž ireverzibilne acetyluje serínový zvyšok v blízkosti aktívneho centra PGH-syntázy, čím uzavrie prístup pre substráty. Iné NSA pôsobia ako kompetitívne inhibítory. Tiež vedľajšie účinky NSA sú následkom potlačenia eikosanoidovej syntázy. Keď NSA napr. potlačujú zrážanie krvi, deje sa tak následkom zastavenia tvorby trombaxanov v trombocytoch. V žalúdku zvyšujú NSA sekréciu HCl a súčasne tlmi tvorbu ochranného hlienu. II/29. Biosyntéza cholesterolu a její regulace, úloha HMG-CoA reduktázy a SREBP proteinu. Cholesterol sa syntetizuje v podstate vo všetkých tkanivách, ale pečeň, črevá, kôra nadľadvín a reprodukčné orgány (vaječníky, varlata a placenta) prispievajú najviac do zásobárne cholesterolu. Podobne ako v prípade syntézy mastných kyselín, všetky uhlíkové atómy v cholesterole poskytuje acetát a NADPH poskytuje redukujúce ekvivalenty. Táto endergonická metabolická dráha je poháňaná hydrolýzou thioeserovej väzby v acetyl-CoA a hydrolýzou ATP. Syntéza cholesterolu vyžaduje enzýmatickú výbavu cytosolu a membrány hladkého endoplazmatického retikula. Táto metabolická dráha je zodpovedná za zmeny koncentrácie cholesterolu a preto existujú regulačné mechanizmy, ktoré regulujú rýchlosť syntézy cholesterolu v tele na základe rýchlosti vylučovania cholesterolu. Nerovnováha v tejto regulácií môže viesť k zvýšeniu koncentrácie cholesterolu v plazme a teda aj šancu rozvoja srdcovocievnych ochorení. Prvé dve reakcie syntézy cholesterolu sú podobné ako v prípade produkcie ketolátok a teda ich konečným produktom je 3-hydroxy- 3-metylglutaryl-CoA (HMG-CoA). Najprv z dvoch molekúl acetyl- CoA pôsobením thiolázy vznikne acetoacetyl-CoA. Následne sa pomocou HMG-CoA syntázy pridá ďalšia molekula acetyl-CoA, čím vznikne HMG-CoA, šesť uhlíkatá zlúčenina. Pečeňové bunky obsahujú dve izoenzýmy HMG-CoA syntázy. Cytozolový enzým sa zúčastňuje syntézy cholesterolu a mitochondriálna forma má význam pri produkcií ketolátok. Ďalší krok dráhy, redukcia HMG-CoA na mevalonát, je katalyzovaná HMG-CoA reduktázou a ide o hlavný regulačný krok celej syntetickej dráhy. Odohráva sa v cytozole, využíva dve molekuly NADPH ako redukčné činidlo a vylučuje sa pri ňom CoA, čo z neho robí ireverzibilný krok. HMG-CoA reduktáza je membránový proteín endoplazmatického retikula, ktorý má katalytickú doménu nasmerovanú do cytozolu. Ďalšie kroky metabolickej dráhy: (1) Mevalonát je premenený na 5- pyrofosfomevalonát v dvoch krokoch, pričom obe zahŕňajú presun fosfátovej skupiny z ATP. (2) Päťuhlíková izoprénová jednotka, izopentenyl pyrofosfát (IPP), vzniká dekarboxyláciou 5-pyrofosfomevalonátu. Táto reakcia vyžaduje ATP. (3) IPP je izomerovaný na 3,3-dimetylallyl pyrofosfát (DPP). (4) IPP a DPP kondenzujú za vzniku desaťuhlíkového geranyl pyrofosfátu (GPP). (5) Ďalšia molekula IPP sa následne kondenzuje s GPP za vzniku 15-uhlíkatého farnesyl pyrofosfátu (FPP). (6) Dve molekuly FPP spolu zreagujú za uvoľnenia pyrofosfátu. Následne redukciou vzniká 30-uhlíková zlúčenina skvalén. Skvalén vzniká zo 6 izoprenoidových jednotiek. Pretože 3 ATP sú potrebné na premenu mevalonátu na IPP, celkovo je potrebných 18 ATP na vznik skvalénu. (7) Skvalén je premenený na sterol lanosterol sledom reakcií, ktoré sú katalyzované enzýmami endoplazmatického retikula využívajúcimi molekulárny kyslík a NADPH. Hydroxylácia skvalénu stimuluje jeho zacyklenie na lanosterol. (8) Premena lanosterolu na cholesterol je viacstupňový proces, ktorého cieľ je skrátenie uhlíkového reťazca z 30 na 27 uhlíkov, odstránenie dvoch metylových skupín na uhlíku č.4, premiestnenie dvojitej väzby z uhlíku č.8 na uhlík č.5 a redukcia dvojitej väzby medzi uhlíkmi č. 24a 25. Táto metabolická dráha prebieha v endoplazmatickom retikule a zahŕňa viacero enzymatických reakcií. Smith-Lemli-Opitzov syndróm (SLOS) je relatívne časté autosomálne recesívna porucha syntézy cholesterolu, ktorá je spôsobená čiastočným nedostatkom 7-dehydrocholesterol-7-reduktázy – enzýmu zapojeného do premiestnenie dvojitej väzby. SLOS je jeden z viacerých multisystémových syndrómov spôsobujúcich malformáciu embrya a sú spojené s nedostatočnou syntézou cholesterolu. HMG-CoA reduktáza, kľúčový enzým dráhy, je hlavným regulačným bodom biosyntézy cholesterolu a podlieha rôznym regulačným mechanizmom. Expresia génu pre HMG-CoA reduktázu je kontrolovaná transkrpčným faktorom, SREBP-2 (sterol regulatory element-binding protein-2) , ktorý sa viaže na DNA v mieste cis-acting sterol regulatory element (SRE) reduktázového génu. SREBP je integrálny proteín membrány endoplazmatického retikula, ktorý asociuje s druhým membránovým proteínom ER – SCAP (SREBP cleavage-activating protein). Keď sa zníži hladina sterolov v bunke, komplex SREBP-SCAP opúšťa ER a prechádza do Golgiho aparátu. V Glogiho aparáte SREBP postupne podlieha účinku dvoch proteáz, čím vznikne rozpustný fragment, ktorý vstupuje do jadra, viaže sa na SRE a uplatňuje sa ako transkripčný faktor. Toto má za následok zvýšenú syntézu HMG-CoA reduktázy a následne aj zvýšenú syntézu cholesterolu. Ak je hladina streolov v bunke zvýšená, tak sa steroly naviažu na steroly-citlivú doménu SCAP a indukuju naviazanie SCAP na iné proteíny membrány ER. Toto má za následok pozastavenie vzniku komplexu SCAP-SREBP v ER, čím sa inaktivuje SREBP a teda sa inhibuje aj syntéza cholesterolu. Reduktáza sama o sebe je citlivá na hladinu sterolov. Ak stúpne hladina sterolov v bunke, tak sa reduktáza viaže na iné proteíny membrány ER. Väzba vedie k ubikvitinácií a proteázomovej degradácií reduktázy. Aktivita HMG-CoA reduktázy je kontrolovaná kovalentne aktivitou AMP-aktivovanej proteínkinázy (AMPK) a fosfoproteínovej fosfatázy. Fosforylovaná forma reduktázy je neaktívna a jej defosforylovaná forma je aktívna. AMPK je aktivovaná AMP a teda syntéza cholesterolu podobne ako syntéza mastných kyselín je závislá na hladine ATP (znižuje sa so zníženou hladinou ATP). Množstvo HMG-CoA reduktázy je kontrolované hormonálne. Zvýšené množstvá inzulínu a tyroxínu zvyšujú expresiu génu pre reduktázu, glukagón a glukokortikoidy majú opačný efekt. Statínové lieky (napr. atorvastatin, fluvastain, lovastatin, pravastatin, etc.) sú štrukturálne analogické k HMG-CoA a sú teda kompetitívnymi inhibítormi HMG-CoA reduktázy. Používajú sa na zníženie hladiny cholesterolu u pacientov s hypercholesterolemiou. II/30. Přeměna a vylučování cholesterolu, biosyntéza žlučových kyselin a její regulace. Cholesterolový kruh sa u človeka nedokáže degradovať až na CO 2 a H 2 O. Namiesto toho je sterolové jadro vylučované z tela premenou na žlčové kyseliny, ktoré sú odstraňované stolicou. Taktiež je cholesterol vylučovaný do žlče, ktorá je transportovaná do čreva na elimináciu. Určité množstvo cholesterolu v čreve je pred vylúčením upravené baktériami. Hlavnými produktami tejto premeny sú coprostanol a cholestanol, redukované deriváty cholesterolu. Dokopy s cholesterolom tvoria skupinu neutrálnych fekálnych sterolov. Žlč je tekutá zmes organických a anorganických zlúčenín. Fosfatidylcholín a žlčové soli (konjugované žlčové kyseliny) sú kvantitatívne najdôležitejšie organické látky v žlči. Žlč môže buď priamo prechádzať z pečene, kde je syntetizovaná, do duodena cez ductus biliaris communis, alebo môže byť uskladnená v žlčníku, keď nie je momentálne potrebná na trávenie. Žlčové kyseliny obsahujú 24 uhlíkov, 2 až 3 hydroxylové skupiny a bočný reťazec, na ktorého konci sa nachádza karboxylová skupina. Za fyziologického pH je karboxylová skupina úplne ionizovaná, preto sa nazývajú „žlčovými kyselinami“. Žlčové kyseliny sú amfipatické, lebo ich hydroxlové skupiny sú α-orientované (ležia „pod“ rovinou kruhu) a metylové skupiny sú β-orientované (ležia „nad“ rovinou kruhu). Preto majú tieto molekuly polárnu aj nepolárnu časť a teda môžu sa správať ako emulgátory v čreve, čím napomáhajú pripravujú triacylglyceroly a iné komplexné tuky na trávenie pomocou pankreatických enzýmov. Žlčové kyseliny sa syntetizujú v pečeni vo viacstupňovej, multiorganelovej metabolickej dráhe. Počas tohto procesu sa na špecifické miesta steroidovej kostry pridávajú hydroxylové skupiny, dvojitá väzba na B-kruhu cholesterolu sa redukuje a uhľovodíkový bočný reťazec sa skracuje o tri uhlíky a na jeho koniec sa pridáva karboxylová skupina. Najčastejšie vznikajú touto reakciou kyselina cholová (triol) a kyselina chenodeoxycholová (diol) sú označované ako „primárne“ žlčové kyseliny. Kľúčovým krokom tejto syntézy je naviazanie hydroxylovej skupiny na uhlík č.7 steroidového jadra, pomocou cholesterol-7-α-hydroxylázy, ide o ER-associovaný cytochróm P450 enzým, ktorý sa nachádza iba v pečeni. Tento enzým je regulovaný koncentráciou kyseliny cholovej. Predtým ako sú žlčové kyseliny vylúčené z pečene, naviaže sa na ne molekula glycínu alebo taurínu pomocou amidovej väzby medzi karboxylovou skupinou žlčovej kyseliny a aminoskupinou pridanej látky. Medzi tieto nové vzniknuté látky patrí patrí kyselina glykocholová, kyselina glykochenodeoxycholová, kyselina taurocholová a kyselina taurochenodeoxycholová. Pomer medzi glycínovou a taurínovou formou v žlči je asi 3:1. Pridanie glycínu alebo taurínu spôsobí, že vznikne v molekule karboxylová skupina s nižším pK a (v prípade glycínu) alebo sulfonátová skupina (z taurínu), pričom obe sú úplne ionizované a nesú negatívny náboj pri fyziologickom pH; preto sa tieto zlúčeniny nazývajú žlčové soli. Žlčové soli sú silnejšími detergentami než žlčové kyseliny, vďaka svojmu zosilnenému amfipatickému charakteru. Kvôli tomu iba konjugované formy žlčových kyslín, žlčové soli, sa nachádzajú v žlči. Jedinci s genetickou poruchou premeny cholesterolu na žlčové kysliny sa liečia exodénnym dodávaním kyseliny chenodeoxycholovej. Bakterie v čreve vedia odstraňovať glycín a taurín zo žlčových solí, čím sa regenerujú žlčové kyseliny. Dokážu tiež premeniť primárne žlčové kyseliny na „sekundárne“ žlčové kyseliny odstránením hydroxylovej skupiny. Vzniká tak kyselina deoxycholová z kyseliny cholovej alebo kyselina lithocholová z chenodeoxycholovej kyseliny. Žlčové soli vylučované do čreve sa efektívne reabsorbujú (viac ako 95%) a používajú znova. Pečeň premieňa primárne a sekundárne žlčové kyseliny na žlčové soli pripojením glycínu alebo taurínu a následne sú znova vylučované do žlče. Zmes žlčových kyselín a žlčových solí je absorbovaná hlavne v ileu pomocou Na + -žlčová soľ kotransporterom. Ďalej sú aktívne transportované z buniek črevnej mukózy do protálneho obehu, odkiaľ sú efektívne odoberané hepatocytmi pomocou izoformy kotransportéru. Keďže žlčové kyseliny majú hydrofóbny charakter, pre transport v portálnom obehu potrebujú prenášač. Albumín prenáša žlčové kyseliny vo forme nekovalentného komplexu, podobne ako prenáša aj mastné kyseliny. Nepretržitý proces sekrécie žlčových soli do žlče, ich prechod duodenom, kde sú premieňané na žlčové kyseliny, ich vstrebávanie v ileu a následný návrat do pečene ako zmes žlčových kyselín a ich solí sa nazýva eneterohepatická cirkulácia. 15-30 g žlčových solí je vylúčených pečeňou do duodena každý deň a iba asi 0,5g (menej ako 3%) je denne vylúčených z tela stolicou. Asi 0,5 g za deň je syntetizovaných z cholesterolu v pečeni, čím sa dopĺňajú stratené žlčové kyseliny. Sekvestranty žlčových kyselín, ako napr. cholestyramín, viažu žlčové kyseliny v čreve, čím ich chránia pre reasorbáciou a podporujú ich vylučovanie, Využívajú sa v liečbe hypercholesterolemie, lebo odstraňovanie žlčových kyselín uľahčuje syntézu žlčových kyselín a teda zapojenie nadbytočného cholesterolu do tejto dráhy. Vláknina taktiež viaže žlčové kyseliny a zvyšuje ich vylučovanie. Patobiochémia Pohyb cholesterolu z pečene do žlče musí byť sprevádzaný simultánnou sekréciou fosfolipidov a žlčových solí. Ak dôjde k narušeniu tohto procesu a viac cholesterolu vstupuje do žlče ako je možné rozpustiť pomocou prítomných žlčových solí a fosfatidylcholínu, môže sa cholesterol zrážať v žlčníku za vzniku žlčových kameňov (cholelitiázy). Táto porucha je spôsobená zníženým množstvom žlčových solí v žlči, v dôsledku: 1)vysokej malabsorpcie žlčových kyselín z čreva, napr. u pacientov s ťažkými chorobami ilea; 2)obštrukcie žlčových ciest, čím sa naruší enterohepatálnu cirkuláciu; 3)ťažkej hepatálne disfunkcie, čo vedie k zníženej syntéze žlčových solí alebo iných abnormalít žlčovej produkcie; alebo 4)zvýšenej spätnoväzobnej supresie syntézy žlčových kyselín v dôsledku zvýšenej recyklácie zlčových kyselín. Cholelitiáza môže tiež vznikať v dôsledku zvýšenej exkrécie cholesterolu v žlči, napr. pri užívaní fibrátov. Fibráty, napr. gemfibrozil, sú deriváty kyseliny fibrovej, ktoré sa požívajú na zníženie hladiny triacylglycerolov v krvi cez stimuláciu β-oxidácie. Laparoskopická cholecystektomia (vyoperovanie žlčníku) je najčastejšou liečbou. Avšak v prípade pacientov, čo nemôžu podstúpiť operáciu, sa používa ako alternatíva podávanie kyseliny chenodeoxycholovej per os na posilnenie zásoby žlčových kyselín v tele, čo postupne (v priebehu mesiacov až rokov) rozpustí žlčové kamene. II/31. Biosyntéza a degradace steroidních hormonů. Steroidné hormóny sú syntetizované z cholesterolu v steroidogenných žľazových bunkách a tvoria sa krok za krokom zo svojho základného skeletu cholestanu. Potrebný cholesterol pochádza z rôznych zdrojov. Buď je do žľazových buniek prijatý spoločne s lipoproteínmi LDL alebo je nimi syntetizovaný z acetyl-CoA. Prebytočný cholesterol sa ukladá vo forme esterov mastných kyselín a môže byť z nich hydrolýzou znovu metabolizovaný. Biosyntéza steroidných hormónov je stimulovaná glandotropnými hormónmi, ktoré prostredníctvom GPCR, G- proteínov, adenylátcyklázy a cAMP zapoja proteinkinázu A. PK- A aktivuje cholesterhydrolázu a proteín StAR (steroidogenic acute regulatory protein), s ktorých pomocou cholesterol prenikne do mitochondrií. Tento kľúčový transfer potom zaháji biosyntézu steroidných hormónov. Druh produkovaného hormónu pritom závisí na enzymatickej výbave žľazových buniek. Tak vznikajú v bunkách tvoriace steroidné hormóny steroidy, ktoré môžu patriť k jednej zo 6 rodín steroidných hormónov. Ide o gestageny (napr. progesteron), glukokortikoidy (napr. kortizol), mineraloortikoidy (napr. aldosteron), androgény (napr. testosteron), estrogény (napr. estradiol) a D-hormóny (napr. kalcitriol). Medzi zúčastnenými reakciami sa často vyskytujú hydroxylácie. Sú katalyzované špecifickými monoxygenázami („hydroxylázy“) z rodiny cytochromu P450 (otázka III/9). K ním sa radia hydratácie a dehydratácie spolu so štiepnymi a izomeračnými reakciami. Zvláštne postavenie medzi steroidnými hormónmi zaujímajú estrogény, ktoré ako jediné obsahujú aromatický kruh A. Táto štruktúra je odvodená od „aromatázy“. Prvým dôležitým medziproduktom biosyntézy väčšiny steroidných hormónov je pregnenolon (C 21 ). Tvorí sa z cholesterolu dvomi hydroxyláciami a oxidatívnym štiepením postranného reťazca. Nasledujúca dehydratácia hydroxylovej skupiny na C-3a premiestnenie dvojitej väzby z C-5 na C-4 vytvorí progesteron (C 21 ). S výnimkou kalcitriolu sú všetky steroidné hormóny odvodené od pregnolonu alebo progesteronu. Tak smerujú tri hydroxylácie na progesteronových C-atómoch 17, 21 a 11 ku kortizolu (C 21 ). Pri syntéza aldosteronu (C 21 ) je hydroxylácia na C-17 nahradená oxidáciou angulárnej metylovej skupiny (C-18) na aldehydovú skupinu. Pri syntéze estosterónu (C 19 ) z progesteronu dochádza k úplnému oxidatívnemu odstráneniu bočného reťazca. Spomínaná aromatizácia kruhu A premení testosteron konečne na estradiol (C 18 ). Biosyntéza kalcitriolu (C 27 ; hormón vitamínu D) sa uberá inou cestou. Najprv je do cholesterolového kruhu B zavedená ďalšia dvojitá väzba. Vplyvom UV- žiarenia v koži dôjde k fotochemickému otvoreniu kruhu B a vznikne sekosteroid cholekalciferol (vitamín D). Dve hydroxylácie závislé na Cyt P450 na C-25 v pečeni a na C-1v ľadvinách poskytnú konečne aktívny hormón vitamínu D. V krvi existujú transportné proteíny pre steroidné hormóny. Všetky sa môžu relatívne nešpecificky viazať na albumín. Špecifická je však väzba testosteronu a estradiolu na SHBG (sex hormone binding protein), progesteronu a kortizolu na transkortin a D- hormónov na proteín viažuci vitamín D. K inaktivácií steroidných hormónov dochádza najčastejšie v pečeni. Stáva sa tak pôsobením enzymatických systémov biotransformácie (otázka III/9). Medzi najčastejšie reakcie patrí hydroxylácia, oxidácia skupín OH a redukcia oxoskupín. V závere sú steroidné metabolity pred vylúčením ešte konjugované s kyselinou glukurónovou alebo sulfátom. Kombináciou viacerých inaktivačných reakcií vzniká množstvo steroidných metabolitov, ktoré sú vylučované v moči a čiastočne aj v žlči. Dôkaz steroidov a ich metabolitov v moči sa využíva pri vyšetrení hormonálneho metabolizmu. II/32. Transport lipidů, úlohy lipoproteinů, struktura lipoproteinové částice. Elektroforéza lipoproteinů. Väčšina lipidov sa vo vode zle rozpúšťa, niektoré však majú tiež amfipatické vlastnosti, teda rozpúšťajú sa vo vode aj v tukoch. V krvi by sa hydrofóbne triacylglyceroly vyzrážali do kvapiek, ktoré by spôsobili tukovú embóliu. Naopak amfipatické lipidy by sa uložili do membrány krviniek a rozpustili by ju. Transport lipidov v krvi preto vyžaduje zvláštne riešenie. Mastné kyseliny s dlhými reťazcami (C 12 -C 20 ) sú v krvi transportované naviazané na albumín. Naopak kyseliny so stredne dlhým (C 8 -C 10 ) a krátkym reťazcom (C 4 -C 6 ) sú vďakasvojej väčšej hydrofilnosti voľne rozpustené v krvi. Tuky, fosfolipidy, cholesterol a jeho estery a tiež lipofilné vitamíny sú transportované vo forme vo vode rozpustných lipoproteínových komplexov, ktoré sa v krvnej plazme vyskytujú v niekoľkých druhoch s rozdielnou veľkosťou a zložením. Lipoproteíny sú guľaté alebo terčovité agreáty tvorené lipidmi a proteínmi, tzv. apoproteíny (apo). Lipoproteíny sa skladajú z jadra tvoreného nepolárnymi lipidmi (prevažne triacylglycerolmi a estermi cholesterolu), obaleného asi 2 nm silným jednovrstvým obalom z amfipatických lipidov (fosfolipidov a cholesterolu). Obal, v ktorom sa nachádzajú aj apoproteíny, poskytuje povrchu partikulí polárne vlastnosti, a tým im bráni v agregácií na väčšie častice. Čím väčšia je lipidové jadro lipoproteínu, tzn. Čím viac nepolárnych lipidov obsahuje, tým menšia je jeho hustota. Lipoproteíny sa väčšinou delia so piatich tried. V poradí podľa zmenšujúcej sa veľkosti a zvyšujúcej sa hustoty rozoznávame chylomikrony, chylomikronove zvyšky, VLDL (very low density lipoproteins), IDL (intermediate density lipoproteins), LDL (low density lipoproteins) a HDL (high density lipoproteins). Podiel apoproteínov sa pohybuje medzi 1% u chylomikronov až po 50% u HDL. Apoproteíny neovplyvňujú len rozpustnosť, ale pôsobia aj ako rozpoznávacie molekuly pre membránové receptory cieľových buniek a ako aktivátory enzýmov či proteínov podieľajúcich sa na metabolizme a výmene lipidov. Jednotlivé triedy lipoproteínov sa nelíšia len svojim zložením, ale aj spôsobom svojho vzniku a účinku. Chylomikrony sa tvoria v črevnej mukóze a dostávajú sa mimo jadro prostredníctvom lymfy priamo do krvi. Obstarávajú transport tukov z potravy z čreva do tkanív. Ich charakteristickým apoproteínom je apo-48. V krvi stimuluje HDL uvoľnenie chylomikronov prenosom z apo E a apo C-II. Deje sa to predovšetkým v svalovom a tukovom tkanive. K tomu aktivuje chylomikronový apo C-II lipoproteinovú lipázu nachádzajúcu sa na povrchu cievneho endotelu. Tento enzýme štiepi väčšinu triacylglycerolov. Uvoľnené mastné kyseliny sú lokálne prijímané bunkami a glycerol je transportovaný do pečene. Následkom uvoľnenia svojich lipidov sa chylomikrony postupne odbúravajú na chylomikronové zvyšky (remnants), ku ktorých odstráneniu z krvi slúžia pečeňové apo E-receptory. VLDL, IDL a LDL sú navzájom blízko príbuzne. VLDL vzniká v pečeni a slúži k transportu endogenne tvorených lipidov – triacylglycerolov, cholesterolu a fosfolipidov do extrahepatálnych tkanív. Pre VLDL je charakteristická prítomnosť apo B-100. Podobne ako chylomikrony sa aj VLDL vplyvom lipoproteínovej lipázy postupne degradujú na IDL a nakoniec na LDL. Taktiež je táto reakcia stimulovaná transferom rôznych apo proteínov. LDL obsahujú v porovnaná s VLDL a IDL výrazne vyšší podiel cholesterolu a jeho esterov. Bunky spotrebovávajúce cholesterol LDL viažu a prijímajú kompletné častice pomocou receptorov sprostredkovanej endocytózy, zvyšky potom zlikviduje pečeň. Elektroforéza delí lipoproteíny v elektrickom poli podľa rozdielnej veľkosti povrchového náboja, ktorý je u nich podmienený množstvom bielkoviny v jednotlivých frakciách. Využíva sa to predovšetkým na dôkaz niektorých abnormálnych lipoproteínov a pri diagnostike menej častých typov hyperlipoproteinémií a pre detekciu atergoénneho lipoproteínu Lp(a). Najrýchlejšie v oblasti α sa pohybujú najmenšie častice s najvyšším obsahom proteínov α-lipoproteíny (HDL). Na úrovni medzi α-2 a β ako pre-β-lipoproteíny migrujú VLDL častice. LDL častice predstavujú väčšinou najvýraznejšiu frakciu ako β-lipoproteíny v oblasti β-globulínov. Chylomikróny, ak sú prítomné v sére, zostávajú na štarte, niekedy môžu vytvárať samostatný pruh, ktorý je viditeľný v oblasti od miesta štartu až k α oblasti. V polohe medzi α a β- lipoproteínmi (HDL a LDL) sa môže objaviť ďalšia frakcia charakteristická pre lipoproteín (a) – Lp(a), ktorý predstavuje rizikový faktor pre vznik aterosklerózy a kardiovaskulárnych ochorení. Postup elektroforézy sérových lipoproteínov je podobný ako v prípade elektroforézy plazmatických bielkovín s tým rozdielom, že k farbeniu sa používajú lipofilné farbiva, ako napr. Sudanová čerň. Elektroforéza lipoproteínov sa väčšinou robí na agarózovom géle, ktorý umožňuje dobré oddelenie pre-β- lipoproteínov. Elektroforeogram je možné hodnotiť denzitometricky pri vlnovej dĺžke 580 nm. Výsledok sa vyjadruje v percentách optickej hustoty pre jednotlivé frakcie vzhľadom k celkovej farebnej ploche. Stanovené hodnoty spolu s ďalšími ukazateľmi (celkový cholesterol, triacylglyceroly) slúžia k charakteristike hyperlipoproteinémií. V praxi sa využíva tiež vizuálne hodnotenie. Biologický nález sa porovnáva s refernčnými hodnotami a výsledok sa pozoruje v zmysle zvýšenia lebo zníženia jednotlivých frakcií. II/33. Transport endogenního a exogenního cholesterolu (vznik, přeměna a úloha chylomiker, VLDL, LDL a HDL lipoproteinů). Chylomikrony vznikajú v bunkách črevnej sliznice a prenášajú potravou prijaté triacylglyceroly, cholesterol, lipofilné vitamíny a estery cholesterolu (a iné lipidy) do periférnych tkanív. Apolipoproteín B-48 je charakteristický pre chylomikrony. Jeho syntéza začína v drsnom endoplazmatickom retikule; glykoziluje sa a prestupuje cez RER a Golgiho aparát. ApoB-48 získal svoj názov pretože iba 48% proteínu je syntetizovaného génom apo B. Apo B-100, ktorý sa syntetizuje v pečeni a nachádza sa vo VLDL a LDL, je celý kódovaný génom apo B. Pottranskripčná úprava cytozínu a uracilu v črevnom apo B-100 mRNA vytvára nonsence kodón, čo spôsobí, že sa prekladá iba 48% mRNA. Enzýmy umožňujúce syntézu TAG, cholesterolu a fosfolipidov sa nachádzajú na hladkom ER. Zloženie apoproteínov a lipidov do chylomikronových častíc vyžaduje mikrozomálny triacylglycerol transferový proteín (MTP), ktorý spája apo B-48 s lipidmi. Tento dej nastáva pred presunom z ER do Golgiho aparátu, kde sú častice zbaľované do sekrečných vezikúl. Tieto vezikuly sa spoja s plazmatickou membránou za uvoľnenia lipoproteínu, ktorý potom vstupuje do lymfatického systému a nakoniec do krvi. Častice uvoľnené črevnou sliznicou sa nazývajú „rodiace sa“ chylomikróny, lebo ich funkcia nie je úplná. Keď vstúpi do plazmy, častice sa rýchlo modifikujú tým, že príjmu apolipoproteín E (ktorý rozpoznávajú pečeňové receptory) a C. Apo C-II je nevyhnutné pre aktiváciu lipoproteínovej lipázy, enzýmu, ktorý degraduje TAG obsiahnuté v chylomikrónoch. Zdrojom týchto apolipoprotínov je plazmatické HDL. Lipoproteínová lipáza je extraclulárny enzým, ktorý je ukotvený heparansulfátom na stene kapilárnej steny vo väčšine tkanív, ale hlavne v tukovom tkanive, myokarde a svalovom tkanive. V pečeni dospelého človeka sa tento enzým nevyskytuje. Hepatálna lipáza sa nachádza na povrchu endotelových buniek pečene a hraje úlohu v degradácii TAG v chylomikrónoch a VLDL a tiež je významná v metabolize HDL. Lipoproteínová lipáza, aktivovaná pomocou apo C-II v cirkulujúcich lipoproteínových časticiach, hydrolyzuje TAG v týchto časticiach na voľné mastné kyseliny a glycerol. Mastné kyseliny sa ukladajú v adipocytoch alebo sa štiepia za vzniku energie, napr. v svaloch. Ak nie sú hneď prijaté bunkou, mastné kyseliny s dlhým reťazcom sa transportujú naviazané na sérovom albumíne dokým nie sú prijaté bunkou. Glycerol sa využíva pečeňou, napr. na syntézu lipidov, glykolýzu alebo glukoneogenézu. Pacienti s poruchou lipoproteínovej lipázy alebo apo C-II (Hyperlipoproteinémia typu 1 alebo familiárna deficiencia lipoproteínovej lipázy) vykazujú dramaticky zvýšené hladiny (1000 mg/dl alebo viac) chylomikrónov k plazme (hypertriacylglycerolemia) aj v období hladu. Syntéza a transport lipoproteinovej lipázy do lumen kapiláry je stimulovaný inzulínom. Izoméry lipoproteinovej lipázy majú rozdielne K m pre TAG. Napr. enzýmy adipocytov majú vysoké K m , čo umožňuje uvoľnenie mastných kyselín z plazmatických lipoproteínov a ich uskladnenie, iba keď sú hladiny lipoproteínov v plazme zvýšené. Naopak liproteínová lipáza myokardu majú malé K m , čo umožňuje uvoľnenie mastných kyselín z lipoproteínov v plazme aj pri malých koncentráciach. Najväčšia koncentrácia lipoproteínovej lipázy je v myokarde, čo odráža fakt, že mastné kyseliny sú hlavným zdrojom energie pre srdce. Počas toho, ako chylomikrón ciruluje v obehu a viac ako 90% z TAG v jeho jadre sa degraduje lipoproteinovou lipázu, častica sa zmenšuje a zvyšuje sa jej hustota. Okrem toho sú C apoproteíny navrátené do HDL. Takáto častica sa nazýva „pozostatok“ („remnant“) a sú rýchlo z obehu odstraňované pečeňou, ktorej membrány obsahujú receptory pre apo E. Pozostatky chylomikier sa viažu na tieto receptory, ktoré sú následne endocytózou zavzaté do hepatocytu. Endocytované častice sa v bunke spájajú s lyzozómami a lypoproteíny, estery cholesterolu a ďalšie zlúčeniny sa hydrolyticky štiepia za vzniku aminokyselín, voľného cholesterolu a mastných kyslín. Receptor sa recykluje. VLDL lipoproteíny vznikajú v pečeni. Skladajú sa hlavne z endogénnych TAG (cca 60%) a ich funkciou je transport lipidov z pečene do periférnych tkanív. V tkanivách je TAG degradované pomocou lipoproteínovej lipázy podobne ako v prípade chylomikier. „Tučná pečeň“ (hepatická steatóza) nastáva pri nerovnováhe medzi produkciou TAG v pečeni a sekréciou VLDL. Tento stav nastáva napr. pri obezite, nekontrolovanom diabete alebo chronickom užívaní alkoholu. VLDL sú vylučované pečeňou priamo do krvi ako nezrelé VLDL častice obsahujúce apo B-100. V krvi musia získať apo C-II a apo E os HDL. Podobne ako v prípade chylomikier, aj VLDL využíva apo C-II na aktiváciu lipoproteínovej lipázy. Abetalipoproteinemia je vzácna hyperlipoproeinémia spôsobená poruchou v mikrozomálnom TAG transferovom proteíne (MTP), čo vedie k neschopnosti spojiť apo B s lipidmi. Ako následok nevznikajú žiadne VLDL ani chylomikróny a TAG akumuluje v pečeni a čreve. Pritom ako VLDL putuje v obehu sú TAG degradované pomocou lipoproteínovej lipázym čo spôsobuje zmenšenie veľkosti a zvýšenie hustoty častice VLDL. Povrchové súčasti, ako sú C a E apoproteíny, sú vrátené HDL časticiam, pričom si častica zachováva apo B-100. Nakoniec je tiež určité množstvo TAG premiestnené z VLDL na HDL v reakcii, pri ktorej sa tiež vymení určité množstvo esterov cholesterolu z HDL na VLDL. Výmenu umožňuje cholesteryl ester transfer protein (CETP). Týmito modifikáciami je VLDL premenený na LDL. Počas tejto premeny existuje aj medziprodukt intermediate-density lipoproteins (IDL). IDL častice môžu byť tiež endocytované do bunky pomocou apo E receptorov ako ligand receptorov. LDL častice obsahujú o veľa menej TAG ako ich VLDL prekurzory a obsahujú viac cholesterolu a cholesterolových esterov. Hlavná funkcia LDL je transport cholesterolu do periférnych tkanív (alebo naspäť do pečene). Viažu sa na membránové LDL receptory, ktoré rozpoznávajú apo B-100 (ale nie apo B-48). Pretože tieto LDL receptory môžu viazať aj apo E, sú známe ako apo B-100/apo E receptory. Mechanizmus príjmu LDL do bunky prebieha v nasledovných krokoch: 1. LDL receptory sú negatívne nabité glykoproteíny, ktoré sa zoskupujú v jamkách na membráne. Cytozolová strana jamky je obalená proteínom clathrinom, čo stabilizuje tvar jamky. 2. Po naviazaní LDL sa receptorový komplex endocytózou dostane do bunky. 3. Vzniknutý váčok s LDL stráca clathrinový obal a spája sa s inými podobnými váčkami, čím vznikajú väčšie vezikuly, nazývané endozómy. 4. V vnútri endozómu sa znižuje pH (kvôli aktivite endozomálnej protónovej ATPázy), čo umožňuje oddelenie LDL od receptoru. Receptory potom migrujú na jednu stranu endozomu, pričom LDL častice ostávajú v lumen vačku. 5. Receptory môžu byť recyklované, pričom lipoproteínové častice vo vačku sú predané do lyzozómov a degradované pomocou lyzozomálnych kyslých hydroláz, čím sa uvoľňuje cholesterol, aminokyseliny, mastné kyseliny a fosfolipidy. Tieto zlúčeniny sú reutilizované bunkou. Cholesterol z chylomikier, IDL a LDL ovplyvňuje hladinu intracelulárneho cholesterolu viacerými spôsobmi. Najprv, HMG-CoA reduktáza je inhibovaná pomocou zvýšeného cholesteroli, čím sa znižuje syntéza cholesterolu de novo. Za druhé, syntéza nových LDL receptorov sa reguláciou expresie LDL receptorového génu znižuje a obmedzuje tak vstup LDL cholesterolu do bunky. Za tretie, ak nie je cholesterol momentálne vyžadovaný pre štruktúrne alebo syntetické účely, esterifikuje sa pomocou acyl-CoA:cholesterol acyltransferázy(ACAT). ACAT prenáša mastné kyseliny z acyl-CoA na cholesterol za vzniku esterov cholesterolu, ktoré môžu byť uskladnené v bunke. Aktivita ACAT je zvýšená pri zvýšenej intracelulárnej hladine cholesterolu. HDL predstavuje heterogénnu rodinu lipoproteínov s komplexným metabolizmom, o ktorom sa ešte veľa vecí nevie. HDL častice vznikajú v krvi pridaním lipidov k apo A-1, apolipoproteínom vznikajúcim v pečeni a čreve a sú vylúčené do krvi. Apo-A1 predstavuje 70% apoproteínov v HDL. HDL má viacero funkcii. HDL predstavuje zásobáreň apo C-II (prenášané na VLDL a chylomikrony; tiež aktivuje lipoproteínovú lipázu) a apo E (apolipoproteín potrebný pre exocytózu IDL a chylomikier). Nezrelé HDL majú diskovitý tvar a obsahuje hlavne fosfolipidy (najmä fosfatidylcholín) a apolipoproteíny A, C a E. Prenášajú cholesterol z periférnych tkanív a vracajú ho do pečene. HDL sú výbornými akceptormi neesterifikovaného cholesterolu v dôsledku vyššej koncentrácie fosfolipidov, ktoré dokážu rozpúšťať cholesterol. Keď je cholesterol prijatý do HDL, je okamžite esterifikovaný plazmatickým enzýmom lecitín:cholesterol acyltransferázou (LCAT). Tento enzým je syntetizovaný v pečeni. LCAT sa viaže na nezrelé HDL a je aktivovaný pomocou apo A-I. LCAT prenáša mastné kyseliny z C2 fosfatidylcholínu na cholesterol. Takto vzniká hydrofóbny cholesteryl ester, ktorý je uložený v jadre HDL a lysofosfatidylcholín, ktorý sa viaže na albumín. Pri tom, ako diskoidné nezrelé HDL zbiera estery cholesterolu, premieňa sa najprv na sférické HDL3, s relatívne malým obsahom cholesterolových esterov a následne na na cholesterol bohaté HDL2, ktoré prenáša tieto estery do pečene. Cholesterol ester transfer protein (CETP) prenáša estery cholesterolu z HDL na VLDL v zámene za TAG, čím odstraňuje inhibítor LCAT. Pretože VLDL je katabolizovaný na LDL, estery cholesterolu sú následne vychytávané pečeňou. Selektívny prenos cholesterolu z periférnych tkanív do HDL a z HDL do pečene pre syntézu žlčových kyselín alebo vylúčenie žlčov a pre syntézu steroidných hormónov, je kľúčovým komponentom cholesterolovej homeostázy. Z časti je to základ pre obrátený vzťah pozorovaný medzi koncentráciu HDL v plazme a ateroskleorózou (HDL sa označuje ako „dobrý“ prenášač cholesterolu). Obrátený transport zahŕňa výdaj cholesterolu z periférnych tkanív do HDL, esterifikáciu cholesterolu pomocou LCAT, väzbu na cholesterol bohatého HDL2 na pečeň a steroidogénne bunky a uvoľnenie lipid-dependentného HDL (HDL3). Uvoľnenie cholesterolu z periférnych tkanív je riadený aspoň z časti transportným proteínom ABCA1. Príjem esterov cholesterolu pečeňou je usmerňovaný membránovým receptorom SR-B1 (scavenger receptor class B typu 1), ktorý viaže HDL. Nie je úplne jasné, či je prijatá celá HDL častica, cholesterol je uvoľnený a na lipidy chudobná častica sa vracia do obehu alebo je selektívne prijímaný iba cholesterol samotný. II/34. Biosyntéza tetrapyrrolů – hemu a její poruchy. Hem, tetrapyrolové farbivo obsahujúce železo, je súčasťou bielkovín, ktoré viažu O 2 a koenzým niektorých oxidoreduktáz. Biosyntéza hemu môže prebiehať vo všetkých bunkách, významná je predovšetkým v kostnej dreni (asi 85% celkovej syntézy hemu). Menšia časť sa tvorí v pečeni. Syntéza hemu prebieha v mitochondriách a v cytoplazme. Výstavba tetrapyrolového kruhu začína v mitochondriách. (1) Zo sukcinyl-CoA, medziproduktu citrátového cyklu, vzniká kondenzáciou s glycínom a následnou dekarboxyláciou 5- aminolevulonát (ALA). Reakciu katalyzuje ALA-syntáza, ktorá je súčasne kľúčovým enzýmom celej dráhy. Jej tvorba je reprimovaná koncovým produktom, hemom, ktorý súčasne pôsobí aj ako inhibítor už prítomného enzým. Ide o typický príklad spätnoväzobnej inhibície produkom. (2) 5-aminolevulonát opúšťa mitochondrie. V cytoplazme kondenzujú dve jeho malé molekuly na porfobilinogén, ktorý už obsahuje pyrolový kruh. Porfobilinogénsyntázu inhibujú ióny olova. Pri otrave olovom preto nachádzame v krvi aj moči zvýšené hladiny ALA. (3) V ďalších krokoch syntézy vzniká tetrapyrolová štruktúra charakteristická pre porfyríny. Za odštiepenie skupín –NH 2 sa spájajú 4 molekuly profobilinogénu a vzniká uroporfyrinogén III. Reakciu katalyzuje hydroxymetylbilansyntáza. (4) Pre tvorbu tohto medziproduktu je potrebný ďalší enzým, uroporfyrinogén-III-syntáza. Pri jeho nedostatku vzniká „chybný“ izomér, uroporfyrinogén I. Tetrapyrol uroporfyrínogén III sa od hemu príliš nelíši – chýba centrálny atóm železa a kruh obsahuje len 8 z 11 dvojitých väzieb. Okrem toho sú na cyklus naviazané iba nabité bočné reťazce R (4acetátové a 4 propionátové zvyšky). Hemové skupiny sa vyskytujú v nepolárnom prostredí vo vnútri bielkovín, polárne skupiny je preto treba z väčšej časti nahradiť menej polárnymi. (5) Najprv sa dekarboxylujú štyri acetátové zvyšky (R 1 ) na metylové skupiny. Vznikajúci koproporfyrinogén III opäť vstupuje do mitochondrií. Ďalšie kroky katalyzujú enzýmy lokalizované na alebo vo vnútornej membráne mitochondrií. (6) Dve propionítové skupiny (R 2 ) sa premenia na vinylové pomocou oxidázy. Tým sú hotové modifikácie bočných reťazcov, vzniknutá zlúčenina je protoporfyrínogén IX. (7) Nasledujúcim krokom je vytvorenie konjugovaného systému π- elektrónov ďalšou oxidáciou, Vzniká tak protoporfyrín IX. (8) Nakoniec sa na kruh naviaže dvojmocné železo. Aj k tomu dôjde účinkom špeciálneho enzýmu, ferochelatázy. Takto vytvorený hem alebo Fe-protoporfyrín IX je súčasťou napr. hemoglobínu alebo myoglobínu, na ktorý je naviazaný nekovalentne. Vyskytuje sa tiež v rôznych oxidoreduktázach. Patobiochémia Následky porúch syntézy hemu sa líšia na základe spätnej väzby – podľa toho, či je znížená premena substrátu δ-ALA-syntázy alebo niektorej z nasledujúcich enzymatických reakcií. V prvom prípade môže nedostatok hemu totiž len nedostatočne zvýšiť aktivitu defektnej ALA-syntázy, takže sa vyvinie sideroblastická anémia. Pri defektoch enzýmov následných reakcií dochádza vplyvom intaktnej negatívnej spätnej väzby k enormne zmnoženému množstvu ALA (odbrzdenie ALA). Tým sa tiež zvýši koncentrácia substrátov všetkých nasledujúcich reakcií a tiež ich premena tak výrazne, že vznikne nedostatok hemu. Sú to vysoké koncentrácie medziproduktov, ktoré vyvolajú poruchy: primárne porfýrie. V závislosti na ich rozpustnosti vo vode alebo lipidoch sú medziprodukty vylučované buď v moči (ALA, pofrobilinogén, uroporfyrín) alebo cestou žlče do stolice (koproporfyriny, protoporfyrin). Porfyriny sa tvoria z práve sa vyskytujúcich porfyrinogénov; ich vylučované množstvo je dôležité pre diagnostiku. Koncentrácia ALA sa zvyšuje pri nedostatku ALA-dehydratáza (tiež PBG-syntáza) a tiež pri zníženej funkcii PBG-desaminázy, ktorá je príčinou akútnej intermitentnej porfýrie, pri ktorej je naviac aj zvýšená koncentrácia PBG. Následkom sú neuroviscerálne dysfunkcie (tachykardia, nevoľnosť, zvracanie, obstipacia) a nervové a psychické poruchy (obrny, krčové záchvaty, kóma, halucinácie). Príčinou toho by mohla byť kompenzácia medzi ALA a štrukturálne podobným neurotransmiterom GABA. V prípade kongenitálnej erytropoetickej porfýrie vzniká neenzymatickou cestou z hydroxymetylbilanu uroporfyrinogén I a z toho je enzymaticky tvorený koproporfyrinogén I, ktorý je ďalej nemetabolizovateľný a u kojencov farbí do červena najprv plienky a neskôr aj zuby. Ďalšími následkami sú kožné reakcie na svetlo a hemolitická anémia. Tiež v prípade (častej) porfyria cutanea tarda dochádzav dôsledku svetelnej absorpcie (predovšetkým λ=440 nm) porfyrínmi k poškodeniu kože (tvorba ťažko sa hojacich puchýřů), na ktorých sa podieľa tvorba O 2 -radikálov. Pri hereditárnej koproporfyrii, rovnako ako (v južnej Afrike veľmi častej) porfyria variegata sú zvýšené jak ALA a PBG, tak koproporfyriny, takže deti majú aj nervové a psychické, aj kožné znaky. Konečne pri protoporfyrii (zvýšenie protoporfyrínu) je v popredí fotosenzibilita s pálením, svrbením a bolesťami kože po expozícií UV žiarení. Získané porfýrie vznikajú pri otrave olovom (vysoké hladiny ALA a PBG) a tiež pri hepatobiliárnych ochoreniach, pri ktorých je znížené vylučovanie koproporfyrinu žlčou. II/35. Degradace tetrapyrrolů – hemu a její poruchy. Asi po 120 dňoch v obehu sú erytrocyty odchytávané a odbúravané retikuloendoteliálnym systémom, hlavne v pečeni a slezine. Približne 85% hemu určeného na degradáciu pochádza zo starých erytrocytov a 15% z obratu nezrelých erytrocytov a cytochrómov z neerythroidálnych buniek. Prvý krok degradácie hemu je katalyzovaný mikrosomálnym hem oxidázovým systémom retikuloendoterliálnych buniek. Za prítomnosti NADPH a O 2 pridáva enzým hydroxylovú skupinu na metenylový mostík medzi dvomi pyrrolovými jadrami, súčasne sa pritom oxiduje hemové železo na Fe 3+ . Druhá oxidácia rovnakým enzýmovým systémom vedie k rozštiepeniu porfyrínového cyklu. Vzniká tak zelený pigment biliverdín za súčasného uvoľnenia železa a CO (CO môže mať signálne účinky). Biliverdín sa následne redukuje na oranžový pigment bilirubín. Bilirubín a jeho deriváty sa súhrne nazývajú žlčové farbivá. Bilirubín, ktorý sa nachádza iba v organizmoch cicavcov, môže mať funkciu antioxidantu. Ako antioxidant je bilitubín oxidovaný na biliverdín anásledne redukovaný biliverdin reduktázou naspäť na bilirubín. Bilirubín je iba veľmi málo rozpustný v plazme a preto je transportovaný do pečene v nekovalentnej väzbe na albumín. Bilirubín následne po odviazaní z albumínu vstupuje do hepatocytu pomocou usnadnenej difúzie, kde sa naviaže na intracelulárny proteín, najmä na molekulu ligandínu. V hepatocyte sa rozpustnosť bilirubínu zvyšuje pridaním dvoch molekúl kyseliny glukurónovej (proces sa nazýva konjugácia). Reakcia je katalyzovaná pomocou mikrosomálnej bilirubín glukuronyltransferázy, ktorá využíva UDP-kyselinu glukurónovú ako zdroj glukuronátu. Rôzne stupne deficiencie tohto enzýmu spôsobia Crigler-Najjarov syndróm 1. alebo 2. typu alebo Gilbertov syndróm, pričom Crigler-Najjarov syndróm 1. typu má najhoršou poruchou tohto enzýmu. Bilirubín diglukuronát je hydrolyzovaný a redukovaný baktériami v čreve na bezfarebný urobilinogén. Väčšina urobilinogénu je oxidovaná črevnými baktériami na stercobilín, ktorá dodáva stolici charakteristickú hnedú farbu. Avšak, časť urobilinogénu je reabsorbovaná z čreva a vstupuje do portálneho obehu. Časť týchto urobilinogénových častíc je v enterohepatálnom obehu odoberaná pečeňou a následne znova vylúčená do žlče. Zvyšok urobilinogénu je transportovaný krvou do ľadvín, kde sa premieňa na žltý urobilín, ktorý je následne vylúčený močom. Urobilín dodáva moči typické žlté sfarbenie. Patobiochémia Ikterus (žltačka, žloutenka) sa prejavuje žltou farbou kože, nechtových lôžok a očného bielka, čo je spôsobené hromadením bilirubínu alebo zvýšenou hladinou bilirubínu v krvi. Aj keď nejde o ochorenie, ikterus býva prejavom nejakého ochorenia. Ikterus sa môže deliť na tri základne typy (hemolytický, hepatocelullárny a obštruktívny typ). Avšak z klinického hľadiska je ikterus často skôr komplexom týchto typov. Kumulácia bilirubínu môže vzniknúť defektom vo viac ako len jednom kroku jeho metabolizmu. Pečeň má kapacitu na konjugáciu a vylúčenie viac ako 3000 mg bilirubínu za deň, pričom normálna produkcia bilirubínu je len 300 mg/deň. Táto veľká kapacita dovoľuje pečeni reagovať na zvýšenie degradácie hemu s následným zvýšením konjugácie a vylučovaniu bilirubín diglukuronidátu. Avšak, masívna hemolýza (napr. u pacientov so srpkovitou anémiou, deficienciou pyruvátkinázy alebo glukóza-6-fosfátdehydrogenázy) môže spôsobiť zrýchlenú produkciu bilirubínu a nedostatočnú konjugáciu. Hladina nekonjugovaného bilirubínu sa v krvi zvyšuje, čo spôsobuje hemolytický ikterus, ktorý sa prejavuje zvýšenou hladinou urobilinogénu v moči. Poškodenie hepatocytov (napr. v dôsledku cirhózy alebo hepatitídy) spôsobuje zvýšenú hladinu nekongujovaného bilirubínu v krvi v dôsledku zníženej konjugácie. Urobilinogén je zvýšený v moči, lebo poškodenie pečene znižuje enterohepatálny obeh tejto zlúčeniny, čím umožňuje zvýšené vylučovanie do krvi a následne do moču. Moč tým pádom tmavne a stolica naopak sa stáva bledšou. Hladina AST a ALT (otázka III/8) je taktiež zvýšená. Takýto typ ikteru sa nazýva hepatocelulárny ikterus. Obštruktívny ikterus nie je spôsobený nadprodukciou bilirubínu alebo nedostatočnou konjugáciou, ale vzniká v dôsledku obštrukciou žlčovodu (extrahepatálna cholestáza). Ide napr. o prítomnosť tumoru alebo žlčových kameňov, ktoré upchajú žlčovod, čím zabraňuje prietok bilirubínu do čreva. Pacienti s obštruktívnym ikterom zažívajú bolesť v GIT, nevoľnosti a ich stolica má bledú farbu a moč po čase černie. Pečeň vylučuje nekonjugovaný bilirubín do krvi(hyperbilirubinemia). Táto látka je následne vylučovaná močom. Urobilinogén v moči sa však nevyskytuje. II/36. Metabolismus purinových nukleotidů, regulace, inhibitory, poruchy. Atómy purínového kruhu sú zložené zo zlúčenín, medzi ktoré patria aminokyseliny (kyselina asparágová, glycín a glutamín), CO 2 a N 10 -formyltetrahydrofolát. Purínový kruh vzniká hlavne v pečeni v slede reakcií, v ktorých sú atómy uhlíku a dusíku pridávané na už vzniknutý ribóza-5-fosfát, ktorý pochádza z pentózového cyklu. 5-fosforibozyl-1-pyrofosfát (PRPP) je „aktivovaná pentóza“, ktorá sa zúčastňuje syntézy a záchrannej dráhy purínov a pyrmidínov. Syntéza PRPP z ATP a ribózy-5-fosfátu je katalyzovaná PRPP syntázou (ribóza fosfát pyrofosfátkniáza). Tento X-viazaný enzým je aktivovaný anorganickým fosfátom a inhibovaný purínovým nukleotidom (spätnoväzobná inhibícia produktom). Cukorná zložka PRPP je ribóza a preto budú ribonukleotidy konečným produktom purínovej syntézy de novo. Aby vznikli deoxyribonukleotidy potrebné pre syntézu DNA, ribózová časť sa redukuje. Syntéza 5 ́-fosforibosylaminu z PRPP a glutamínu je ďalším krokom syntézy purínov. Amidová skupina glutamínu nahrádza pyrofosfátovú skupinu naviazanú na uhlík č.1 v PRPP. Enzým katalyzujúci reakciu, glutamí:fosfroribosylpyrofosfát amidotransferáza, je inhibovaná purínovými nukleotidmi AMP a GMP – koncovými produktmi tejto metabolickej dráhy. Reakciu aktivuje intracelulárna koncentrácia PRPP. Ďalších 9 krokov biosyntézy purínových nukleotidov vedie k vzniku inozín monofosfátu (IMP, v ktorom je bázou hypoxantín). Táto dráha vyžaduje ATP ako zdroj energie a 2 medzikroky vyžadujú N 10 -formyltetrahydrofolát. Určité syntetické inhibítory purínovej syntézy (napr. sulfoamidy) sú určené k inhibícii rastu rýchlo sa množiacich mikroorganizmov bez ovplyvňovania ľudských buniek. Iné inhibítory purínovej syntézy, ako analógy kyseliny listovej (napr. methotrexat), sa používajú farmakologicky na zástavu šírenia rakoviny, pomocou inhibície syntézy nukleotidov a teda DNA a RNA. Inhibítory ľudskej purínovej syntézy sú extrémne toxické pre rôzne tkanivá, hlavne pre vyvíjajúce štruktúry fétu alebo pre rýchlo množiace sa bunky, ako napr. v kostnej dreni, koži, GIT, imunitnom systéme alebo vlasových folikuloch. Kvôli tomu sa u ľudí užívajúcich protirakovinovú terapiu môžu prejaviť vedľajšie efekty ako je anémia, šupinatenie kože, poruchy trávenia, immunodeficiencie a stratu vlasov. Premena IMP na AMP alebo GMP predstavuje dvojkrokovú energeticky náročnú metabolickú dráhu. Syntéze AMP vyžaduje GTP ako zdroj energie a naopak syntéza GMP využíva ATP. Prvá reakcia každej dráhy je inhibovaná svojim koncovým produktom. Toto predstavuje mechanizmus nasmerovania premeny IMP na viac vyžadované nukleotidy. Ak sú AMP a GMP prítomné v dostatočných množstvách, je syntéza purínov de novo zastavená v aminotrasnferázovom kroku. Nukleozid difosfáty sú syntetizované z príslušných nukleozid monofosfátov pomocou špecifických nukleozid monofosfát kinázy. Tieto kinázy rozlišujú cukornú zložku nukleotidov. ATP je všeobecným zdrojom pridaných fosfátov, lebo nachádza sa v bunke vo vyšších koncentráciách ako iné nukleozid trifosfáty. Adenylát kináza je aktívna hlavne v pečeni a svalovine, kde sa predstavuje ATP významný zdroj energie. Funkcia tohto enzýmu je udržiavanie rovnováhy medzi AMP, ADP a ATP. Nukleozid difosfáty a trifosfáty sú navzájom premieňané nukleozid difosfát kinázou – enzýmom ktorý, na rozdiel od monofosfát kinázy, má širokú špecifickosť. Puríny uvoľnené normálnym rozpadom nukleových kyselín v bunkách alebo tie pochádzajúce v malých množstvách v potrave a nedegradujú sa, môžu byť premenené na nukleozid trifosfáty a využívané v tele. Tento proces sa označuje ako „záchranná alebo šetriaca dráha“ pre puríny. Na premene purínových báz na nukleotidy sa zúčastňujú 2 enzýmy: adenin fosforibozyltransferáza (APRT) a hypoxantín-guanín fosforibozyltransferáza (HGPRT). Obe enzýmy využívajú PRPP ako zdroj ribózy-5- fosfátovej skupiny. Uvoľnenie pyrofosfátu a jeho následná hydrolýza pyrofosfatázy robí tieto reakcie ireverzibilnými. Adenozín je jediným nukleozidom, ktorý podlieha záchrannej ceste. Následne sa fosforyluje na AMP pomocou adenozín kinázy. Lesch-Nyhan syndróm predstavuje poruchu záchrannej dráhy a je popísaný v časti patobiochémia nižšie. Všetky doposiaľ popísané nukleotidy obsahovali ribózu ako cukornú zložku (ribonukleotidy). Nukleotidy potrebné pre syntézu DNA sú však 2 ́-deoxyribonukleotidy, produkované z ribonukleozid difosfátov pomocou enzýmu ribonukleotid reduktázy počas S-fázy bunkového cyklu. Ribonukleotid reduktáza (ribonukleozid difosfát reduktáza) je zložená z dvoch neidentických dimérových podjednotiek, R1 a R2, a je špecifický pre redukciu purínových nukleozid difosfátov (ADP a GDP) a pyrimidínových nukleozid difosfátov, cytidín difosfátu (CDP) a uridín difosfátu (UDP) na ich deoxyformy (dADP, dGDP a dUDP). Donorom protónu potrebného pre redukciu 2 ́-hydroxylovej skupiny sú 2 sulfhydrylové skupiny enzýmu, ktoré počas redukcie vytvárajú disulfidové mostíky. Aby ribonukletid reduktáza mohla pokračovať v produkcii deoxyribonukleotidov, musí byť redukovaná disulfidová väzba vzniknutá počas vzniku 2 ́-deoxy uhlíku. Zdrojom redukčných ekvivalentov pre tento účel je thioredoxín – peptidový koenzým ribonukleotidreduktázy. Thioredoxín obsahuje 2 cysteínové zvyšky od seba oddelené pomocou 2 aminokyselín v peptidovom reťazci. Dve sulfhydrilové skupiny thioredoxínu dodávajú jeho vodíkové atómy ribonukleotid reduktázy, v procese vzniku disulfidického mostíku. Thioredoxín musí byť premenený späť do redukovanej formy, aby mohol pokračovať v jeho činnosti. Nevyhnutné redukčné koeficienty sú poskytnuté NADPH + H + a reakcia je katalyzovaná thioredoxín reduktázou. Ribonukleotid reduktáza je zodpovedná za udržiavanie vyváženého zásobenia deoxyribonukleotidov pre syntézu DNA. Aby sa to docielilo, musí byť regulácia enzýmu komplexná. Okrem aktívnych miest sú v regulácii enzýmu zahrnuté aj allosterické miesta. Naviazanie dATP na allostorické miesta enzýmu inhibuje jeho celkovú katalytickú aktivitu a teda zabraňuje redukciu nukleotid difosfátov. Týmto sa efektívne zabraňuje syntéze DNA a vysvetľuje sa tým toxicita zvýšených hladín dATP ako následok napr. nedostatku adenozín deaminázy. Naopak, naviazanie ATP na tieto miesta aktivuje enzým. Väzba nukleotid trifosfátov na substrát špecifické miesta enzýmu reguluje substrátovú špecifickosť, čo zvyšuje premenu rôznych druhov ribonukleotidov na deoxyribonukleotidy, ktoré sú dôležité na syntézu DNA. Napr. väzba deoxytymidín trifosfátu (dTTP) na substrát špecifické miesta spôsobuje konformačnú zmenu, ktorá umožňuje redukciu GDP na dGDP v katalytickom mieste. Degradácia nukleových kyselín z potravy sa odohráva v tenkom čreve, kde rodina pankreatických enzýmov hydrolyzuje nuklových kyselín na nukleotidy. V slizničných bunkách tenkého čreva, sú purínové nukleotidy postupne degradované na špecifickými enzýmami na nukleozidy a voľné bázy a následne až na kyselinu močovú ako koncový produkt tejto dráhy. Purínové nukleotidy zo syntézy de novo sa degradujú primárne v pečení. Voľné bázy z tejto degradácie podliehajú šetriacej ceste a sú transportované z pečene do periférnych tkanív. Ribonukleázy a deoxyribonukleázy, vylučované pankreásom hydrolyzujú DNA a RNA v potrave na oligonukleotidy. Oligonukleotidy sa ďalej hydrolyzujú pankreatickými fosfodiesterázami, čím vzniká zmes 3 ́- a 5 ́-mononukleotidov. V črevnej mukóze odstraňuje rodina nukleotidáz hydrolyticky fosfátové skupiny, čím sa uvoľňujú nukleozidy, ktoré sú ďalej degradované na voľné bázy. Purínové bázy zo stravy sa nevyužívajú na syntézu nukleových kyselín, ale na miesto toho sa premieňajú na kyselinu močovú v črevnej mukóze. Väčšina kyseliny močovej vstupuje do krvi a následne sa vylučuje močom. U ostatných cicavcov, okrem primátov premieňajú purínový kruh na allantoin pomocou urát oxidázy. Rekombinantná urát oxidáza môže mať potenciálne terapeutické účinky na znižovanie hladiny kyseliny močovej v krvi. Kyselina močová vzniká následnými reakciami: 1. Aminoskupina je odstránná z AMP za vzniku IMP pomocou AMP deaminázy alebo z adenozínu za vzniku inozínu (hypoxantín ribóza) pomocou adenozín deaminázy. 2. IMP a GMP sa premieňajú na ich nukleotidové formy – inozín a guanozín pomocou 5 ́-nukleotidázy. 3. Purín nukleozid fosforyláza premieňa inozín a guanozín na voľné purínové bázy, hypoxantín a guanín. Mutáza premieňa ribózu-1-fosfát na ribózu-5-fosfát. 4. Guanín sa deaminuje na xantín. 5. Hypoxantín sa oxiduje xantín oxidázou na xantín, ktorý sa následne oxiduje xantín oxidázou na kyselinu močovu, konečný produkt degradácie purínov u človeka. Kyselina močová sa vylučuje v moči. Patobiochémia Lesch-Nyhan syndróm je vzácna X-viazaná recesívna porucha spojená s prakticky úplnou deficienciou HGPRT. Táto deficiencia spôsobuje neschopnosť záchrannej cesty pre hypoxantín alebo guanín, v dôsledku čoho sa tvoria veľké množstvá kyseliny močovej, konečný produkt degradácie purínov. Okrem toho, neschopnosť záchrannej cesty spôsobuje zvýšenie hladiny PRPP a znížené hladiny IMP a GMP. V dôsledku toho má glutamín:fosforybozilfosfát aminotransferáza prebytok substrátu a znížené množstvo inhibítorov a preto je syntéza purínov de novo zvýšená. Kombinácia zníženej purínovej reutilizácie a zvýšená purínová syntéza spôsobuje zvýšenú degradáciu purínov a produkciu veľkého množstva kyseliny močovej, kvôli čomu predstavuje Lesch-Nyhan dedičný dôvod hyperurikémie. U pacientov s Lesch-Nyman syndrómom, hyperurikémia spôsobuje tvorbu kameňov z kyseliny močovej v ľadviních (urolithiasis) a ukladanie kryštálikov kyseliny močove v kĺboch (dnavá artritída) a mäkkých tkanivách. Okrem toho, syndróm je charakterizovaný motorickou dysfunkciou, kognitívnymi deficitmi a behaviorálnymi poruchami, medzi ktoré patrí sebapoškodzovanie (napr. okusovanie pier a prstov). Dna je porucha charakterizovaná vysokou hladinou kyseliny močovej v krvi (hyperurikémia), ako dôsledok buď nadprodukcie alebo nedostatočným vylučovaním kyseliny močovej. Hyperurikémia môže viesť k ukladaniu kryštálikov urátu sodného v kĺboch a zánětlivej reakcii na ne, čím vzniká najprv akútna a následne chronická dnavá artritída. Kryštalíky urátu sodného (tofi) sa môžu usádzať v mäkkých tkanivách a tam vyvolať chronickú tofickú dnu. Vznik kameňov z kyseliny močovej v ľadvinách (urolithiasis) sa môžu tiež vyskytnúť. Hyperurikémia je často asymptomatická a nevedie ku dne, ale dna je sprevádzaná hyperurikémiou. Definitívna diagnóza dny vyžaduje odber a vyšetrenia synoviálnej tekutiny z postihnutého kĺbu alebo postihnutého tkaniva za pomoci svetelnej mikroskopie pre potvrdenie prítomnosti kryštálikov kyseliny močovej. Veľká väčšina pacientov s hyperurikémiou vedúcou ku dne je tento stav spôsobený nedostatočným vylučovaním kyseliny močovej. Nedostatočné vylučovanie môže byť spôsobené za prvé neznámou dedičnou poruchou vylučovania a za druhé známymi chorobnými procesmi, ktoré ovplyvňujú vylučovanie kyseliny močovej ľadvinami (napr. pri laktátovej acidóze – laktát a kyselina močová majú rovnaký ľadvinový transportér, o ktorý navzájom súperia) a vonkajšími faktormi ako napr. užívanie liekov (napr. thiazidové diuretiká) alebo po otrave olovom (saturinínová dna). Menej častá príčina dny je hyperutikémia spôsobená nadprodukciou kyseliny močovej. Primárna hyperurikémia je vo väčšine prípadov idiopatická (z neznámych príčin). Avšak niekoľko identifikovaných mutácii v géne pre X-viazanú PRPP syntázu, ktoré spôsobujú zvýšené V max pre produkciu PRPP a nižšie K m pre ribózu 5-fosfát alebo zníženú citlivosť na purínové nukleotidy – allosterické inhibítory. V každom prípade, zvýšená koncentrácia PRPP zrýchľuje produkciu purínov, čo spôsobuje zvýšené hladiny kyseliny močovej v plazme. Vyššie spomínaný Lesch-Nyhan syndróm tiež spôsobuje hyperurikémiu ako dôsledok zníženej záchrany hypoxantínu a guanínu a následné zvyšenie koncentrácie PRPP. Sekundárna hyperurikémia je typickým dôsledkom zvýšenej koncentrácie purínov, napr. u pacientov s myeloprolifatívnymi poruchami alebo u tých, čo podstupujú chemoterapiu a teda majú zvýšenú rýchlosť výmeny buniek. Hyperurikémia vedúca ku dne môže byť výsledkom na prvý pohľad nesúvisiacich metabolických porúch, ako napr. von Gierkovej choroby alebo fruktózovej intolerancie. II/37. Metabolismus pyrimidinových nukleotidů, regulace, inhibitory, poruchy. Na rozdiel od syntézy purínového kruhu, ktorý je syntetizovaný na preexistujúcom ribóza-5-fosfáte, pyrimidínový kruh sa syntetizuje predtým ako je naviazaný na ribózu-5-fosfá, ktorý dodáva fosforibozylpyrofosfát (PRPP). Zdrojom pre atómy pyrimidínového kruhu je glutamín, CO 2 a kyselina asparágová. Kľúčovým krokom syntézy pyrimidínov je u človeka syntéza karbamoylfosfátu z glutamínu a CO 2 , ktorá je katalyzovaná karmoylfosfát syntázou II (CPS II). CPS II je inhibovaná UTP (konečným produktom produktom dráhy, ktorý môže byť konvertovaný na iné pyrimidínové nukleotidy) a aktivovaná PRPP. Karbamoyl fosfát, syntetizovaný CPS I, je prekurzorom urei. Defekt v ornitin transkarbamyláze v ornitínovom cykle podporuje syntézu pyrimidínov, vďaka zvýšeniu hladiny karbamoyl fosfátu. Druhým krokom syntézy pyrimidínov je formácia karbamoylaspartátu, katalyzovaná aspartát transkarbamoylázou. Pyrimidínový kruh sa potom uzavrie hydrolyticky pôsobením dihydrooratázy. Vzniknutý dihydroorotát je potom oxidovaný na kyselinu orotovú (orotát). Enzým, ktorý produkuje orotát, dihydroorotát dehydratáza, sa nachádza na vnútornej mitochondriálnej membráne. Všetky ostatné enzýmy dráhy sú lokalizované cytozolicky. Prvé tri enzymatické reakcie (CPS II, aspartát transkarbamoyláza a dihydrooratáza) sú vlastne tri rôzne katalytické domény jedného polyptidového reťazca, nazývaného CAD; názov pochádza z prvých písmen všetkých domén. Toto je príklad multifunkčného alebo multikatalytického polypeptidu, ktorý sprostredkováva usporiadanú syntézu dôležitých látok. Syntéza purinového nukleotidu IMP tiež vyžaduje multifunkčné proteíny. Dokončený pyrimidínový kruh je premenený na nukleotid orotidin-5 ́-monofosfát (OMP) v druhej časti syntézy pyrimidínových nukleotidov. Aj v tomto prípade je donorom ribózy-5-fosfátu PRPP. Enzým orotát fosforibozyltransferáza produkuje OMP a uvoľňuje pyrofosfát, čím robí túto reakciu biologicky ireverzibilnou. OMP, „rodičovský“ pyrimidínový mononukleotid je premenený na uridín monofosfát (UMP) pomocou orotidylát dekarboxylázy, ktorá odstraňuje kyslú karboxylovú skupinu. Orotát fosforibozyltransferáza a orotidylat dekarbocyláza sú tiež katalytickými doménami jedného polypeptidového reťazca nazývaného UMP-syntáza. Orotická acidúria, vzácna genetická porucha, môže byť spôsobená nedostatkom jednej alebo oboch funkčných zložiek tohto bifunkčného enzýmu, čo spôsobí prítomnosť kyselinu orotovú v moči. UMP je postupne fosforylované na UDP a potom UTP. UDP je substrátom pre ribonukleotid reduktázu, ktorá produkuje dUDP. dUDP je fosforsylované na dUTP, ktoré je ale hneď hydrolyzované na dUMP pomocou UTP-difosfatázy (dUTP-áza). dUTP-áza teda hraje dôležitú úlohu pri redukcií dUTP ako substrátu pre syntézu DNA, čím zabraňuje chybnému zaradeniu uracilu do DNA. CTP vzniká amináciou UTP pomocou CTP-syntetázy a glutamínu ako zdroja dusíku. Niektoré CTP sú defosforylované na CDP, čo je substrát pre ribonukleotid reduktázu. Vzniknuté dCDP môže byť fosforylované na dCTP pre syntézu DNA. dUMP sa premieňa na dTMP pomocou tymidylát syntázy, ktorá využíva N 5 , N 10 - metylentetrahydrofolát ako zdroj metylovej skupiny. Ide o nezvyčajnú reakciu, v ktorej tetrahydrofolát (THF) prispieva nielen jedným uhlíkom, ale aj dvomi atómami vodíku z pteridínového kruhu, čím sa THF oxiduje na dihydrofolát (DHF). Inhibítormi thymidylát syntázy sú napr. analógy tymínu ako napr. 5-fluorouracyl, ktoré fungujú ako účinné cytostatiká. 5- flurouracylsa metabolicky premieňa na 5-FdUMP, ktorý ostáva permanentne naviazaný na inaktivovanú thymidylát syntázu; pre tento dôvod sa tento liek nazýva aj „samovražedným“ inhibítorom. DHF môže byť redukovaný na THF pomocou dihydrofolát reduktázy, enzýmu ktorý je inhibovaný liekmi ako napr. metotrexát. Zníženou zásobou THF tento folátový analóg nielen inhibuje syntézu purínov, ale bránením metylácie dUMP na dTMP tiež znižuje koncentráciu tohto nevyhnutného komponentu syntézy DNA v bunke. Ak je syntéza DNA inhibovaná, spomaľuje sa aj rast bunky. Všetky spomínané lieky sa preto využívajú ako cytostatiká v liečbe rakoviny. Trimethoprim, analóg folátu, má antibakteriálny potenciál, lebo selektívne inhibuje bakteriálnu dihydrofolát reduktázu. Pár pyrimidínových bázy je ušetrených (salvage pathway) v ľudských bunkách. Avšak, pyrimidínové nukleotidy môžu byť ušetrené pomocou nukleozidovej kinázy, ktorá využíva ATP na fosforyláciu nuklezidov na nukleotidy. Ušetrenie pyrimidínových nukleotidov je základom pre použite uridínu v liečbe dedičnej orotickej acidúrie. Na rozdiel od purínového kruhu, ktorý sa v ľudských bunkách neštiepi, sa pyrimidínový kruh otvára a degraduje na veľmi rozpustné produkty, β-alanín a β-aminoizobutyrát, za produkcie NH 3 a CO 2 . Patobiochémia Orotická aciduria je autozomálne recesívne poškodenie syntézy pyrimidínov, spôsobená poškodením UMP-syntázy. Chrakterizuje ju hromadenie orotátu v telových tekutinách a jeho zvýšené vylučovanie, pričom môže dochádzať aj ku kryštalizácií. Súčasne vzniká deficit pyrimidínov pre syntézu DNA ústiaca v poruchy delenia buniek a megaloblastovú anémiu nereagujúcu na liečbu železom, vitamínom B 12 ani kyselinou listovou, pretože porucha tkaniva v nedostatočnej syntéze DNA z nedostatku pyrimidínových bázy. Prejavuje sa poruchou rastu, psychomotorickou retardáciou, leukopéniu a malátnosťou. Lieči sa podávaním uridínu. Existuje tiež viacero defektov v degradácií pyrimidínového kruhu. II/38. Reaktivní formy kyslíku, vznik a význam, antioxidanty. Vysoko reaktívne formy kyslíku sú látky, ktoré majú väčší obsah energie ako má základný stav alebo priamo súvisia s metabolizmom týchto zlúčenín súvisia. Medzi tieto látky patria radikály (častice s nepárovým elektrónom a sú schopné samostatnej excitácie) a iné látky, ktoré nie sú radikálmi, napr. peroxid vodíka, singletový kyslík ( 1 O 2 , obidve pôvodne nepárové elektróny sú v rovnakom orbitále, ale majú opačný spin), NO a jeho reakčný produkt so superoxidovým anión radikálom – anión peroxynitrid (OONO - ). Radikály vznikajú zo základného stavu prijatím alebo stratou elektrónu. Vysoká reaktivita a nízka stabilita radikálov teda vyplýva z nepárového usporiadania ich elektrónov. Voľný radikál môže svoj nepárový elektrón predať inej látke (redukujúci radikál), zlúčiť sa s neradikálom alebo prijať chýbajúci elektrón od inej látky (oxidujúci radikál) a tak vytvoriť nový radikál a začať reťazovú reakciu. Určité radikály sú mimoriadne významné v biologických systémoch. Poškodzujú predovšetkým nenasýtené kysliny a fosfolipidy bunkových membrán, nukleové kysliny alebo inaktivujú enzýmy. Môžu ovplyvňovať rýchlosť a smer biochemických reakcií. Meranie aktivít radikálov, súvisiacich s ich pôsobením v organizme sa využívajú v diagnostike a hodnotení priebehu a prognózy ochorenia. Vysoko reaktívne formy kyslíku vznikajú v organizme napr. pri enzymaticky katalyzovaných reakciách alebo pôsobením fyzikálnych faktorov (napr. žiarenie). K ich tvorbe prispievajú aj niektoré prechodné prvky (majú poslednú vrstvu obalu neúplne obsadenú elektrónmi a tak ľahko reagujú s radikálmi). V určitom množstve a v určitých prípadoch sú pre organizmus priaznivé a sú nenahraditeľné. Ich nadbytok v organizme pôsobí oxidačný stres (prevažne vzniká oxidujúcimi radikálmi) a vyvoláva tak mnohé ochorenia. Látky, ktoré pomáhajú udržiavať optimálnu koncentráciu radikálov sa nazývajú antioxidanty. Ide buď o enzýmy (kataláza, peroxidáza, superoxiddismutáza, glutathionperoxidáza) alebo redukujúce látky v organizme (napr. kyselina askorbová, glutathion, kyselina močová, vitamín E) alebo antioxidačné látky podávané ako liečivá. Molekula kyslíku sa v dýchacom reťazci redukuje a počas toho môžu enzymaticky vznikať vysoko reaktívne formy kyslíku a to predovšetkým superoxidový anión radikál O 2 *- a hydroxylový radikál * OH. Superoxidový anión radikál sa môže premieňať na peroxid vodíka alebo až na nebezpečnejší hydroxylový radikál, ktorý je pre krátky polčas života nie je v podstate možné likvidovať. Musíme teda zabrániť vzniku peroxidovému aniónu O 2 -II a teda odstráňovať vznikajúci peroxid vodíka príslušnými enzýmami. Peroxid vodíka je pre organizmus nebezpečný, má dlhý biologický polčas, ľahko difunduje cez membrány a reakciou s prechodnými kovmi (najčastejšie s Fe 2+ - Fentonová reakcia, nižšie) môže byť premenený na vysoko reaktívny hydroxylový radikál a hydroxidový anión (ktorý je ľahko odstránený pomocou pufrových systémov). Fe 2+ + H 2 O 2 → Fe 3+ + * OH + OH - Aby sa predchádzalo tejto reakcií, musíme dané stopové prvky izolovať od H 2 O 2 a to napr. väzbou do chelátu alebo oxidáciou kovu. Hydroxylový radikál reaguje ihneď na mieste vzniku s prítomnou molekulou a odoberá jej vodík a vytvára tak ďalší radikál a spúšťa reťazovú reakciu, ktorá poškodzuje bunky. Vznikajú napr. peroxylové (ROO * ), perhydroxylové ( * OOH) alebo alkoxylové (RO * ) radikály. Antioxidanty, ktoré sa pridávajú do jedál sú napr. propylgalát, butylovaný hydroxyanizol (BHA), butylovaný hydroxytoluén (BHT). Medzi prírodné antioxidanty patrí vitamín E (tokoferol, rozpustný v tukoch), ďalej kyselina močová (urát) a vitamín C (ktoré sú rozpustné vo vode). Pri nízkom PO 2 môže ako antioxidant pôsobiť aj β-karotén. Antioxidanty delíme do dvoch skupín: 1) preventívne antioxdianty, ktoré obmedzujú iniciačnú fázu reťazovej reakcie 2) antioxidanty prerušujúce reťazovú reakciu (zamedzujú propagácií reakcie). Medzi preventívne atioxidanty patrí kataláza a ďalšie peroxidázy (ako napr. glutathionperoxidáza), ktoré reagujú s ROOH + ; selén, ktorý je základnou zložkou glutathionperoxidázy a podieľa sa na regulácií jej činnosti; a cheláty kovových iónov ako napr. EDTA (etyléndiamíntetraacetát) a DTPA (dietylénamínpentaacetát). V organizme sú najdôležitejšie antioxidanty superoxiddismutázy, ktoré zachycujú voľné radikály superoxidu (O 2 *- ) vo vodnom prostredí; uráty a vitamín E, ktoré zachycujú ROO * radikály v lipidovom prostredí. Peroxidácia v organizme je katalyzovaná tiež zlúčeninami obsahujúcimi hem a lipoxygenázami nachádzajúcimi sa v krvných doštičkách (trombocytoch) a leukocytoch. Ďaľšie fyziologicky významné produkty autooxidácie alebo enzýmovej oxidácie sú oxysteroly (vznikajú z cholesterolu) a izoprostany (vznikajú peroxidáciou polynenasýtených mastných kyslín, napr. kyseliny arachidónovej). III. Základy biochemie orgánů a funkcí III/1. Vzájemné biochemické vztahy metabolismu sacharidů a ostatních živin. V centre metabolizmu sacharidov jednotlivých orgánov sa nachádza glukóza, ktorá predstavuje pre všetky druhy buniek jediný zdroj energie a je vo forme „tzv. krvného cukru“ prístupná všetkým tkanivám v relatívne stálej koncentrácii. Úlohou systémov regulujúcich hladinu glukózy je pokrývať široko kolísajúcu spotrebu glukózy v jednotlivých orgánov bez toho, aby dochádzalo k výraznejšiemu poklesu koncentrácie glukózy v krvi, pretože hlavne mozog veľmi citlivo reaguje na jej nedostatok. Naopak môže vo fáze resorpcie vzniknúť prebytok glukózy prichádzajúcej potravou, ktorá musí byť rýchlo prevedená na zásobné formy, aby nedošlo k vzostupu jej krvnej hladiny. Vzhľadom k obmedzenej schopnosti ľadvín resorbovať glukózu by mohlo dôjsť k jej stratám. Naviac glukóza v dlhodobo zvýšenej koncentrácií poškodzuje krvné cievy, čo môže vyvolať následné choroby. Organizmus disponuje značnými zásobami „palív“, tzn. metabolitov, ktoré môžu byť využité k produkcii ATP. Ako dlhodobá rezerva sú v tukovom tkanive uložené triacylglyceroly, ktoré svoju energetickou hodnotou tak 500 MJ (megajoule = 1000 kJ) tvoria 80% všetkých zásob. Tuky predstavujú ideálne zásobné látky. Je možné ich uskladňovať ako nerozpustné a preto neaktívne kvapôčky. Naviac vykazujú zo všetkých metabolitov najvyššiu energetickú hustotu (39 kJ/g). Druhou najväčšou energetickú rezervu organizmu sú svalové bielkoviny. Pre hladovaní sú ich glukogénne aminokyseliny vzniknutej proteolýzou využívaný ako prekurzory v glukoneogenéze a preto môžu – na rozdiel od mastných kyselín – po dlhšiu dobu udržiavať hladinu krvného cukru. Rýchlo mobilizovateľným zdrojom glukózy je glykogén uložený vo svaloch a pečeni. Jeho asi iba 2% podiel na energetických rezervách je bezvýznamný. Hladina glukózy nalačno sa pohybuje okolo 5 mmol/l. Postpradiálne (ihneď po jedle) môže krátkodobo vzrásť na 7-8 mmol/l, naopak pri dlhotrvajúcom hladovení sa môže vychýliť až na hodnotu okolo 4 mmol/l. Výrazne znížená hladiny glukózy (hypoglykémie) znamená – na rozdiel od predchádzajúcej hyperglykémie . akútne ohrozenie organizmu. Preto stojí proti jedinému hormónu znižujúcemu hladinu glukózy (inzulín) množstvo hormónov, ktoré ju zvyšujú (glukagón, adrenalín, kortizol, etc.) Bazálna spotreba glukózy je u dospelého človeka normálne okolo 10 g/h. Pritom konštantne pripadá 60% na mozog a 10- 15% na erytrocyty. Obe tkanivá sú závislé na glukóze ako zdroji energie a spotrebúvajú ju nezávisle na inzulíne. Ďalšími veľkospotrebiteľmi sú svaly a tukové tkanivo, ktorých spotreba je ale kolísavá. Vstup glukózy do obidvoch tkanív prostredníctvom transportéru Glut-4 je stimulovaný inzulínom. Pretože svaly nie sú schopné uvoľniť glukózu z glykogénu, je najdôležitejším dodávateľom glukózy pečeň. Väčšinou vydáva len množstvo krycie bazálnu spotrebu 10 g/h, ale pôsobením glukagónu alebo adrenalínu je schopná produkcie glukózy krátkodobo mnohonásobne zvýšiť. Inzulín, dominantný anabolický hormón, podporuje metabolické dráhy a transportné procesy vedúce k zníženiu glukózy v krvi, znižuje lipolýzu a podporuje biosyntézu zásobného tuku a svalových bielkovín. Ako antagonisti inzulínu pôsobia glukagón, adrenalín a kortizol, ktoré uvoľňujú glukózu a mastné kyseliny zo zásobných tkanív a podporujú glukoneogenézu. Tiež tyorxín a rastový hormón somatotropín zvyšujú prostredníctvom glukoneogenézy hladinu glukózy. Tiež v metabolizme aminokyselín a lipidov je účasť jednotlivých tkanív odlišná. Krv zásobuje orgány rôznymi prekurzormi, rozdeľujeme vzniknuté zlúčeniny v organizme alebo transportuje terminálne produkty určené k odstráneniu do pečene alebo ľadvín. Aminokyseliny, ktoré nie sú v príslušnom orgáne štiepení na energiu alebo pre krvný transport mení na glutamín alebo alanín. Glutamín s plazmatickou koncentráciou až 0,8 mmol/l slúži ako najdôležitejšia transportná molekula aminodusíku. Naviac funguje ako obľúbený energetický substrát pre energeticky náročné bunky, ako sú erytrocyty, leukocyty a tubulárne bunky ľadvín. Pri tvorbe glutamínu sa najprv prenesie aminoskupina štiepenej aminokyseliny za tvorby glutamátu na 2- oxoglutarát. Potom je γ-karboxylová skupiny vytvoreného glutamátu s pomocou glutaminsyntetázy amidovaná na kyslú amidoskupinu, pričom aminoskupina pochádza z glutamátu. V pečeni a ľadvinách sú alanín a glutamín využívané ku glukoneogenéze. Pre tento účel je najprv glutamín pôsobením glutaminázy hydrolyticky deaminovaný na glutamát, ktorého oxidatívna deaminácia pomocou glutamátdehydrogenázy opäť vyprodukuje 2- oxoglutarát. Alanín je následne transamináciou premenený späť na pyruvát. Kostrová svalovina sa špecializuje na štiepenie aminokyselín s rozvetvenými reťazcami. Ich aminodusík je cez glutamát zabudovaný do glutamínu a alanínu. Takže laktát vznikajúci v anaerobne pracujúcom svale je sčasti po oxidácií na pyruvát a trasaminácii trasportovaný do pečene, kde sa z neho opäť syntetizuje glukóza. Z funkčného hľadiska je tento tzv. alaninový cyklus porovnateľný s Coriho cyklom. Pečeň je jediným orgánom schopným zabudovať k exkrecii určený aminodusík do močoviny (cyklus močoviny). Naviac môže zhodnotiť prebytočné aminokyseliny v glukoneogenéze (najdôležitejším prekurzorom je alanín) alebo rozštiepením.. Ľadviny uprednostňujú ako glukoneogenetický prekurzor glutamín: Pri štiepení vznikajúci amoniak (NH 3 ) slúži k pufrovaniu protónov v moči. Ľadviny tiež dodávajú ostatným orgánom arginín a serín. Enterocyty čreva kryjú svoje energetické potreby prevažne štiepením glutaminu a glutamátu a ich dusík odvádzajú do krvi vo forme alanínu. Na lipidovom transporte sa zúčastňujú 2 typy komplexov: proteíny s väzobnými miestami pre lipidy (napr. albumín transportujúci voľné mastné kyseliny) a tzv. lipoproteíny. Črevo resorbuje monoacylglyceroly a voľné mastné kyseliny, z ktorých opäť syntetizuje triacylglyceroly, ktoré sa ukladajú do chylomikronov a prechádzajú do lymfy. K ich štiepení na mastné kyseliny a glycerol dochádza na periférii pôsobením lipoproteinovej lipázy. Pečeň mení mastné kyseliny na tuky a exportujú ich vo forme VLDL. Pri nadbytku mastných kyselín tvorí ketolátky a zásobujú nimi ostatné orgány (svalovinu, CNS). Tukové tkanivo uvoľňuje z chylomikronov a VLDL mastné kyseliny a mení ich na zásobný tuk. V prípade potreby z nich pôsobením hormónsenzitívnej lipázy znovu uvoľnia mastné kyseliny, ktoré sú využívané svalovinou, pečeňou a ostatnými orgánmi. Kvantitatívne najdôležitejšou ketolákou je β-hydroxybutyrát. Pred vstupom do metabolizmu je najprv oxidovaný na acetacetát, ktorý je následne aktivovaný tým, že na neho sukcinyl-CoA prenesie CoA a vzniká acetacetyl-CoA. Ten sa následne štiepi β-oxidáciou na acetyl-CoA. Obdobie v priebehu a bezprostredne po jedle sa označuje ako resorpčná fáza. V tomto časovom úseku dominujú v metabolizme transportné procesy a metabolické dráhy umožňujúce uloženie metabolitov resorbovaných v čreve so krátkodobých alebo dlhodobých rezerv (glykogén, bielkoviny, tuk). Charakteristickým hormónom resorpčnej fázy je inzulín, ktorého pankreatická sekrécia po jedle vzrastie až na 5-10 násobok, naopak produkcia jeho antagonistami glukagonu poklesne až o 50%. Črevo predáva behom resorpčnej fázy do krvi cukry (hlavne glukózu) a aminokyseliny. Najväčšia časť sa ich dostáva vrátnicovou žilou do pečene. Tuky vstupujú do krvi okľukou cez lymfu ako súčasť chylomikronov. V intermediárnom metabolizme funguje pečeň spolu s tukovým tkanivom ako pufrovací a zásobný orgán. Behom resorpčnej fázy ukladá prichádzajúcu glukózu najprv vo forme glykogénu. Hneď ako sa glykogénové rezervy naplnia, štiepi sa glukóza glykolýzou na acetyl-CoA, z ktorého sa cez mastné kyseliny tvorí tuk, ktorý je exportovaný ako súčasť VLDL. Syntéza glykogénu a štiepenie glukózy na tuk sú stimulované inzulínom. Hneď ako sa hladina opäť zníži, mení pečeň aminokyseliny na glukózu prevažne cestou glukoneogenézy. Tukové tkanivo uvoľňuje s pomocou lipoproteínovej lipázy (LPL) z lipoproteínov (chylomikronov a VLDL) mastné kyseliny a ukladá ich vo forme triacylglycerolov. Glycerol potrebný pre syntézu tukov pritom poskytuje štiepenie glukózy. Inzulín zvyšuje príjem glukózy prostredníctvom Glut-4 a stimuluje štiepenie lipoproteínov a syntézu zásobného tuku aktiváciou LPL. Tiež svalovina prijíma behom resorpčnej fázy pod vplyvom inzulínu v zvýšenej miere glukózu a ukladá ju ako glykogén. Naviac sval využíva aminokyseliny k syntéze bielkovín. Aj tento dej je stimulovaný inzulínom. Spotreba glukózy v CNS a erytrocytoch je na stave metabolizmu nezávislá a nemení sa ani behom resorpčnej fázy. U zdravého človeka stúpa hladina glukózy po jedle až o 50%. Pankreas reaguje behom niekoľkých minút uvoľnením zásob inzulínu, zatiaľ čo hladina glukagonu klesá. Po tejto prvej fáze účinku inzulínu nasleduje asi po 30 minútach druhá fáza, pre ktorú je typické vylučovanie novo syntetizovaného inzulínu. Novotvorbu inzulínu v β-bunkách stimulujú tkanivové hormóny čreva, ku ktorým patrí hlavne gastrín, sekretin a peptidový hormón GLP-1 (glucagon-like peptide 1). Pri orálnom glukózovom tolerančnom test (oGTT), kedy sa podáva 100g ľahko stráviteľných sacharidov, hladina vzrastie a opäť sa behom 2-3 h zníži na pôvodnú hodnotu. V prípade pacientov s diabetes mellitus je vzostup krvnej glukózy najprv výraznejší, ale je nasledovaný oveľa pomalším poklesom. Najdôležitejším signálom pre vylúčenie inzulínu z pankreatických β-buniek je vzostup glukózy v krvi, čo zvýši príjem glukózy málo afinitným transportérom Glut-2, čím stimuluje štiepenie glukózy. Vytvorený ATP uzavrie v plazmatickej membráne K + -kanál smerujúci von, čo spôsobí depolarizáciu membrány. V nej sa následne otvoria napäťovo riadené Ca 2+ - kanály a po prílive iónov Ca 2+ dôjde k exocytóze uloženého inzulínu. Jeho sekréciu podporujú tiež gastrointestinálne hormóny a niektoré aminokyseliny. Farmakologicky je možné sekréciu inzulínu zvýšiť orálnymi antidiabetikami, ako je napr. sulfonylmočovina. Niekoľko hodín po jedle začína postresorpčná fáza, ktorá prejde po niekoľkých dňoch do fázy hladovania, ak sa prísun potravy zastaví. V jej priebehu dôjde k masívnym zmenám intermediárneho metabolizmu smerujúcim predovšetkým k udržaniu hladiny krvnej glukózy. Ide o životne dôležitý proces, pretože mozog, erytrocyty a ďalšie orgány sú na stálom prísune glukózy závislé. Krvná glukóza v postresorpčnej fáze pochádza hlavne zo štiepeného glykogénu a neskôr z glukoneogenízy. Pri dlhšom hladované je už k dispozícií iba glukoneogenéza využívajúca štiepenie bielkovín a tukov. Dominantným metabolickým hormónom postresorpčnej fázy a pri hladovaní je glukagón z α-buniek pankreasu, ktorého koncentrácia v krvi sa zdvojnásobí, naopak haldina inzulínu sa výrazne zníži. V prípade niekoľkotýždňového hladovania už nie je k dispozícii žiaden glykogén, ale mozog je už preorientovaný na využívanie ketolátok. V tukovom tkanive dochádza následkom vysokej hladiny glukagónu a pôsobením hormonsenzitivnej lipázy k plnej aktivácii lipolýzy. V tejto situácii je denná spotreba tukov asi 180 g. Zhruba 20% uvoľnených mastných kyselín je využitých vo svaloch a ďalších orgánoch ako zdroj energie a 80% sa v pečeni zmení na ketolátky. Glycerol, ktorý sa pri glykolýze tiež uvoľní, je použitý pre glukoneogenézu. Aj behom hladovania zostáva pečeň najdôležitejším zdrojom glukózy, ktorú syntetizuje v procese glukoneogenézy z aminokyselín, laktátu a glycerolu. Udávané množstvo 80 g/deň je iba zlomkom množstva glukózy, ktorá sa uvoľní pri normálnej výžive alebo v postresorpčnej fáze (bazálne 10 g/h = 240 g/deň). Naopak množstvo ketolátok produkovaných pečeňou masívne stúpa. Z ich celkového množstva 150 g/deň je tretina využitá vo svaloch a 2/3 v mozgu. Vo svaloch dochádza behom postresorpčnej fázy najprv k výraznému odbúravaniu bielkovín, ktoré sa potom využívajú ako prekurzory glukoneogenézy v pečeni. Pretože by tak intenzívna proteolýza časom ovplyvnila svalové funkcie, je výrazne redukovaná vo chvíli, kedy sa mozog preorientuje na využitie ketolátok. Mozog pokrýva svoje energetické potreby pri hladovaní prevažne štiepením ketolátok (inset). Po dlhšom hladovaní svoju spotrebu glukózy redukuje o 2/3 a spotrebováva hlavne 3-hydroxybutyrát a menej acetoacetát. Hneď ako je glukóza spotrebovaná z potravy, stáva sa po 8-12 h jej hlavným zdrojom rozklad glykogénu. Súčasne dochádza aj k aktivácii glukoneogenézy, ktorá prevezme po 1-2 dňoch všetko zásobenie glukózou. Ako už bolo povedané, dochádza zhruba po týždni tiež k redukcii glukoneogenézy, aby sa šetrila svalovina. Zmeny v metabolických procesoch behom hladovania sa prejavia tiež v časovom priebehu koncentrácie metabolitov v krvi. Hladina krvnej glukózy klesne v prvých dňoch hladovania na konštantnú hodnotu 3,5-4 mmol/l. Tiež exkrécia dusíku močom sa kontinuálne znižuje následkom postupnej redukcie proteolýzy v svaloch. Naopak dramaticky vrastá plazmatická koncentrácia ketolátok a dosiahne po 3-4 týždňoch dvojnásobku koncentrácie glukózy. III/2. Glykemie, regulace, diagnostika (oGTT, glykovaný hemoglobin). Glykémia predstavuje koncentráciu glukózy v krvi, za fyziologických podmienok je udržiavaná v rozmedzí 3,4-5,6 mmol/l na lačno a po jedle menej ako 11 mmol/l. Je prísne regulovaná množstvom mechanizmov: inzulínom, ktorý glykémiu znižuje, a jeho antagonistami – glukagónom, katecholamínmi, glukokortikoidmi a rastovým hormónom, ktoré glykémiu zvyšujú. Na regulácii glukózovej homeostázy sa výrazne podieľa pečeň. Udržanie stálej hodnoty glykémie je nevyhnutné pre činnosť CNS a iných buniek a tkanív (napr. erytrocytov). Exogénnym zdrojom glukózy pre organizmus sú disacharidy a polysacharidy obsiahnuté v potrave. Glukóza vzniká ich rozštiepením v tenkom čreve a je utilizovaná v pečeni, svaloch, tukovom a mozgovom tkanive ako priamy zdroj energie. Nezoxidovaná glukóza sa uskladňuje vo forme glykogénu alebo sa premieňa na mastné kyseliny a triacylglyceroly. Nalačno sa normálna koncentrácia glukózy udržuje štiepením glykogénu glykolýzou a tvorbou glukózy z nesacharidových prekurzorov (aminokyselín, glycerolu a laktátu) v procese glukoneogenézy. Pokles glykémie pod hodnotu 2,2 mmol/l sa označuje ako hypoglykémia. Pri hypoglykémii je ohrozené zásobovanie mozgu glukózou. Môže sa vyskytovať v priebehu rôznych ochorení, napr. u endokrinne aktívnych nádorov produkujúcich inzulín, pri predávkovaní antidiabetikami alebo pri hladovaní. Ťažšia hypoglykémia je sprevádzaná nekľudom, potením a triaškou (třesem), pri ďalšom poklese glykémie dochádza k poruche vedomia. Glykémia zvýšená nad referenčné hodnoty sa označuje ako hyperglykémia. Je základným prejavom diabetes mellitus (viz. Patobiochémia nižšie). Môžeme sa však stretnúť aj s prechodnou nediabetickou hyperglykémiou, napr. pri stresových situáciách, pri akútnom infarkte myokardu alebo náhlej cievnej mozgovej príhode, pri operáciách alebo traumatu. Väčšinou však ustupuje do jedného týždňa. Inzulín je najdôležitejším anabolicky pôsobiacim hormónom. Metabolizmus riadi spoločne o svojimi antagonistami glukagónom, adrenalínom, kortizolom, tyroxínom a rastovým hormónom. Inzulín je peptidový hormón z 51 aminokyselín. Skladá sa z dvoch reťazcov, reťazca A (21 AMK) a reťazca B (30 AMK) spojených dvomi disulfidickými mostíkmi. Tretí disulfidický mostík stabilizuje reťazec A. Inzulín sa tvorí v β-bunkách Langerhansových ostrovčekoch pankreasu. Podobne ako u ostatných sekrečných proteínov, nesie aj prekurzor hormónu, preproinzulín, signálny peptid z 24 AMK, ktorý zavádza peptidový reťazec dovnútra endoplazmatického retikula. Tam vzniká po odštiepení signálneho peptidu a vytvorenia disulfidických mostíkov proinzulín obsahujúci vedľa reťazcov A a B ešte peptid C tvorený 35 AMK. Proinzulín vstupuje potom do Golgiho aparátu, kde sa po odštiepení peptidu C prohormón konverzatázou zmení na zrelí inzulín (limitovaná proteolýza). Následne je inzulín vo forme zinok-obsahujúcich hexamérov uložený spoločne s odštiepeným peptidom C do vačkov zvaných granula β a odtiaľ podľa potreby vylučovaný. Exocytóza inzulínu z β-buniek je stimulovaná glukózou, Dodatočne podporne pôsobia tiež AMK s rozvetvenými reťazcami a gastrointestinálne hormóny ako GIP a GLP-1 (inkretíny). Rozmanité účinky inzulínu sú vyvolané väzbou na inzulínový receptor. Inzulínový receptor je α 2 β 2 -tetramér nesúci vo vnútri bunky aktivovateľné tyrozínkinázové domény. Naviazanie hormónu spustí tyrozínkinázovú aktivitu receptoru, ktorý sa následne sám spolu s ďalšími proteínmi (receptorové susbstráty) fosforyluje na rôznych tyrozínových zvyškoch. Na fosfotyrozínové zvyšky sa naviažu adaptérové proteíny, ktoré pokračujú vo vedení signálu. Dlhodobý charakter majú účinky inzulínu na transkripciu. Na fosforylovaný IRS (inzlín-receporový substrát) sa viažu adaptérové proteíny Grb-2 a Sos („son of sevenless“)a stimulujú tak G-proteín Ras. Ras aktivuje proteínkinázu Raf, ktorá spustí fosforylačnú kaskádu, vedúcu cez kinázy Mek a Erk (tiež nazývané MAPK – mitogen associated protein kinase) k fosforylácii transkripčných faktorov v jadre bunky. Rýchlejšie účinky inzulínu na metabolizmus sacharidov a lipidov sa obídu aj bez neosyntézy bielkovín. Na fosforylovaný IRS sa môže okrem Grb-2 viazať aj dimérny adaptérový proteín, ktorý tak získa fosfatidylinozitol-3-kinázovú (PIns3K) aktivitu a na membráne fosforyluje fosfolipidy zo skupiny fosfatidylinozitolov v pozícii 3. Na tieto reakčné produkty sa viaže proteínkináza PDK-1, stáva sa účinnou a sama aktivuje proteínkinázu B. Tá vykazuje viacero účinkov. Prostredníctvom AS160 vyvoláva spojenie vačkov obsahujúcich glukózový transportér Glut-4 s plazmatickou membránou, čo spôsobí začlenenie Glut-4 do membrány a následne zvýšený príjem glukózy do svaloviny a tukového tkaniva. Naviac tlmi PK-B prostredníctvom fosforylácie glykogénsyntézy-kinázy 3 (GSK-3). Pretože sama GSK-3 potlačuje fosforyláciou glykogénsyntázu, vyvolá jej inaktivácia účinkom PK-B zvýšenú syntézu glykogénu. S pomocou PK-B aktivovaná proteínfosfatáza 1 (PP-1) prevedie defosforyláciou glykogénsyntázu do aktívnej formy. Fosforyláciou inaktivuje PK-B transkripčný faktor Foxo, čím dôjde k zastaveniu transkripcie PEP-CK (fosfoenolpyruvátkarboxykináza). Glukagón je dôležitým antagonistom inzulínu Ide o peptidový hormón tvorený 29 aminokyselinami, ktorý je syntetizovaný v α-bunkách Langerhansových ostrovčekov. Podobne ako inzulín, aj glukagón vzniká ako preprohormón, ktorý je limitovanou proteolýzou premenený na proglukagón a konečne na glukagón, ktorý sa ukladá do vačkov. Exocytózu glukagónu brzdí glukóza, inzulin a somatostatín. Pokles koncentrácie glukózy pod 2,8 mmol/l, ktorý sa vyskytuje pri hladovaní vyvolá sekréciu glukagónu. Jeho biologický polčas v krvi trvá len niekoľko minút. Dôležitým cieľovým orgánom je pre glukagón pečeň, kde sa špecificky viaže na 7-helix receptor (CPCR) a prostredníctvom proteínu G s vyvolá tvorbu cAMP. Vzostup koncentrácie cAMP smeruje aktiváciou proteínkinázy I k urýchlenej glykogenolýze a zníženiu tak tvorby glykogénu. Zvýšenie cAMP tiež stimuluje štiepenie fruktóza-2,6-bisfosfátu, čím dôjde k zastaveniu glykolýzy a urýchleniu glukoneogenézy. Táto zmena metabolizmu sa odohráva rýchlo (behom minút). Pomalšie prebieha indukcia glukoneogenetických enzýmov, ktorú vyvolá glukagón prostredníctvom cAMP aktiváciou transkripčného faktoru CREB v bunkovom jadre. V skratke glukagón spôsobuje, že pečeň glukózu neprijíma, ale vylučuje. Tak dochádza k normalizácii hladiny glukózy tak dlho, dokiaľ má pečeň k dispozícii dostatočné energetické zásoby (glykogén a substráty pre glukoneogenézu). Jak ďaleko zasahuje glukagón do lipidového metabolizmu, nie je známe. Preproglukagón je syntetizovaný tiež v čreve a mozgu. Nevzniká tu však glukagón, ale tkanivové hormóny s odlišnou štruktúrou a funkciou – glukagónu podobné peptidy GLP-1 a GLP- 2. Glykogénu podobné peptidy sú vylučované v reakcii na glukózu L-bunkami intestinálnej mukózy, aby organizmu signalizovali príjem potravy. GLP-1 podporuje uvľňovanieinzulínu z pankreasu (inkretínový účinok) a vznik pocitu sýtosti v mozgu. GLP-2 tlmi sekréciu žalúdočnej šťavy a ovplyvňuje motilitu a resorpciu v tenkom čreve. Glukokortikoid kortizol sa tvorí v zona fasciculata kôry nadľadvín z cholesterolu. Jeho prekurzormi sú prenenolon a progesteron. Podobne ako ostatné steroidné hormóny je kortizol ihneď po syntéze exocytózou vylúčený z bunky do krvi, kde sa viaže na transportnú bielkovinu transkortin (CBG). Biosyntézu riadi glandotropný hormón hypotalamohypofyziárnej osy ACT, ktorý vykazuje cirkadiánny rytmus s maximálnou aktivitou skoro ráno. Kortizol sa môže reverzibilnou dehydratáciou zmeniť na hormonálne neúčinný kortizon, ktorý nesie na C-11 miesto hydroxylovej skupiny oxoskupinu. Kortizol pomáha organizmu prispôsobiť sa strsu či extrémnym situáciám a prečkať obdobie dlhšieho hladovania. Stimuluje štiepenie bielkovín na aminokyseliny (proteolýza) v extrahepatálnych tkanivách, hlavne vo svaloch a podporuje premenu aminokyselin na sacharidy v pečeni (glukoneogenéza) a tvorbu glykogénu. Súčasne kortizol indukuje v pečeni niektoré kľúčové enzýmy metabolizmu aminokyselín a sacharidov. V tukovom tkanive kortizol podporuje uvoľňovanie mastných kyselín inými hormónmi (lipolýza)- Následkom katabolického účinku na extrahepatálny metabolizmus proteínov vzniká negatívne dusíková bilancia a vo vyšších koncentráciáchpôsobí glukokortikoidy imunosupresívne a protizánětlivo. Tieto účinky sa využívajú vo farmakológii. Pretože je kortizol vo vzťahu k metabolizmu glukózy antagonistom inzulínu, môže vyvolať liečba glukokortikoidmi tiež glukózovú toleranciu a diabetes mellitus. Trvalo zvýšená koncentrácia hormónov potláča v kostiach aktivitu ostoeblastov (čo vedie k osteoporóze). Kortikosteroidy vykazujú tiež nevýrazný mineralokortikoidný účinok. Na regulácií glykémie sa tiež podieľa adrenalín, ktorý zvyšuje glykémiu aktiváciou glukoneogenézy. Patobiochémia Diabetes mellitus (DM, „cukrovka“) je časté metabolické ochorenie vyvolané absolútnym alebo relatívnym nedostatkom inzulínu. Karencia tohto peptidového hormónu sa prejaví hlavne na metabolizme sacharidov a lipidov. DM sa vyskytuje v dvoch formách. Pri diabete I.typu (inzulindependentný DM, IDDM) dochádza už v rannom veku k deštrukcii inzulinotvorných buniek autoimunitnou reakciou podmienenou pravdepodobne vírusovou infekciou. Miernejšou formou diabetu je II.typ (non-inzulindependentná forma, NIDDM), ktorá sa prejavuje väčšinou až vo vyššom veku. Jej príčiny súvisia s inzulínovou rezistenciou a poruchou inzulínovej signalizácie. Následky nedostatku inzulínu pre metabolizmus sú rôzne. Zvlášť nápadné je zvýšenie glykémie z 5 mmol/l na 9 mmol/l a viac (hyperglykémia). Pri nedostatku inzulínu je ovplyvnený príjem a využitie glukózy jej najväčšími konzumentmi – svalovým a tukovým tkanivom. Tiež v pečeni je metabolizmus glukózy poškodený. Pri nedostatku inzulínu sa súčasne stimuluje glukoneogenéza hlavne následkom intenzívnej proteolýzy v svalovine, čo následne ďalej zvýši hladinu glukózy v krvi. Ak dôjde k prekročeniu reabsorpčnej kapacity ľadvín pre glukózu (pri plazmatickej koncentrácií 9 mmol/l a vyššej), začne sa stupňovať vylučovanie glukózy močom (glykosuria, otázka III/15) Zvýšené štiepenie tukov ako následok nedostatku glukózy pri DM I.typu má pre organizmus závažné následky. Výskyt veľkého množstva mastných kyselín je v pečeni využívaný z časti k syntéze lipoproteínov (hyperlipidémia), zvyšná časť sa štiepi na acetyl-CoA. Pretože citrátový cyklus nie je schopný takéto množstvo acetyl-CoA spracovať, tvoria sa v pečeni v prebytku ketolátky (otázka II/24). Pritom sa uvoľnia ióny H + , čo môže spôsobiť závažné metabolické acidózy. Súčasne produkovaný acetón dodáva pacientovmu dychu charakteristický zápach. Naviac sa objaví veľké množstvo aniónov u ketolátok v moči (ketonuria, otázka III/15). Poruchy metabolizmu spôsobené nedostatkom inzulínu v akútnom prípade spôsobiť až diabetickú kómu či dokonca smrť. Neliečený DM môže mať ťažké dôsledky dlhodobo zvýšená hladina glukózy totiž pôsobí chorobné zmeny na cievach (diabetická angiopatia), ľadvinách (nefropatia) a nervovom systéme (neuropatia) ako aj zakalenie očnej šošovky (katarakta). Hlavnou príčinou týchto neskorých diabetických komplikácií je pravdepodobne neenzymatická reakcia aldehydovej skupiny glukózy s aminoskupinami bielkovín, lipidov a nukleových kyselín („glykozilácia“). Už u zdravých osôb sa vyskytuje 4-6% hemoglobínu A v glykozilovanej forme, tzn. ako HbA 1c . Ako podiel u neliečených diabetikov vzrastá a slúži ako meradlo správneho nastavenia hladiny glukózy. Glykozilácia najprv začína reverzibilnou tvorbou Schiffovej bázy medzi aldehydom a aminoskupinou. Nasleduje ireveribilný Armadoriho prešmyk na glykozilovaný produkt. Ak dôjde ku glykozilácií dlhšie existujúcich proteínov, môžu sa ďalej premieňať až na koncové produkty, tzv. pokročilé produkty glykácie (advanced glycosylation endproducts, AGE). Orálny glukózový tolerančný test (oGTT) odráža reakciu organizmu na podanie glukózy fyziologickou cestou a hodnotí, či je organizmus schopný po záťaži glukózou udržať jej hladinu v krvi v normálnom rozmedzí. Podáva informáciu nielen o účinkoch hormónov regulujúcich glykémiu, ale tiež o procesoch v gastrointestinálnom trakte (rýchlosť vyprázdňovania žalúdku, pasáž červom a resorpcia) a funkciách pečene. oGTT sa používa predovšetkým pre skorú diagnózu gestačného diabetu. V tomto prípade sa používa ako rutinné skríningové vyšetrenie, vykonávané u všetkých tehotných na prelome 2. a 3. trimestra (pri vysokom riziku naviac aj čo najskôr po začiatku tehotenstva). U ostatných osôb sa oGTT odporúča ako doplňujúca skúška pre diagnostiku DM, ak nie je možné rozhodnúť podľa hodnôt glykémie nalačno a náhodnej glykémie (hlavne ak je glykémia na lačno medzi 5,6-6,9 mmol/l). Ak sú hodnoty glykémie nalačno alebo náhodnej glykémie dostatočné pre diagnostiku DM, bol by oGTT zbytočnou záťažou pre pacienta a je preto kontraindikovaný. Ďalej sa nevykonáva na akútne chorých a imobilizovaných pacientov ani u pacientov na redukčnej diéte. Postup pri oGTT:  3 dni pred testom pacient neobmedzuje príjem sacharidov (najmenej 150 g/deň) a vykonáva zvyčajnú telesnú námahu  po 8-14 hodinovom lačnení sa odoberie vzorka krvi nalačno  pacient vypije 75 g glukózy rozpustenej v 250-300 ml čaju alebo vody behom 5-10 minút  behom vyšetrenia ostáva pacient sedieť  ďalšia vzorka krvi sa odoberá v 60. a 120. minute po záťaži glukózou Okrem tohto spôsobu oGTT sa môže vykonávať ešte podrobnejšia tzv. glykemická krivka, kedy sa krv odoberá viackrát, spravidla v 30 min intervaloch. V priebehu glykemickej krivky je možné popísať 3 úseky: 1. Glukóza sa po podaní per os vstrebáva a glykémia sa zvyšuje – vzostupná časť. Po gastrektomii býva strmá, pri malabsorpcii plochá. V dôsledku zvýšenia glykémie sa podnecuje oxidácia glukózy v svaloch a pečeni sa tvorí glykogén. 2. Funkciu pečene a účinky inzulínu v pečeni odráža ďalšia – vrcholová časť glykemickej krivky. V prípade začínajúceho DM nie je glukóza v pečeni dostatočne premieňaná na glykogén a preto vrchol glykemickej krivky presahuje hodnotu 11,1 mmol/l a maximum nastáva aj neskôr ako za 60 min. Pri ochorení pečene je vrcholová časť krivky tiež zmenená. Hepatocyty nestačia vstrebanú glukózu zmetabolizovať, takže do periférie prechádza viac glukózy Vrchol tiež prevyšuje hodnotu 11,1 mol/l a zvýšenie pretrváva dlhšie ako 6 min, ale na rozdiel od DM sa v 120. minúte vracia k norme (zvonový tvar krivky). V prípade hypertyreózy je v dôsledku rýchleho vstrebávania tiež prekročená hladina 11,1 mmol/l, ale pokles je rýchly (gotický tvar krivky). 3. Zostupná časť je závislá na účinkoch inzulínu a fyziologicky je charakterizovaná poklesom hladiny glukóz. Spomalený alebo nedostatočný návrat glykémie k norme je klasickým prejavom DM. Normálne pozorujeme maximálny vzostup za 30-60 min, nedochádza ku glykozurii a po 2 hodinách sa glykémiavracia k hodnotám nalačno. Všeobecne je oGTT zaťažený náhodnou chybou a nízkou reprodukovateľnosťou. III/3. Metabolismus tukové tkáně. Tukové tkanivo je špecializované pojivo. Najčastejšie sa vyskytuje vo forme bieleho tukového tkaniva, ktorého bunky, adipocyty, obsahujú typickú veľkú vakuolu, do ktorej sa ukladá tuk. Cytoplazma a bunkové jadro sa preto nachádzajú na okraji bunky v blízkosti membrány. Biele tukové tkanivo predstavuje najdôležitejšiu energetickú zásobáreň tela a naviac funguje ako dobrý tepelný izolátor a mechanická ochrana. Slúži ako úložisko provitamínu A (β-karoten) a vitamínu E (α-tokoferol). Druhým typom tukového tkaniva je hnedé tukové tkanivo, ktoré ma význam pri termogenéze iba u kojencov (a hybernujúcich zvierat). Pri dostatočnom prísune potravy syntetizujú adipocyty tuky (lipogenéza).Z krvi odoberajú s pomocou glukózového transportéru Glut-4 glukózu a metabolizujú ju v priebehu glykolýzy a pentózového cyklu. V priebehu glykolýzy vznikne glyceron-3-fosfát (dihydroxyacetónfosfát), ktorý je redukovaný s pomocou glycerol-3- fofátdehydrogenázy. Ten môže vzniknúť aj z iných metabolitov, ako je napr. alanín, kyselina asparágová alebo malát (glyceroneogenéza).Adipocyty na rozdiel od hepatocytov neobsahujú glycerolkinázu, a preto nemôže byť voľný glycerol použitý na tvorbu glycerol-3-fosfátu. Z pyruvátu vzniknutého behom glykolýzy sa v mitochondriách vytvorí acetyl-CoA, ktorý sa zmení na citrát a po prenose do cytozolu je použitý k syntéze mastných kyselín. Pentózový cyklus slúži predovšetkým k tvorbe NADPH pre syntézu mastných kyselín. Mastné kyseliny môžu byť adipocytmi prijímané aj z krvi. Pochádzajú z lipoproteínov (chylomikrónov a VLDL) hydrolyzovaných lipoproteínovou lipázou (LPL) na povrchu endotelových buniek krvných ciev. Túto LPL tvoria adipocyty a predávajú ju kapiláram tukového tkaniva. Po aktivácii mastných kyselín na acyl-CoA dôjde pomocou glycerol-3-fosfátu k ich spojeniu na tuky, ktoré sa konečne ukladajú vo vakuolách adipocytov. Ak potrebuje organizmus naopak energiu, začne prebiehať lipolýza. V tomto procese dôjde vo vakuolách adipocytov k mobilizácii tukov, ktoré sú za účasti niekoľkých lipáz hydrolyzované na mastné kyseliny a glycerol. Krok určujúci reakčnú rýchlosť je katalyzovaný hormonsenzitívnou triacylglycerollipázou, lipázou hydrolyzujúcou hlavne di- a triacylglyceroly. Produkty lipolýzy, mastné kyseliny a glycerol prechádzajú potom do krvi. Lipogenéza a lipolýza sú riadené hormónmi. Inzulín podporuje lipogenézu a inhibuje lipolýzu. Stimuluje príjem glukózy v tukovom tkanive prostredníctvom transferu Glut-4 do plazmatickej membrány, podporuje glykolýzu a hlavne pyruvátdehydrogenázovú reakciu. Naviac inzulín indukuje lipoproteínovú lipázu (LPL) a tým znižuje obsah lipidov v krvi za súčasného zvýšenia príjmu mastných kyselín adipocytmi. Simultánne inzulín tiež potlačuje hormónsenzitívnu triacylglycerollipázu. Najdôležitejšími hormonálnymi antagonistami inzulínu v lipolýze sú katecholamíny. Prostredníctvom receptorov β 1 a β 2 stimulujú hormónsenzitívnu lipázu. Rastový hormón (GH) podporuje u adipocytov citlivosť ku katecholamínom a znižuje vnímavosť k inzulínu, čím následne zvýši hladinu mastných kyselín v krvi. Tukové tkanivo je súčasne aj aktívnym endokrinným orgánom. Syntetizuje hormóny a mediátory udržujúce homeostázu energetického metabolizmu a hladiny glukózy. Pri aktívnej lipogenéze a nadbytku tukov sa do krvi vylučuje peptidový hormón leptín, čo signalizuje hypotalamu, že tukové rezervy sú naplnené. Leptín tu inhibuje tvorbu neuropeptidu Y (NPY) a ďalších neuropeptiodov podporujúcich chuť do jedla a príjem potravy. Súčasne leptin podporuje v ostatných tkanivách spotrebu energie a termogenézu. Tiež adiponektín znižuje podobne ako leptín hladinu glukózy. Paralelne produkuje tukové tkanivo estrogény a ďalšie signálne látky. III/4. Regulace biosyntézy hemu, rozdíly mezi hepatocytem a erythroidní buňkou, metabolismus železa. Syntéza hemu prebieha prakticky vo všetkých tkanivách, avšak hlavnými miestami sú erythroidne bunky (asi 85%) a hepatocyty, svalové a ostatné bunky (takmer 15%). Odlišnosť oboch tkanív a kvantitatíve rozdiely v potrebe hemu však vyžadujú úplne odlišné a špecifické regulačné mechanizmy biosyntézy, Prispieva k tomu predovšetkým existencia dvoch génov ALAS, ubikviterna provozní ALAS -1 (N) a erythroidna ALAS-2 (E), s odlišnými chromozovými lokalizáciami a reguláciami expresie. V hepatocytoch, ale aj ostatných somatických bunkách je za bazálnych podmienok syntéza hemu a ALAS nízka. Je však indukovateľná na niekoľkonásobne vyššiu hladinu najrôznejšími vnútornými a vonkajšími faktormi. Syntéza hemu v hepatocytoch je inhibovateľná hemom, resp. hemínom, zatiaľ čo v diferencujúcich erythroidnych bunkách nie a tiež v nich nie je indukovateľná. Hepatocyty potrebujú hem predovšetkým pre zabudovanie do rodiny biotransformačných cytochromov P450 a do cytochromov zaisťujúcich oxidatívnu fosforyláciu v mitochondriách, respektíve energetický metabolizmus. Rýchlosť limitujúci krok biosyntézy hemu v hepatocytoch je na úrovni ALAS-1, ktorá je spätnoväzbovo inhibovaná konečným produktom, „voľným“ hemom („regulačným“ hemom), resp. heminom na niekoľkých úplne odlišných úrovniach: 1. transkripcia 2. translácia 3. enzýmová aktivita 4. transport prekurzorovej enzýmovej molekuly do mitochondrie Vzhľadom ku kompartmentácii a potrebe existujú tri druhy pohotovostných rezerv (poolov) „voľného“ hemu: 1) mitochondriálny (pre cytochromy dýchacieho reťazca), 2) cytozolový: a) riadenie transkripcie, translacie a transportu ALAS-1 do mitochondrii; b) pre aktiváciu cytozolových hemových enzýmov 3) endoplazmatického retikula (pre cytochromy P450, b5 a hemoxygenázu) Hepatocyty udržujú potrebné pohotovostné zásoby hemu kombináciu syntetických a degradačných mechanizmov. Ak prevyšuje koncentrácia hemu množstvo potrebné k potlačeniu syntézy ALAS-1, hem indukuje expresiu mikrosom hemoxygenázy a tým spúšťa aj vlastný katabolizmus (degradáciu). To znamená, že pohotovostná koncentrácia „voľného“ pečeňového hemu je na veľmi nízkej úrovni a je udržiavaná rovnováhou medzi syntetickou aktivitou ALAS-1 a degradačnou aktivitou hemoxygenázy, ktoré sú pod regulačným vplyvom hemu. Regulácia expresie génov ALAS-1 a hemoxygenázy predstavuje „senzorový“ systém pre bunkové monitorovanie zmien veľkosti „neutrálnych“ zásob hemu. Významným regulátorom expresie génu ALAS-1 v hepatocytoch je tiež inzulín, ktorý funguje ako represor expresie genu ALAS-1 na úrovni transkripcie. Na tejto úrovni sa glukóza, ako induktor tvorby inzulínu, uplatňuje ako terapeutický prostriedok u akútnych porfýrií. Transport ALAS do mitochondrií je regulovaný dvomi špecifickými krátkymi sekvenciami aminokyselín, bohatými na cysteín a prolín, ktoré sa viažu s hemom a nazývajú sa hemom regulované motívy (HRM – heme regluatory motifs). HMR leží v zavádzajúcej sekvencii ALAS a tiež hemoxygenáza-1, enzýmov syntézy a degradácie hemu. Pri zvýšenej cytozolovej hladiny hemu dochádza v dôsledku jeho väzby na HRM k inhibícii transportu ALAS- 1 do mitochondrii a k zvýšeniu aktivity hemoxygenázy. V erythroidných bunkách je syntéza hemu podriadená potrebám tvorby hemoglobínu a pri erytropoeze sa objavuje iba v určitom diferenciačnom stupni erythroidných buniek. Po dosiahnutí kompletnej maturácie erytrocytov biosyntéza hemu a hemoglobínu vyhasína. Posledným miestom syntézy hemu aj hemoglobínu je retikulocyt. Hem a hemoglobín potom musí vydržať po celú dobu životnosti erytrocytov, tj. približne 120 dní. Hem v erythroidných bunkách nepôsobí ako spätnoväzobný inhibítor ani aktivity, ani expresie ALAS-2, ale inhibuje vychytávanie iónov železa bunkami z transferrinu (Tf) bez toho, aby ovplyvnil jeho využitie pre hemovú syntézu. V erythroidných bunkách hem zosilňuje transkripciu a transláciu globínových reťazcov. V bezjadrových retikulocytoch slúži iba ako regulátor globínovej translacie a ako prostetická skupina pre zostavovanie molekúl hemoglobínu. Kľúčovým enzýmom v erythroidárnych bunkách je ALAS-2 a hlavným regulátorom jej aktivity je koncentrácia železa. Regulácia biosyntézy hemu je tak úzko spojená s metabolizmom iónov železa a jeho reguláciou. Centrálnym regulačným faktorom erytropoezy a následne biosyntézy hemu aj hemoglobínu je erytropoetin (Epo), ktorý primárne indukuje proliferáciu a diferenciáciu erythroidných progenitorových buniek v odpovedi na stav oxygenácie krvi. Epo sa významne podieľa na zaistení transportu extracelulárnych iónov železa do erythroidných buniek. Zosilňuje väzobnú afinitu IRP-1, centrálneho regulátoru metabolizmu katiónov železa, k IRE v molekulách špecifických mRNA. Aktivácia IRP-1 erytropoetínom je spojená so značným vzostupom hladiny TIR-mRNA a zvýšeným počtom TfR (transferínových receptorov) na povrch erythroidných buniek, čo vedie k zvýšeniu vychytávania iónov železa. Epo indukovaná zvýšená väzba väzba IRP-1 k IRE v 3 ́-neprekladanej (netranslatovanej) oblasti TfR-mRNA zvyšuje jej stabilitu ochranou preds pôsobením špecifických nukleáz. Hem proti tom pôsobí inhibíciou mobilizácie transferrinových receptorov. Erytropoetin väzbou na EpoR stimuluje transkripciu génu ALAS-2. Transkripcia génu ALAS-2 je riadená erythroidnými transkripčnými faktormi, ktoré sú pod vplyvom iónov železa. Hlavná regulačná funkcia syntézy ALAS-2 a tiež hemu je však na úrovni translacie. Regulačné funkcie tu zastávajú ióny železa prostredníctvom tzv. IRE elementov (iron responsive elements). Kontrola syntézy hemu v erythroidných bunkách na odpovedajúcom stupni diferenciácie sa objavuje aj na ďalších stupňoch syntézy, ako je ALAS, PBGD a ferrochelatáza a to prostredníctvom špecifických erythroidných nukleotidových sekvencií v promotorovej oblasti ich génov, ktoré sú cieľom pre väzbu erythroidných transkripčných faktorov. V ostatných tkanivách zaisťuje syntézu hemu pre bunkové potreby provozní ALAS-1 a kontrola jej aktivity zatiaľ nie je známa. Aktivita ALA-syntázy v extrahepatálnych tkanivách väčšinou neodpovedá na induktory ALAS-1 a je rezistentná na inhibíciu hemínom. Jej aktivita je potlačená nedostatkom hemu. Železo (Fe) je možné považovať za kvantitatívne najdôležitejší stopový prvok. V ľudskom tele je obsiahnuté v množstve 4-5g, čo približne odpovedá obsahu železa v jednom bežnom klinci (hřebíku). V organizme je železo prítomné takmer výhradne vo väzbe na proteíny. Zhruba 73% jeho celkového množstva sa nachádza v hemoproteínoch, hlavne hemoglobíne (66%), myoglobíne (6%) a hemových enzýmoch (takmer 1%). Ďalšie 1% železa je viazané v Fe-S komplexoch fungujúcich v dýchacom reťazci, fotosyntéze a ďalších redoxných reťazcoch ako kofaktory. Zvyšných 26% pripadá na proteíny transportu a skladovania železa (transferín a feritín). Metabolizmus železa je kontrolovaný prostredníctvom jeho príjmu do organizmu. V potrave sa železo vyskytuje viazané na proteíny alebo ako voľný ión Fe 3+ . Z doporučenej dávky 10 mg, resp. 15 mg u žien v produktívnom veku, je prijatých len asi 10- 15%, pretože niektoré doprovodné zložky potravy železo ireverzibilne viažu. Resorbované môžu byť len ióny Fe 2+ a preto dochádza na povrchu buniek črevného epitelu pomocou ferireduktázy k redukcii Fe 3+ na Fe 2+ . Redukčné látky v potrave ako askorbát preto podporujú príjem železa. V enterocytoch dochádza k väzbe Fe 2+ na mobilferin a feritin. S transportérmi sa Fe 2+ dostáva do krvi, kde je feroxidázou oxidované na Fe 3+ a následne viazané na transferín. Všetko železo naviazané na hem môže byť resorbované v tenkom čreve a prispieť tak k celkovému príjmu železa do organizmu. Transport. Pre transport železa v krvi je využívaný transferín, β-globulín o hmotnosti 80 kDa. Tento monomérny proteín sa skladá z dvoch rovnakých domén, z ktorých každá môževeľmi pevne naviazať jeden ión Fe 3+ . Za normálneho stavu je na transferínu obsiahnutá železom iba asi 1/3 väzobných miest. Podobné transportné proteíny pre železo sú prítomné aj v iných sekrétoch (sliny, slzy alebo mlieko) ako tzv. laktoferiny. Transferín a laktoferíny udržujú koncentráciu voľného železa v telesných tekutinách na hodnotách pod 10 -10 mol/l, pretože vyššia koncentrácia pôsobí toxicky. Naviac táto nízka hladiny obmedzuje rozmnožovanie baktérií v organizme, ktoré potrebujú voľné železo ako esenciálny rastový faktor. Transferín a laktoferíny sa dostávajú do buniek podobne ako LDL pomocou transferínových receptorov mechanizmy endocytózy spostredkovanej receptormi. Erytropoéza. Najväčšia časť prijatého železa je využitá v kostnej dreni k tvorbe červených krviniek. K zabudovaní Fe 2+ do prefabrikovaného tetrapyrolového skeletu dochádza až v poslednom kroku biosyntézy hému účinkom ferochelatázy (otázka II/34). Recyklácia. V krvi cirkulujú ako súčasť erytrocytov 2,5-3 g železa viazaného na hemoglobín (hemové železo). Behom času však erytrocyty starnú. Ich flexibilita sa následkom poškodenia membránových lipidov a cytoskeletu zhoršuje. Zostarnuté erytrocyty sú zhruba po 120 dňoch pohltené v slezine a ďalších orgánoch makrofágmi a rozložené. Organická časť hemu je pritom oxidovaná na bilirubín (otázka II/35), zatiaľ čo železo prechádza do plazamatickej hotovosti (pool). Množstvo železa denne znovuzískaného rozkladom hemu vysoko prevyšuje jeho príjem v čreve. Skladovanie. Prebytočné železo je zabudované do feritínu a v tejto forme uložené v pečeni, slezine a kostnej dreni. Molekula feritín je zložená z 24 jednotiek a má tvar dutej gule. Prijíma ióny Fe 2+ , ktoré sú potom oxidované na Fe 3+ a uložené vo vnútri gule ako tzv. ferihydrát. Týmto spôsobom môže každá molekula feritínu prijať až niekoľko tisíc iónov železa. Prebytočné železo predáva feritin na iný zásobný proteín hemosiderín, z ktorého sa však ťažko mobilizuje. Vylučovanie. Železo odchádza z tela stolicou (žlč, črevné bunky), ale tiež v moči, potu a deskvamovanej pokožke. Pri krvácaní stráca organizmus s každým ml krvi asi 0,6 mg železa. Preto majú ženy v reprodukčnom veku v súvislosti s periodickým menštruačným krvácaním vyššiu potrebu železa. III/5. Mechanismus účinku hormonů regulujících vodní a minerálový metabolismus. Elektrolyty a ďalšie komponenty v plazme s nízkou molekulárnou hmotnosťou sa vylučujú do primárneho moču glomerulárnou filtráciou. Väčšina látok sa naspäť vracia do plazmy pomocou tubulárnej resorpcie. Resorpcia určuje množstvo látok, ktoré sa nakoniec vylúčia močom. Vápenaté a fosfátové ióny sú skoro kompletne resorbované z primárneho moču pomocou aktívneho transportu (za využitia ATP). Pomer resorbovaného vápniku je viac ako 99%, pričom v prípade fosfátu je to 80-90%. Rozsah v akom sú tieto ióny resorbované je regulované účinkom 3 hormónov: parathyrín, kalcitonín a kalcitriol. Peptidový hormón parathyrín (parathyroidný hormón, PTH), ktorý je produkovaný v príštitných telieskach, stimuluje resorpciu vápniku v ľadvinách a tiež inhibuje resorpciu fosfátu. V spojení s účinkom hormónu na kosti (otázka III/17) vedie jeho účinok zvýšeniu koncentrácie vápniku v plazme a znižuje hladinu fosfátov v plazme. Kalcitonin, peptidový hormón produkovaný C-bunkami štítnej žľazy, inhibuje resorpciu vápniku aj fosfátu. Tým znižuje celkový obsah týchto iónov v plazme. Kalcitonín je teda antagonistom paratyrínu v metabolizme vápniku. Kalcitriol, steroidný hormón produkovaný v ľadvinách, stimuluje resorpciu vápniku aj fosfátu a teda zvyšuje ich koncentrácie v plazme. Kontrolovaná resorpcia sodných iónov z primárneho moču je jednou z najdôležitejšou funkciou ľadvín. Resorpcia sodíka je veľmi efektívna, s viac ako 97% resorbovanými. Viaceré mechanizmy sa pri tom uplatňujú: časť sodíku je vychytávaná pasívne v proximálnych tubuloch pomocou medzibunkových spojení (paracelulárne). Okrem toho, existuje sekundárne aktívny transport spolu s glukózou a aminokyselinami. Tieto dve cesty sú zodpovedné za 60-70% resorbovaného sodíku. Vzostupná časť Henleovej kľučky obsahuje ďalší transportér, ktorý funguje elektroneutrálne a vychytáva jeden sodný ión, jeden draselný spolu s 2 chloridovými iónmi. Tento symport je závislý na aktivite Na + /K + -ATPázy, ktorá pumpuje sodný ión resorbovaný z primárneho moču späť do plazmy výmenou za draselnýión. Steroidný hormón aldosterón zvyšuje vychytávanie sodíku, hlavne v distalnom tubule, pričom atriálny natriuretický peptid (ANP) produkovaný v srdcovej sieni ho redukuje. Medzi inými funkciami aldosterón indukuje Na + /K + -ATPázu a iné sodíkové transportéry na luminálnej strane buniek. Voda sa resorbuje v proximálnom tubule je pasívny proces, v ktorom voda nasleduje osmoticky aktívne častice, hlavne sodíkové ióny. Citlivá regulácia vodného vylučovania (diurézy) sa odohráva v zberných kanálikoch, kde peptidový hormón vasopressin (antidiuretický hormón, ADH) je aktívny. Podnecuje resorpciu vody pomocou stimulácie transportu vody akvaporínmi do buniek tubulov pomocou V 2 receptorov. Nedostatok ADH vedie k chorobe zvanej diabetes insipidus, pri ktorej jedinej produkuje až 30 l finálneho moču denne. III/6. Hormonální regulace energetického metabolismu. U vyšších organizmov sú metabolické a iné procesy (rast, diferenciácia, homeostáza,...) kontrolované hormónmi. V závislosti na type hormónu je hormonálny signál prenášaný na cieľovú bunku rôznymi spôsobmi. Hydrofóbe (lipofilné) hormóny prechádzajú cez membránu a pôsobia v bunkovom jadre, pričom hydrofilné (polárne) hormóny pôsobia na membránové receptory. Hydrofóbne hormóny, medzi ktoré patria steroidné hormóny, tyroxín a retinoidy, sa viažu na receptorové proteíny vo vnútri cieľových buniek. Vzniknutý komplex hormónu a receptoru potom ovplyvňuje transkripciu špecifických génov v bunkovom jadre. Hydrofilné látky, medzi ktoré patria hormóny odvodené od aminokyselín, peptidové a proteínové hormóny, sa viažu na receptory na bunkovej membráne. Naviazanie hormónu na tento typ receptoru spúšťa signálnu, ktorý sa prenáša do vnútra bunky, kde kontroluje procesy, ktoré vyvolávajú účinok hormónu (signálna transdukcia). Pečeň hraje hlavnú úlohu v udržiavaní homeostázy glukózy v organizme. Ak klesne hladina glykémie, uvoľní pečeň glukózu do krvi a keď sa zvýši glykémia, odoberá glukózu z obehu a metabolizuje ju na iné metabolity. Viaceré hormóny z obidvoch skupín regulujú tieto procesy. Glykogén je zásobná forma glukózy v pečeni a svaloch. Rýchlosť syntézy glykogénu je podmienená glykogén syntázou a jeho rozklad je katalyzovaný glykogén fosfatázou. Ak sa zníži glykémia, peptidový hormón glukagón sa uvoľňuje do krvi. Týmto sa aktivuje degradácia glykogénu, následne uvoľnenie glukózy do obehu a zároveň sa inhibuje aj syntéza glykogénu. Glukagón sa viaže na membránové receptory a za pomoci G-proteínu aktivuje enzým adenylát cyklázu, ktorá produkuje druhého posla cAMP z ATP. cAMP sa viaže na ďalší enzým, proteinkinázu A (PK-A) a aktivuje ju. PK-A ovplyvňuje viaceré cieľové molekuly. Pomocou fosforylácie premieňa aktívnu formu glykogén syntázy na neaktívnu formu, čím zastavuje syntézu glykogénu. Ďalej aktivuje ďalšiu proteinkinázu, ktorá následne premieňa neaktívnu formu glykogén fosforylázy pomocou fosforylácie na jej aktívnu formu. Aktívna fosofryláza uvoľňuje glukózu-1-fosfát z glykogénu, ktorá po premene na glukózu-6-fosfát dodáva do obehu voľnú glukózu. Okrem toho, pomocou inhibítora proteín fosfatázy, aktívna PK-A inhibuje inaktiváciu glykogén fosforylázy. Keď sa zníži hladina cAMP v bunke, aktivujú sa fosfoproteínové fosfáty, ktoré defosforylujú rôzne fosfoproteíny spomínanej kaskády, čím sa zastavuje degradácia glykogénu a opäť sa spúšťa syntéza glykogénu. Na rozdiel od glukagónu, zvyšuje peptidový hormón inzulín syntézu glykogénu a inhibuje jeho degradáciu. Cestou viacerých medzičlánkov, inhibuje proteínkinázu GSK-3 a tým zabraňuje inaktiváciu glykogén syntázy. Okrem toho, inzulín znižuje hladinu cAMP v bunke, pomocou aktivácie cAMP fosfodiesterázy (PDE). Ak sa vyčerpá zásoba pečeňového glykogénu, udržiava steroidný hormón kortizol glykémiu pomocou aktivácie premeny aminokyselín na glukózu (glukoneogenéza). V bunkovom jadre sa komplex kortizolu s jeho receptorom viaže na promotorové regióny kľúčových enzýmov glukoneogenézy a podporuje ich transkripciu. Aktívne enzýmy vznikajú transláciou vzniknutej mRNA. III/7. Biochemické pochody při trávení živin. Prijatá strava je najprv mechanicky spracovaná (rozkusaním) a tým premenená na menšie časti. Je ďalej zmiešaná so slinami a spolknutá. Jednotlivé zložky potravy štiepené pomocou enzýmov a to enzýmami prítomnými v tráviacich šťavách a tiež pankreatických a črevných šťavách. Enzýmy v tráviacom trakte sú predovšetkým hydrolázy, ktoré jednotlivé komponenty stravy štiepia na menšie fragmenty, pri tomto deji je voda paralelne inkorporovaná do reakčných produktov. Štiepením vzniknuté produkty (aminokyseliny z proteínov, monosacharidy z polysacharidov a oligosacharidov, mastné kyseliny, monoacylglyceroly a cholesterol z tukov, komponenty z nukleových kyselín, vitamíny, anorganické látky a iné) sú resorbované epitelom tenkého čreva a transportované portálnym obehom do pečene. Látky potom putujú krvným riečiskom k jednotlivým orgánom. Tukové látky sú najprv vo forme chylomikier uvoľňované do lymfatického obehu a odtiaľ do krvi. Vláknina (celulóza, lignín) prechádza tráviacim traktom bez akejkoľvek metabolickej premeny; nie je preto črevom resorbovaná, ale významne tam viaže vodu. Skôr než je vylúčená stolicou, plní vláknina dôležitú fyziologickú úlohu. Cukry sa začínajú degradovať štiepením polysacharidov (glykogén, škrob) už v ústach; v slinách je obsiahnutá α-amyláza, ktorá tento proces zahajuje. Vlastná degradácia prebieha až v prítomnosti pankreatickej α-amylázy. Vytvorené oligosacharidy sú ďalej rozštiepené črevnými glykosidázami až na monosachaidy. Bielkoviny sú najprv v žalúdku denaturované prítomnou kyselinou HCl a následne degradované enzýmami obsiahnutými v žaludočnej šťave (pepsínom a chymosínom). Ďalej v čreve pankreatickými endopeptidázami (obsahujú trypsín, chymotrypsín a elastázy). Vzniknuté peptidy sú ďalej štiepené exopeptidázami (karboxypeptidázami a endopeptidázami) až na aminokyseliny. Tuky sú heterogénna skupina hydrofóbnych látok (jedná sa predovšetkým o triacylglyceroly, fosfolipidy, cholesterol), ktoré pochádzajú rôznorodou premenou. Za ich štiepenie sú zodpovedné lipázy. Štiepenie tukov vyžaduje prítomnosť žlčových kyselín, ktoré pôsobia ako tenzidy a umožnia interakciu tukovej kvapôčky s lipázou. Transport tukových komponentov začína v lymfatických cestách, odtiaľ potom látky pokračujú thorakálnym duktom do krvi (vo forme chylomikier). Krátko po prijatí potravy sú v krvnom riečisku najprv chylomikra. Nukleové kyseliny sú štiepené nukleázami pankreasu a tenkého čreva. Postupne sa uvoľňujú purínové a pyrimidínové bázy, ribózy a deoxyribózy, kyselina fosforečná, ktpré sú v jejunu postupne reabsorbované. Anorganické látky a vo vode rozpustné vitamíny sú hydrofilné a sú preto reasorbované priamo v čreve. Vitamíny rozpustné v tukoch sú resorbované rovnako ako tuky. Pri transporte v krvi sú naviazané na albumín, prípadne globulín. Vzniknuté jednoduchšie molekuly (z cukrov, bielkovín a tukov) väčšinou postupne prechádzajú rovno cez epitel čreva (v jejune a illeu) a sú transportované portálnym obehom do pečene. Tam prebieha ich metabolická premena a následný transport vzniknutých produktov k rôznym orgánom. V cytoze aj mitochondriách cieľových buniek sú molekuly ďalej oxidované s cieľom získať energiu vo forme ATP alebo sú využívané priamo pre stavbu tkanív. Sliny sú produkované slinnými exokrinnými žľazami. Sú hypotonické voči plazme, pH je 7 a denná produkcia je 1-1,5 l. Sliny obsahujú anorganické látky: vodu a ióny (Na + = 18 mmol/l, K + = 28 mmol/l, Cl - = 25 mmol/l, HCO 3 - = 8 mmol/l). V slinách sú aj organické látky: mucín, glykoproteíny s vysokým obsahom cukornej zložky, ktorá určuje viskozitu slín, a enzým α.amylázu, ktorá čiastočne štiepi polysacharidy, minoritné sú rôzne ďalšie bielkoviny (imunoglobulíny, vazoaktívny intestinálny peptid, lyzosomy – antibakteriálna zložka slín, kalikreiny, ktoré ovplyvňujú produkciu bradykininu). Lipáza prítomná v slinách nemá pre trávenie tukov veľký význam. Sliny sú produkované až po vtoku (influxu) vápenatých iónov do bunky. Množstvo aj chemické zloženie slín sú riadené cholinergnou, adrenergnou a peptidergnou stimuláciou. Potrava prichádzajúca do žalúdka sa tam mieša so sekrétmi vytvorenými parietálnymi bunkami (veľmi kyslý sekrét tvorený HCl, obsahuje aj „vnútorný faktor“, ktorý sa viaže na vitamín B 12 ) a hlavnými bunkami (slabo alkalický sekrét s pepsinogénom). Žalúdočná šťava (pH 1,2-3,0, denná produkcia 2 až 3 litre). Obsahuje minerálne soli (Na + = 18 mmol/l), K + = 28 mmol/l, Cl - = 25 mmol/l) a kyselinu chlorovodíkovú. Sekrécia HCl vyžaduje aktívny enzým karbonátdehydratázu (tiež označovaný ako karboanhydráza alebo karbonátanhydráza), ktorá katalyzuje reakciu H 2 0 + CO 2 → H + + HCO 3 - , krycie bunky koncentrujú protóny (výmenou za draselné ióny – transport vyžaduje energiu), spolu s iónmi Cl - , ktoré prenikajú pasívne do lumen. Za secernovaný vodíkový ión do lumen opúšťa bunku na seróznej strane anión HCO 3 - , ktorý ide do krvi výmenou za chloridový anión. Vstup draselných katiónov z krvi do bunky a ich zmena za sodíkové ióny sú riadené Na/K-ATPázou. Ak však nie je potreba H + , potom je žalúdočná sliznica chránená aktívne secernovanými iónmi HCO 3 - . HCl aktivuje neaktívny enzým pepsinogén, čím vznikne aktívny pepsín. V žalúdočnej šťave sú aj ďalšie enzýmy – chymozín a lipáza. Bielkovina gastroferrin viaže ióny železa. Sekrécia žalúdočnej šťavy je podmienená množstvom podnetom; príjem potravy ústami ovplyvňuje reflexne produkciu šťavy – uvoľnený acetylcholín zvýši koncentráciu vápenatých iónov a tým sa v špecializovaných žalúdočných bunkách ovplyvní produkcia gastrínu a histamínu. Na produkciu žalúdočnej šťavy pôsobia aj rôzne chemické zložky z natrávenej potravy (chymu) a rôzne peptidové hormóny, ktoré aktivujú ďalšie uvoľnenie gastrínu; ten potom prestupuje do krvi (ako endokrinný faktor). Odtiaľ sa však vracia späť a pritom aktivuje produkciu žalúdočnej šťavy. Zmena pH začne výdaj gastrínu tlmiť. Na produkcií žalúdočnej šťavy sa podieľajú aj sekréty črevnej sliznice; uvoľnenie je podmienené prestupom chymu do čreva. Žalúdočná sliznica je pokrytá hlienom (zmes proteoglykanov a glykoproteínov) aj ďalšími bielkovinami, imunoglublínom A a rôznymi anorganickými látkami – hlavne HCO 3 - , ktorý chráni sliznicu proti účinku pepsínu a HCl. Glykoproteíny zadržiavajú vodu a tým uľahčujú posun potravy v tráviacom trakte. Pankreatická šťava je produkovaná pankreasom. Jej pH je 7,5-8,8, denná produkcia 0,7-2,5 l. Iónové zloženie: katióny: Na + = 140 mmol/l, K + = 8 mmol/l; anióny: Cl - = 120 mmol/l a HCO 3 - = 35 mmol/l. HCO 3 - ako silná konjugovaná zásada najprv alkalizuje obsah potravy prichádzajúci do žalúdka. Po zmene pH dôjde k aktivácií množstva enzýmov obsiahnutých vpankreatickej šťave. Tým je potom zahájené ďalšie štiepenie látok prijatých v potrave. Bielkoviny sú štiepené proteolytickými enzýmami: trypsínom, chymozínom, elastázou a karboxypeptidázami. V pankrease sú produkované neaktívne proenzýmy, ktoré sú najprv v tenkom čreve aktivované: trypsinogén je aktivovaný črevnou enteropeptidázou a vzniká trypsín, ktorý ďalej aktivuje chymotrypsinogén, proelastázu a prokarboxypeptidázu. Aby nedošlo k predčasnej aktivácií v pankrease, je pankreatický inhibítor trypsínu, ktorý vytvorí komplex s trypsínom. V krvi prítomný α 1 -antitrypsín blokuje elastázu, polysacharidy rozštiepi pankreatická α-amyláza na menšie oligosacharidy. Nukleové kyseliny štiepia ribonukleázy a deoxyribonukleázy. Triacylglyceroly rozštiepi po aktivácií kolipasou pankreatická lipáza, fosfolipáza A2 uvoľní mastnú kyselinu viazanú na druhý uhlík vo fosfolipidoch a estery cholesterolu sú degradované špecifickou esterázoi. Produkcia pankreatickej šťavy je hormonálne riadená sekretínom a pankreozyminom (cholecystokininom); podnetom k sekrécií sú tukové látky v natrávenej potrave. Žlč sa tvorí v pečeni a následne je koncentrovaná v žlčníku. pH je 6,9-7,7 a denná produkcia je 0,6 l. Iónové zloženie je: Na + = 18 mmol/l, K + = 28 mmol/l, Cl - = 25 mmol/l a HCO 3 - = 30 mmol/l. Prítomný anión HCO 3 - alkalizuje obsah natrávenej potravy prichádzajúcej zo žalúdku. Žlč obsahuje žlčové kyseliny (kyselina cholová a chenodeoxycholová), fosfolipidy (predovšetkým fosfatidylcholín), bilirubín a cholesterol. Sekundárne žlčové kyseliny (7-deoxycholová a litocholová) vzniknú až pôsobením črevných baktérií. Primárne aj sekundárne žlčové kyseliny sa enterohepatálnym obehom dostávajú späť do pečene. Produkciu žlče v pečeni zvyšuje sekretín a soli žlčových kyselín. Cholecystokinin zvyšuje kontrakciu žlčníku; aktivátorom sú tukové látky v natrávenej potrave, ale aj vaječný žĺtok alebo zvýšená koncentrácia MgSO 4 . Tenké črevo produkuje sekrét nasledujúceho iónového zloženia: katióny: Na + = 115 mmol/l, K + = 5 mmol/l; anióny: Cl - = 90 mmol/l. Črevný sekrét má pH 6,5-8 a denná produkcia je okolo 3 l. V kartáčovom leme enterocytov sú membránovo viazané proteíny: aminopeptidázy a dipeptidázy, ktoré štiepia peptidy, polynuklotidázy a nukleosidázy, ktoré štiepia nukleové kyseliny, glykosidazy (disacharidazy) štiepia rôzne oligosacharidy, fosfolipazy rozložia fosfolipidy a alkalická fosfatáza uvoľňuje kyselinu fosforečnú. III/8. Biochemické funkce hepatocytu a jater, možnosti biochemické diagnostiky poškození hepatocytu a jaterních funkcí. Pečeň patrí so svojou hmotnosťou 1,5 kg k najväčším orgánom ľudského tela. Hoci predstavuje len 2-3% telesnej hmotnosti, podieľa sa na spotrebe kyslíku 25-30%. K najdôležitejším činnostiam pečene patrí: 1. Príjem živín, ktoré z čreve privádza vena portae (vrátnicová žila) 2. Metabolizmus – biosyntéza telu vlastných zlúčenín, ich ukladanie, premena a rozklad na molekuly schopné vylučovania. Pečeň je hlavne zodpovedná za biosyntézu a rozklad takmer všetkých plazmatických bielkovín. 3. Zásobenie organizmus metabolitmy a stavebnými látkami. Ich plazmatická koncentrácia je často kontrolovaná práve pečeňou. 4. Detoxikácia toxických zlúčenín biotransformáciou. 5. Exkrécia látok žlčou 6. Účasť na acidobázickej rovnováhe organizmu 7. Účasť na reakciách nešpecifickej imunity zameraných proti cudzorodým látkam a organizmom prostredníctvom Kupfferových buniek 8. Aktivácia a inaktivácia hormónov Pečeň zasahuje do všetkých oblastí metabolizmu látok. Jej aktivita smeruje predovšetkým k vyrovnaniu výkyvov v koncentrácií metabolitov v plazme, čo vyžaduje konštantné zásobenie periférnych tkanív (homeostáza).  Sacharidy – pečeň prijíma glukózu a ďalšie monosacharidy z plazmy. Glukóza sa potom ukladá vo forme polysacharidu glykogénu alebo sa mení na mastné kyseliny. Pri poklese hladiny krvného cukru vylúči pečeň štiepením glykogénu opäť glukózu Ak dôjde k vyčerpaniu zásob glykogénu, môže sa glukóza tvoriť glukoneogenézou z laktátu , glycerolu alebo uhlíkových kostier aminokyselín.  Lipidy – mastné kyseliny sa v pečeni tvoria z acetátových jednotiek, čo vedie k produkcií tukov a fosfolipidov, ktoré nasledovne vo forme lipoproteínov vstupujú do krvi. Pečeň dokáže premeniť mastné kyseliny na ketolátky a opäť ich vylúčiť. Pečeň syntetizuje cholesterol, ktorý je ako súčasť lipoproteínov predávaný do tkanív. Prebytočný cholesterol sa mení na žlčové kyseliny a je vylučovaný žlčou.  Aminokyseliny a proteíny – pečeň kontroluje hladinu aminokyselín v plazme. Prebytočné aminokyseliny sú odbúravané a ich dusík sa v priebehu močovinového cyklu mení na močovinu, ktorá je vylučovaná ľadvinami. Uhlíkové skelety aminokyselín vstupujú do intermediárneho metabolizmus a sú využívané pri syntéze glukózy alebo produkcií energie. Väčšina plazmatických proteínov sa v pečení tvorí aj rozkladá.  Biotransformácia – steroídne hormóny a bilirubín rovnako ako liečivá, etanol a iné xenobiotiká sú v pečeni pomocou transformačných reakcií inaktivované a premenené na polárnejšie metabolity.  Zásobáreň – pečeň ukladá energetické rezervy a stavebné látky, minerály, stopové prvky a vitamíny, hlavne železo, retinol, vitamíny A, D, K, kyselinu listovú a B 12 . Ústredným miestom intermediárneho metabolizmu je zhruba 3.10 11 pečeňových buniek a z nich hlavne hepatocyty, na ktoré pripadá asi 80% bunkovej hmoty pečene. Ďalšie bunky v pečeni predstavujú epitelové bunky, Kupfferové bunky a stelátové (Itové) bunky. Hepatocyty sú v tesnom kontakte s krvou prichádzajúcou vrátnicovou žilou a pečeňovou tepnou, ktorá sa po prietoku tzv. sinusoidmi opäť vracia do centrálnej žily pečeňového lalôčiku. Hepaotocyty vykonávajú podľa svojej lokalizácie pozdĺž intrahepatálnych kapilár (sinusoidov) rôzne metabolické funkcie (metabolické zóny). Rozlišujeme peroportálne hepatocyty a perivenózne hepatocyty. Ochorenie pečene vyvoláva zmeny mnohých biochemických parametrov v sére. Laboratórne testy poskytujúce informáciu o rôznych funkciách pečene a sú dôležité pre diagnostiku ochorení pečene. V dôsledku poškodenia cytoplazmatickej membrány, napr. zánětom alebo hypoxiou, dochádza k zvýšeniu jej priestupnosti a do extracelulárneho priestoru sa uvoľňujú enzýmy lokalizované v cytoplazme. Najcitlivejším indikátorom porušenia membrány hepatocytu je zvýšený únik alaninaminotransferázy (ALT) do cirkulácie. Ďalšími enzýmami, ktoré prenikajú do cirkulácie z hepatocytu, je cytoplazmatický izoenzým aspartátaminotransferáza (cAST) a pečeňový izoenzým laktátdehydrogenázy (LD 5 ). Zvýšenie aktivity cytoplazmatických enzýmov v sére je známkou reverzibilného poškodenia hepatocytu. Pri závažnejšom ochorení pečene sprevádzaným rozpadom hepatocytu (nekrózou) sa do cirkulácie dostávajú nielen cytoplazmatické enzýmy, ale aj enzýmy lokalizované v mitochondriách. Diagnostický význam má predovšetkým glutamátdehydrogenáza (GMD) a mitochondiálny izoenzým AST (mAST). Nález zvýšených aktivít mitochondriálnych enzýmov svedčí pre ireverzibilne, prognosticky závažné postihnutie pečene. Cholestáza môže vznikať vzniknúť z mechanických príčin (obštrukcia žlčových ciest konkrementom alebo tumorom) alebo z poruchy funkcie, napr. zánětom, pôsobením niektorých liekov alebo na podklade dedičnej poruchy. Cholestáza je sprevádzaná zvýšením aktivity enzýmov nachádzajúcich sa v membráne endotelu žlčovodov a v kanalikulárnej membráne hepatocytov a poruchou odtoku bilirubínu do čriev. V klinickej praxi sa bežne vyšetrujú enzýmy alkalická fosfatáza (ALP) a γ- glutamyltransferáza (GGT), ďalej bilirubín v krvi a moči a urobilinogén v moči. Intenzitu proteosyntetických funkcií pečene odráža predovšetkým stav zrnitého endoplazmatického retikula., kde prebieha tvorba väčšiny plazmatických bielkovín, ale aj syntéza tzv. „exportných proteínov“ ako sú niektoré enzýmy (napr. cholinesteráza) a koagulačné faktory. Stanovenie týchto analytov má význam predovšetkým v prípade chronických pečeňových ochorení. Na rozdiel od enzýmov cytoplazmatických a mitochondriálnych, ktorých aktivita sa pri poškodení pečene zvyšuje, sa pokles proteosyntézy prejaví ich znížením. Pre diagnostické účely sa používa predovšetkým stanovenie sérovej cholinesterázy, sérového albumínu alebo transferínu a koagulačných faktorov. Alaninaminotranferáza (ALT) katalyzuje transaminačnú reakciu, pri ktorej sa reverzibilne prenáša aminoskupina z alaninu na 2- oxoglutarát za vzniku pyruvátu a glutamátu, pričom ako kofaktor pôsobí pyridoxalfosfát. ALT je obsiahnutá najviac v pečeni, v iných orgánoch (kostrový sval, myokard a iné) je jej aktivita o veľa nižšia. Na rozdiel od AST je lokalizovaná iba v cytoplazme. Stanovenie ALT je citlivým a relatívne špecifickým testom pre poškodenie hepatocytu. Jej aktivita v sére sa zvyšuje už pri malom poškodení hepatocytu, ktoré je spôsobené zvýšenou priepustnosťou cytoplazmatickej membrány. U záňetu pečene (napr. virová hepatitída) je zvýšenie ALT najčastejším indikátorom porušenia celistvosti membrány hepatocytu. Sledovanie ALT je vhodné pre monitorovanie priebehu ochorenia. Fyziologické hodnoty S-ALT u muža sú do 0,80 μkat/l a u ženy do 0,60 μkat/l. Aspartátaminotransferáza (AST) katalyzuje reverzibilný prenos aminoskupiny z aspartátu na 2-oxoglutarát, pričom kofaktorom je pyridoxalfosfát. AST sa vo väčšej miere vyskytuje v mnohých orgánoch – v pečeni, myokardu, kostrovom svalstve, ľadvinách, pankrease a v erytrocytoch. Existuje vo forme dvoch izoenzýmov – mitochondriálneho, ktorý je prítomný v mitochondriách a predstavuje asi 70% a cytoplazmatického, lokalizovaného v cytoplazme, ktorý je zastúpený asi z 30%. Cytoplazmatická frakcia sa uvoľňuje ľahko aj pri miernom poškodení hepatocytov a to pri narušení permeability ich bunkovej membrány. Mitochondriálna frakcia sa dostáva do krvi až pri nekróze hepatocytu. Výrazné zvýšenie aktivita AST v sére je preto známkou rozpadu hepatocytov, pretože do cirkulácie sa uvoľňujú obe izoenzýmy. Pretože AST nie je špecifická iba pre pečeň, jej zvýšenie môže sprevádzať aj poškodenie kostrového svalstva a myokardu. AST stúpa v krvi v prípade akútneho infarktu myokardu a po operáciách srdca, ale aj po dlhodobej fyzickej námahe. Stanovenie AST falošne pozitívne ovplyvňuje hemolýza, pretože je obsiahnutá v pomerne vysokom množstve v erytrocytoch. Fyziologické hodnoty S-AST u muža do 0,85 μkat/l a u ženy do 0,60 μkat/l. Aminotransferázy sa významne uplatňujú v klinicko-biochemickej diagnostike pečeňových ochorení. Pre akútnu vírusovú hepatitídu je charakteristické mnohnásobné zvýšenie katalytickej koncentrácie AST a ALT. Vzostup na 2-3 násobné hodnoty je zaznamenávaný už v prodromálnom štádiu, vrcholí 7.-12. deň po nástupe ikteru (maximum až 100 μkat/l). Normalizácia hladín je zaznamenávaná väčšinou 5.-8. týždeň. Výrazne (rádovo desaťnásobne), ale len krátkodobo bývajú transaminázy zvýšené pri ťažkých biliárnych kolikách. Ostatné pečeňové lézie sú spravidla sprevádzané miernejším, maximálne 5-násobným vzostupom aktivity a pri chronických ochoreniach pečene bývajú aktivity transamináz často a len tesne nad hornou hranicou referenčného rozmedzia. Všeobecne sa dá povedať, že miera vzostupu transamináz dobre odráža rozsah pečeňového poškodenia. Je však treba mať na pamäti, že pri úbytku funkčného pečeňového tkaniva, napr. pri cirhóze pečene, sa môže množstvo buniek, z ktorých sa môžu transaminázy uvoľniť, znížiť na toľko, že sérové aktivity transamináz spadajú do refernčného rozmedzia alebo len tesne nad neho aj pri rozsiahlej pečeňovej lézii. S miernym nešpecifickým vzostupom oboch transamináz sa môžeme stretnúť aj po intenzívnej námahe (dochádza k ich uvoľneniu z kostrového svalstva) a tiež u obéznych osôb. Pre stanovenie koncentrácie katalytickej aktivity AST a ALT je doporučená metóda založená na princípe Warburgovho optického testu. γ-glutamyltransferáza (GGT) je kľúčovým enzýmim γ-glutamylového cyklu, ktorý zabezpečuje transport niektorých aminokyselín a peptidov cez bunkovú membránu z extracelulárnych tekutín do buniek. GGT katalyzuje prenos γ-glutamylovej skupiny: z γ-glutamylpeptidov na iné peptidy, aminokyseliny alebo vodu. Donorom γ-glutamylového zvyšku je tripeptid glutathion (γ-glutamylcysteinylglycín) nachádzajúci sa v bunkách živočíchov, rastlín aj baktérií. Chráni organizmus pred oxidačným stresom (podieľa sa na odstraňovaní peroxidu vodíka). je obnovovaný reakciou katalyzovanou glutathionreduktázou. GGT sa vyskytuje na membránach buniek s vysokou sekréciou alebo absorpčnou kapacitou, v pečeni (v hepatocytoch a membránach buniek výstelky žlčových ciest), proximálnych tubuloch ľadvín, enterocytov, pankreasu,... Syntézu GGT indukujú niektoré látky (barbituráty, antidperesíva, alkohol). GGT sa tiež môže uvoľniť z membrán detergentným pôsobením, napr. žlčových kyselín alebo alkoholu. Zvýšenie GGT je typické predovšetkým pre poškodenia hepatobilárneho traktu. Patrí medzi ním intrahepatálna a extrahepatálne cholestáza (v týchto prípadoch je zvýšená aj alkalická fosfatáza); hepatocelulárne poškodenie (akútne a chronické pečeňové ochorenia); poškodenie pečene z chronického požívania alkoholu (zvýšenie je aj u alkoholikov aj v prípade, keď ešte nie je poškodená pečeň); nádory pečene a pankreasu. Fyziologické hodnoty fS-GGT u mužov je 0,14-0,84 μkat/l a u žien 0,14-0,68 μkat/l. Fyziologicky sú vyššie hodnoty GGT u mužov vzhľadom k vyššiemu obsahu v prostate. Ďalším markrom je karbohydrát deficintný transferín (CDT). Transferín obsahuje ako glykoproteín vo svojej molekule väčšinou 4-6 zvyškov kyseliny sialovej. Pri chronickom abusu alkoholu (60 g alkoholu za deň po dobu aspoň 2-3 týždňov) sa zvyšuje podiel transferínu, v ktorého štruktúre chýba kyselina sialová (0-2 sialové kyseliny na molekulu) – tzv. karbohydrát deficientný transferín (CDT). Za známku chronického abusu alkoholu sa považuje prekročenie viac ako 6%-ného podielu CDT z celkového transferínu. Hladina CDT zostáva zvýšená ešte asi 2 týždne od začiatku abstinencie. III/9. Biotransformace endogenních a exogenních látek, typy biotransformačních procesů, toxické a kancerogenní látky v životním prostředí. Organizmus prijíma v potrave alebo z životného prostredia, hlavne kožou a pľúcami cudzorodé látky, ktoré sú buď prírodného pôvodu(xenobiotiká) alebo umelo vytvorené človekom. Mnoho z týchto látok sú toxické, hlavne vo vysokých koncentráciách. Organizmus ale disponuje účinnými mechanizmami inaktivujúcimi cudzorodé látky pomocou biotransformácií, aby mohli byť nasledovne vylúčené. Biotransformačné procesy sú podobné tým, ktoré aktivujú a pripravujú k exkrécií telu vlastné substancie, akými sú žlčové farbiva a steroídne hormóny. Biotransformácia prebieha prevažne v pečeni, ale aj v čreve a ľadvinách. Reakcie I. fázy (pozmeňujúce reakcie) prevádzajú funkčné skupiny na málo reaktívne nepolárne molekuly alebo pozmeňujú už existujúce funkčné skupiny. V mnohých prípadoch tak vznikne možnosť reakciami II. fázy konjugovať cudzorodé látky s polárnymi molekulami. Väčšinou dôjde v priebehu reakcií I. fázy k zníženiu biologickej aktivity alebo toxicity („detoxikácia“). Niektoré látky však získajú práve pozmeňovacou reakciou biologickú aktivitu (napr. benzopyrén) alebo pozmenením stávajú toxickejšími než pôvodné zlúčeniny (zvýšenie toxicity). Najdôležitejšie biotransformačné reakcie sú náseldujúce:  Hydrolytické štiepenie éterových, esterových a peptidových väzieb (napr, hydrolýza analgetika acetylsalicilátu)  Oxidácia - Hydroxylácia, tvorba epoxidov, sulfoxidová väzba, dealkylácia, desaminácia. Tak je napr. oxidovaný etanol na etanal, benzén na fenol a toluol (metylbenzol) na kyselinu benzoovú. Hydroxyláciou sa psychofarmakum diazepam stáva vylúčiteľným.  Redukcia karbonyl-, azo- alebo nitro- zlúčenín, dehalogenizácia  Metylácia  Desulfurizácia Reakcie prebiehajú na hladkom endoplazmatickom retikule. Mnoho týchto oxidačných reakcií katalyzujú systémy cytochrómu P450. Tieto monooxygenázy sú indukované svojimi lipofilnými substrátmi a väčšinou vykazujú širokú špecifitu. Reakcie II. typu (tvorba konjugátu) pripájajú svoje substráty (bilirubín, steroídne hormóny, farmaka, produkty reakcií I. fázy) prostredníctvom esterovej alebo amidovej väzby na vysoko polárne nenasýtené molekuly. Zúčastňované enzýmy sú výhradne transferázy a ich produkty sa nazývajú konjugáty. Najčastejšou formou tvorby konjugátu je spojenie s glukuronátom (GlcUA) na O alebo N-glukuronid. Koenzýmom tejto reakcie je uridínfosfátglukuronát nazývaný „aktívny“ glukuronát. Spojenie s aniónom glukuronát mení nepolárnu (hydrofóbnu) molekulu na viac polárnu, ktorá sa stáva dostatočne rozpustnou vo vode a schopnou exkrécie. Príkladom môže byť glukuronizáciu tetrahydrokortizolu, metabolitu kortikoidu kortizolu. Pre konjugáciu je tiež dôležitá biosyntéza sulfát-esterov za pomocoi fosfoadenozinfosfosulfátu (PAPS) nazývaného „aktivný“ sulfát, väzba na glutathion a amiová väzba s glycínom a glutamínom. Tak dochádza napr. ku konjugácií kyseliny benzoovej s glycínom na lepšie rozpustnú a menej toxickú kyselinu hippuronovú (N-benzoylglycín). K eliminácií konjugátov dochádza buď biliárne, tzn. Prostredníctvom receptormi sprostredkovanej exkrécie do žlče alebo renálne filtráciou krvi v ľadvinách. K odstráneniu ťažkých kovov používa pečeň metalothioneiny, skupinu na cysteín bohatých proteínov s vysokou afinitou k dvojmocným kovovým iónom ako je Cd 2+ , Cu 2+ , Hg 2+ a Zn 2+ , Tieto kovové ióny indukujú tvorbu metalothioneinov pomocou zvláštneho kovy regulujúceho elementu (MRE) v génovom promotore. V priebehu prvej fázy biotransformácie v pečeni a ostatných tkanivách sú chemicky málo reaktívne lipofilné zlúčeniny enzymaticky hydroxylované, čo umožní ich konjugáciu s polárnymi substanciami. Hydroxylujúcimi enzýmami sú všeobecne monooxygenázy obsahujúcimi ako redoxný koenzým hem b (protororfyrín IX). V redukovanej forme viaže tento hem oxid uhoľnatý (CO) a následne vykazuje typickú absorpciu svetla pri 450 nm. Táto vlastnosť je pre systémy cytochromu P450 charakteristická. Monooxygenázy zvislé na cytochrome P450 (CYP) katalyzujú redukčné štiepenie molekulárneho kyselíku. Pritom je jeden kyslíkový atóm prenesený na lipofilný substrát, druhý sa uvoľní v molekule vody. Potrebné redukčné ekvivalenty poskytujú NADPH + H + . CYP spracovávajú mnoho lipofilných substrátov endogénneho a exogénneho pôvodu. Nepodieľajú sa iba na biotransformačných reakciách I. fázy u xenobiotík, farmák a chemikálií, ale tiež na metabolizme sterolov, steroidných hormónov, žlčových kyselín a eikosanoidov, ale aj nenasýtených mastných kyselín a kyseliny retinovej. Uvedené substráty môžu byť týmto spôsobom hydroxylované, epoxidované, dealkylované, oxidované alebo dehalogenované. Väčšinou sa zvýši aj ich polarita a metabolizovateľnosť. CYP sú súčasťou elektrónových transportných reťazcov tvorených mnohými membránovými proteínmi vizanými na endoplazmatické retikulum a vnútornú mitochondriálnu membránu. Kyslíkový substrát sa ukladá v aktívnom centre cytochrómu P450 (cyt P450) na železo viazané v heme a je aktivovaný elektrónmi. Systémy v ER a mitochondriách sa líšia transportom elektrónov. V ER zaisťuje prenos elektrónov z NADPH na cyt P450 práve cyt-P450-reduktáza obsahujúca FAD a FMN. V mitochondriách ich prenáša adrenodoxinreduktáza obsahujúca FAD z NADPH najprv na 2 adrenodoxiny skôr, než elektróny vstúpia do cyt P450. Monooxydázy závisle na cytochromu P450 (CYP) tvorí spoločne nadrodinu, ktorou je možno na základe kritérií homológie rozdeliť na 18 rodí s 41 podrodinami. U človeka sa vyskytuje zhruba 60 rôznych izoforiem CYP s rôznymi vlastnosťami. CYP sú prítomné vo všetkých jadrových bunkách, hlavne v hepatocytoch, žľazách produkujúcich steroidné hormóny, čreve a pľúcach. Podieľajú sa na metabolzme lipofilných endogénnych metabolitoch, napr. na biosyntéze cholesterolu, žlčových kyselín a steroidných hormónov. Za ich účasti dochádza k hydroxylácií alkánov a mastných kyselín, čo spúšťa ich rozklas. Tiež biosyntéza eikosanoidov z kyseliny arachidónovej je katalyzovaná CYP. Substrátová špecifita niektorých izoforiem CYP orientovaných proti exogénnym látkam, ako sú xenobiotiká a farmak, je naopak slabšia a čiastočne sa dokonca prekrýva. Izotyp CYP3A4 tak katalyzuje rozklad takmer polovice známych liečiv. Ďalších 20% far,ák štiepi CYP2D6, 15% CYP2C19 a zvyšok CYP 1A2, 2A6 a 2B6. Zatiaľ čo v mnohých prípadoch vedie reakcia s CYP k inaktivácií liečiv a cudzorodých látok (detoxikácia), mäže v iných prípadoch vytvoriť toxické produkty (konverzia). Tak napr. epoxidácia aromatických látok vyvolátvorbu veľmi reaktívnych a často toxických produktov. Mnohé substráty môžu svoje CYP indukovať (indukácia susbstrátom), naor. Barbituráty indukujú CYP3A4 a príbuzné CPY. Iné zlúčeniny, medzi nimi napr. látky vyskytujúce sa v grepovej šťave, zase inhibujú jednotlivé izotypy CYP (inhibícia enzýmu). Vzájomná kompeticia substrátov na aktívnom centre CYP spôsobí, že svoj rozklad navzájom potlačí (kompetícia substrátov). Asi 40% génov pre CYP sa vyskytuje vo forme mnohočetných alel (genetický polymorfizmus). Preto existujú medzi pacientami veľké rozdiely v schopnosti metabolizovať lieky („zle“ a „dobre“ metabolizujúci pacienti). Ako jedy (toxické látky, jedovaté látky) sú označované chemické látky, ktoré sú schopné po vniknutí do organizmu vyvolať už v relatívne malom množstve poškodenie organizmu. Ako jed môžu pri predávkovaní pôsobiť aj liečivá. Toxicky významné látky zahŕňajú spektrum látok s rôznymi fyzikálno-chemickými vlastnosťami:  liečivá, návykové látky  prchavé (těkavé) látky (napr. etanol, metanol, toluen, trichloretylen)  plyny (napr. CO, HCN,...)  anorganické kyseliny a zásady  kovy (napr. arzén, olovo, ortuť,...) Karcinogénne látky vyvolávajú zmeny v bunke vedúce k zhubnému bujeniu tkaniva a vznikajú tak nádory. Zmeny môžu byť spôsobené poškodeným opravných mechanizmov alebo inými mechanizmami. Medzi chemické karcinogény patrí napr. benzén, DDT, aromatické amíny, azbest, formaldehyd, analógy dusíkatých báz,... III/10. Pufrové systémy organismu, funkce a význam pro acidobazickou rovnováhu Všeobecne sme o pufroch už hovorili v otázke I/13. Ide o mechanizmy, ktoré udržiavajú stále pH prostredia organizmu (okolo 7,4) a napomáhajú tak udržiavať acidobázickú rovnováhu organizmu. Chemicky pufr obsahuje roztok slabej kyseliny a k nej konjugovanej silnej zásady. V organizme existuje viacero pufrových systémov. V krvnej plazme je najviac zastúpený hydrogénuhličitanový systém, ide o hlavný pufrový systém plazmy a tiež ma prídavnú pufrovaciu funkciu aj v erytrocytoch. Skladá sa zo slabej kyseliny uhličitej a k nej konjugovanej silnej zásady HCO 3 - . Samotná kyselina uhličitá získava pufračnú schopnosť, až keď je rozštiepená účinkom karbonátdehydratázy na CO 2 a H 2 O. V rovnici pre výpočet pH tohto pufrového systému musí byť trochu pozmenená. Skutočná hodnota pK pre tento systém je 3,88, ale v biologickom systéme je to zložitejšie. Menovateľ rovnice sa totiž skladá nielen z koncentrácie H 2 CO 3 , ale aj z rozpusteného CO 2 , ich súčet sa nazýva celkové CO 2 a je to súčet všetkého CO 2 (teda CO 2 fyzikálne rozpusteného a CO 2 prítomného vo forme H 2 CO 3 , ale už nie CO 2 obsiahnutého v HCO 3 ). Hodnota pK v tomto prípade vyjde 6,1 a teda bude platiť pre tento systém: pH = 6,1 + log [퐻퐶푂 3 − ] [ 퐻 2 퐶푂 3 ] +[퐶푂 2 ] =6,1+log [퐻퐶푂 3 − ] 푝퐶푂 2 .푠 (s je koeficient rozpustnosti CO 2 a má hodnotu 0,288; pCO 2 sa vyjadruje v kPa) Ak sa koncentrácia protónov v organizme zvýši, väčšina sa naviaže na HCO 3 - za vzniku nedisociovanej H 2 CO 3 . Po rozložení kyseliny uhličitej na H 2 O a CO 2 sa oxid uhličitý vydýcha. Pomer [HCO 3 - ]/[H 2 CO 3 ] sa tak upraví na pôvodné hodnoty a nadbytok protónov je odstránený. Ak sa zníži koncentrácia vodíkových, reaguje organizmus zvýšenou extrakciou HCO 3 - v moči. Fosfátový pufrový systém pôsobí v krvnej plazme ako minoritný systém. Skladá sa z dihydrogén- a monohydrogénfosfátových iónov (H 2 PO 4 - a HPO 4 2- ). Tento systém sa uplatňuje hlavne intracelulárne a vo vylučovanej moči. Pri acidémií protóny viaže a uvoľňuje ich K + , v alkalémií protóny uvoľňuje a K + naopak viaže. Hemoglobínový pufrový systém (hemoglobín-oxyhemoglobín) je vlastne systém dvoch kyselín. Oxygenovaný hemoglobín je silnejšou kyselinou, ktorá protón odštiepuje, pričom deoxygenovaný hemoglobín je slabšou kyselinou, ktorá protón viaže. V pľúcach, kde sa vylučuje CO 2 a teda aj H + z disociovanej H 2 CO 3 , prebieha oxygenácia hemoglobínu a teda aj väčšia disociácia H + z jeho molekuly. V tkanivách, kde sa hemoglobín stáva deoxygenovaným a kde je sú produkované H + ióny, hemoglobín naopak protóny viaže. V rozmedzí pH zlučiteľného so životom, sa väčšina plazmatických bielkovín chová ako slabé kyseliny, ktoré môžu uvoľniť H + a stať sa tak aniónom (prot - ). Pre väčšinu plazmatických bielkovín je hodnota fyziologického pH vyššia ako ich izoelektrický bod, preto majú negatívny náboj. Hydogénuhličitanový a nehydrogénuhličitanové pufrové systémy reagujú ako jeden systém pri zmene pH z akéhokoľvek dôvodu. Záťaž sa rozloží na všetky systémy a reakcia, ktorá bude vďaka tomuto prepojeniu, sa označuje ako interakčná. III/11. Metabolismus erytrocytů. Erytrocyty cicavcov sú bezjadrové bunky s redukovaným udržiavacím metabolizmom. Ten sa v podstate obmedzuje na anaeróbnu glykolýzu a pentózový cyklus. Erytorcyty preto nemôžu existovať bez stáleho prísunu glukózy. Denná spotreba 3.10 13 erytocytov ľudskej krvi, na závisle na stave metabolizmu, asi 36 g glukózy. Súčasne sa vylúči zhruba rovnaké množstvo laktátu, z ktorého sa v pečeni v priebehu glukoneogenézy opäť syntetizuje glukóza. Behom glykolýzy vytvorený ATP je predovšetkým určený pre zásobenie Na +/ K + -ATPázy udržujúcej membránový potenciál erytrocytov. Tiež alosterický hemoglobínový efektor 2,3-bisfosfoglycerát je vedľajším produktom glykolýzy. Malá časť NADH vzniknutého behom glykolýzy poskytuje redukčné ekvivalenty pre redukciu methemoglobínu. Hlavnou úlohou pentózového cyklu je príprava NADPH potrebného na redukciu glutathionu (GSH) vzniknutého reakciou gltathiondisulfidu (GSSG) za podpory glutathionreduktázy. Glutathion, najdôležitejší antioxidant v erytrocyte, je koenzým glutathionperoxidázy. Tento enzým detoxikuje H 2 O 2 a lipohydroperoxidy (LOOH) vznikajúce behom reakcie ROS s nenasýtenými mastnými kyselinami. Glutathionreduktáza patrí k niekoľkým enzýmom so selenocysteínovým zvyškom v aktívnom centre. Za normálnych podmienok sa O 2 viaže na hemoglobínové železo len koordinačne, bez toho, aby s ním reagoval. Príležitostne však predsa len dochádza k redoxnej reakcii, v ktorej priebehu vzniká methemoglobín (Hb.Fe 3+ ) a superoxidový radikál. Met-Hb-reduktáza redukuje Hb.Fe 3+ na funkčné Hb.Fe 2+ , pričom ako donor elektrónu slúži redukovaný cytochróm b 5 . Pri jeho regenerácii cytochróm-b 5 -rduktázou pomáha NADH vzniknutý behom glykolýzy. Superoxidázový anión je detoxikovaný účinkom superoxiddismutázy. Okrem H + iónov a CO 2 je najdôležitejším regulátorom väzby O 2 na hemoglobín 2,3-bisfosfoacetát (BPG). BPG sa tvorí v erytrocytoch s pomocou bisfosfoglycerátmutázy z glykolytického intermediátu 1,3-bisfosfoglycerátu a môže s podporou bisfosfoglycerátfosfatázy vstúpiť ako 2- fosfoglycerát opäť do glykolýzy. Pretože pritom, dôjde k obchvatu fosfoglycrátkinázovej reakcie, je táto „obchádzka“ cez BPG v porovnaní s glykolýzou spojená so stratou jedného ATP- BPG sa selektívne viaže ako alosterický efektor na deoxy-Hb, a zväčšuje tým jeho podiel na rovnováhe, čo sa prejaví zvýšeným výdajom O 2 pri konštantnom pO 2 . V grafe sa to odrazí na saturačnej krivke ako posun doprava. Podobný efekt vykazuje aj CO 2 a H + . Vplyv CO 2 a BPG na saturačnú krivku O 2 je aditívny. Ak pridáme oba efektory do roztoku čistého Hb, prejde krivka 1 do krivky 4, ktorá zodpovedá krivke odvodenej z plnej krvi. Vhodným konzervačnými postupmi je možné uchovať darcovské erytrocyty, ktoré nemôžu byť použité okamžite, pre transfúzii využite až po 6 týždňoch. Najprv sa oddelia od plazmy a lymfocytov a získaný erytorocytárny koncentrát sa stabilizuje prísadami, napr. tzv. roztokom CPDA. Táto skratka uvádza komponenty roztoku, hlavne citrát potlačujúci zrážanie, fosfát potrebný pre tvorbu ATP, dextrózu –teda glukóz ako energetický substrát pre erytrocyt a adenín potrebný pre udržanie hladiny ATP. III/12. Významné proteiny krevní plazmy, význam v organismu (albumin, Ig, proteiny akutní fáze, transportní proteiny). Plazmatické bielkoviny sú heterogénna skupina bielkovín pochádzajúcich z rôznych buniek. Biosyntéza prevažnej väčšiny plazmatických bielkovín prebieha v pečeni, ale menšia časť je syntetizovaná aj v iných bunkách ako sú napr. v lymfocytoch (imunoglobulíny), enterocytoch (apoproteín B-48), etc. Odbúravanie väčšiny plazmatických bielkovín prebieha v hepatocytoch a v monocyto-makrofágovom systéme, kde sa degradujú hlavne bielkoviny po vytvorení komplexov (komplexy antigén-protilátka alebo hemoglobín-haptoglobín). Iným spôsobom odstraňovania plazmatických bielkovín sú exkrečné orgány, predovšetkým ľadviny a gastrointestinálny trakt. Celková koncentrácia bielkoviny v sére je 65-85 g/l, ktorá má onkotický tlak 3,33-3,52 kPa. V plazme je táto hodnota vyššia vďaka podielu koagulačných faktorov. Plazmatické bielkoviny majú v krvi mnoho funkcii:  Udržovanie osmotického tlaku krvi  Transport dôležitých látok (hormóny, viamíny, lipidy, bilirubín, minerály,...)  Nutričná funkcia  Udržiavanie acidobázickej rovnováhy – pufrový systém  Zastavenie krvácania a zrážanie krvi – hemokoagulácia  Obranné reakcie organizmu Elektroforéza plazmatických bielkovín ich rozdelí na 5-6 frakcii (albumínovú, α 1 , α 2 , β, γ; niekedy sa rozlišuje β frakcia na β 1 a β 2 ). Jednotlivé frakcie obsahujú jednotlivé plazmatické bielkoviny v určitých koncentráciách. Zmeny v koncentráciách jednotlivých bielkovín naznačujú patologické procesy. Bielkoviny jednotlivých frakcií sú popísané v tabuľke. Albumín je zastúpený v celkovej bielkovine séra podielom 55 – 65% (priemerná koncentrácia v plazme je 40g/l). Je syntetizovaný v pečeni a jeho tvorba závisí na prijme aminokyselín. Albumín sa podieľa podstatným spôsobom na udržovaní onkotického tlaku plazmy. Hodnoty albumínu znížené na menej než 20 g/l sú spojené s výskytom edému. Albumín plní funkciu hlavnej transportnej bielkoviny krvi. Transportuje bilirubín, hem, steroidné a tyroidné hormóny, mastné kyseliny, žlčové kyseliny, kovy, lieky, a iné látky. Albumín tiež vytvára proteínovú rezervu a slúži ako zdroj aminokyselín, najmä esenciálnych, pre rôzne tkaniva. Pri malnutricii sa jeho koncentrácia znižuje. Koncentrácia albumínu v plazme nie je však dobrým indikátorom rannej proteínovej malnutrície, pretože pri nedostatku aminokyselín sa znižuje aj katabolizmus albumínu a albumín sa premiestňuje z interstícia, aby sa zachovalo adekvátne množstvo v plazme. Pomalý pokles je daný tiež dlhším polčasom a veľkou telesnou zásobou. Z tohto dôvodu neodráža plný rozsah nutričného deficitu. Reakcia akútnej fázy je fyziologický dej, ktorý sa rozvíja pri lokálnom alebo systémovom zápale (zánět), traumatickom poškodení tkaniva (aj po chirurgických výkonoch) alebo pri nádorovom bujení, menej vyjadrená je táto reakcia v mnohých ďalších situáciách (napr. fyzická záťaž, infarkt myokardu alebo v období pôrodu). Zjednodušene sa dá povedať, že táto reakcia je vyvolaná stavmi, kedy dochádza k deštrukcii buniek, reverzibilnému poškodeniu buniek a ich následnej reparácii alebo k metabolickej aktivácii niektorých buniek (hlavne imunologicky aktívnych). Pri reakcii akútnej fázy bunky aktívne produkujú a uvoľňujú celé spektrum mediátorov a signálnych proteínov, ktoré navodia v pečeni (a v menšej miere aj v iných tkanivách) rýchle zmeny v syntéze rôznych bielkovín. Proteíny, ktorých koncentrácia sa mení v plazme (viac než o 25%) označujeme ako proteíny akútnej fázy. Koncentrácia niektorých bielkovín sa zvyšuje (pozitívne proteíny akútnej fázy) alebo znižuje (negatívne proteíny akútnej fázy). Proteíny akútnej fázy predstavujú rôznorodý súbor bielkovín, ktoré sa väčšinou dajú rozdeliť do určitých skupín. Zložky imunitnej reakcie majú rôzne funkcie; niektoré sa priamo podieľajú na likvidáciu noxy, ktorá spôsobila zápal; iné sa podieľajú na odstránení poškodených buniek; alebo modulujú imunitnú reakciu. Patria medzi ne napr. C-reaktívny proteín, zložky komplementu (hlavne C3 a C4), tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukín 1 (IL-1) alebo interleukín 6 (IL-6). Bielkoviny ochrany pred kolaterálnym poškodením tkaniva majú za úlohu obmedziť účinok látok určených na zničenie noxy a poškodeného tkaniva, tak aby pôsobili iba tam, kde majú a aby tzv. kolaterálne poškodenie tkaniva bolo čo najmenšie. Tiež sa delia do viacerých podskupín, patria sem napr. inhibítory proteáz (α 1 -antitripsín, α 1 -antichymotrypsín, α 2 -makroglobulín) a bielkoviny ochrany pred oxidačným stresom (ide o bielkoviny, ktoré viažu reaktívne formy kyslíka, ale aj bielkoviny, ktoré viažu a stabilizujú prechodné kovy a ich komplexy, čím znižujú tvorbu ROS vo Fentonovej reakcii; patria sem napr. haptoglobín, hemopexín, ferritín alebo ceruloplastín). Medzi reaktanty akútnej fázy patria ešte bielkoviny pre transport odpadných látok vznikajúcich počas zápalu (napr. haptoglobín, hemopexín alebo sérový amyloid A) a koagulačné faktory a bielkoviny podieľajúce sa na regenerácií tkaniva (napr. fibrinogén). Význam niektorých reaktantov akútnej zostáva neznámy, aj keď sa môže jednať o klinicky významné bielkoviny, napr. sa používajú ako zápalové parametre (napr. prekalcitonín). Plazmatická koncentrácia rôznych reaktantov akútnej fázy sa menia rôzne rýchlo. Podľa doby za ktorú sa zmení od začiatku ochorenia ich rozdeľujeme do troch skupín: časné (skoré) proteíny akútnej fázy, proteíny akútnej fázy so strednou dobou odpovede a pozdní (neskoré) proteíny akútnej fázy. Časné proteíny akútnej fázy sú bielkoviny s veľmi krátkym biologickým polčasom. Zmeny ich plazmatickej koncentrácie je možné pozorovať už za 6-10 hodín od začiatku ochorenia, Vzostup vrcholí väčšinou v priebehu druhého až tretieho dňa. Hlavnými oredstaviteľmi sú C-reaktívny proteín (CRP), sérový amyloid A (SAA) a prokalcionín (PC T). C-reaktívny proteín (CRP) je jedným z najdôležitejších reaktantov akútnej fázy. Je to bielkovina, ktorá hraje úlohu opsonínu (látka, ktorá označuje látku určenú na fagocytózu a tým uľahčuje fagocytózu). Svoje meno získal vďaka tomu, že precipituje s tzv. C-polysacharidom pneumokokov. Plazmatická koncentrácia CRP sa zvyšuje už za 4 hodiny po navodení reakcie akútnej fázy a v priebehu prvých dvoch dní jeho koncentrácia vzrastie aj viac ako 100-krát. Maximálna koncentrácia je dosiahnutá za 24-48 hodín, približne24 hodín je aj polčas CRP. Fyziologicky býva plazmatická koncentrácia CRP nižšia než 2-8 mg/l. Rýchly a vysoký vzostup CRP (typicky na hodnoty nad 6 mg/l) sprevádza predovšetkým akútne bakteriálne infekcie., menej často tiež mykotické infekcie. Vírusové infekcie oproti tomu bývajú charakterizované relatívne nízkym vzostupom CRP (spravidla pod 40mg/l). Stanovenie plazmatickej koncentrácie CRP preto nepomáha v rozhodnutí, či zahájiť liečbu antibiotikami. Úspešná antibioická terapia sa prejaví rýchlym poklesom CRP, naopak pri neúspešnej liečbe pretrváva zvýšenie. Stanovením CRP je možné odhaliť riziko pooperačnej infekcie. Tretí deň po operácii má jeho koncentrácia rýchlo klesať k norme Pretrvávajúce zvýšenie alebo len čiastočný pokles, nasledovaný ďalším zvýšením, naznačuje prítomnosť infekcie alebo inej zápalovej komplikácie. Mierny vzostup CRP sprevádza aj infarkt myokardu. Všeobecne sa dá povedať, že mierne zvýšené hodnoty CRP (väčšinou okolo 10 mg/l) patria medzi známky vysokého kardiovaskulárneho rizika. Sledovanie koncentrácie CRP je užitočné aj pri monitorovaní autoimunitných ochorení. Nevýhodou CRP je jeho nízka špecifickosť. Na rozdiel od prokalcitonínu neinformuje o ťažkosti orgánového postihnutia, ale iba o prítomnosti infekcie. Vzájomne sa tieto dva márkre nenahradzujú, ale dopĺňajú. Sérový amyloid A (SAA) je skupina proteínov akútnej fázy z rodiny apoproteínov. Medzi funkcie SAA patrí napr. obmedzenie transportu cholesterolu do pečene, chemotaxia alebo indukcia enzýmov degradujúcich extracelulárnu matrix. Dlhodobé zvýšenie koncentrácie SAA predstavuje rizikový faktor aterosklerózy. Dlhodobá nadprodukcia SSA zas môže viesť k vzniku sekundárnej amyloidózy. Prokalcitonín je reaktant akútnej fázy, ktorý sa začal v klinickej praxy využívať iba v posledných rokoch. Táto bielkovina je tvorená 116 aminokyselinami, má molekulovú hmotnosť 13 000 a fyziologicky je tvorená C-bunkami štítnej žľazy ako prekurzor hormónu kalcitonínu Hlavne pri generalizovaných bakteriálnych infekciách ho však začnú produkovať aj ďalšie bunky, hlavne neuroendokrínne bunky pľúc a čreva, ale aj bunky parenchymatóznych orgánov a pri sepse prakticky všetky tkanivá a typy buniek. Koncentrácia tejto bielkoviny potom v plazme prudko stúpa. PCT uvoľnený pri sepse nie je konverzovaný na kalcionín. Presný fyziologicky význam prokalcitonínu nie je úplne objasnený, ale predpokladá sa, že má analgetické účinky a podieľa sa na regulácii zápalu. Polčas prokalcitonínu je 1 deň a po imunítnej stimulácii vzrastá jeho plazmatická koncentrácia už behom 2-3 hodín asi dvadsaťnásobne. Zvýšenie je možné pozorovať len pri generalizovaných bakteriálnych, mykotických a protozoálnych infekciách, neobjavuje sa pri vírusovej infekcií. S menej významným vzostupom sa môžeme stretnúť aj u polytraumat, popálenín a po rozsiahlych brušných operáciách. Proteíny akútnej fázy so strednou dobou odpovede menia svoju koncentráciu12-36 hodín po začiatku ochorenia a maxima je dosiahnuté ku koncu prvého týždňa. Patria k ním α 1 -kyslý glykoprotín, α 1 -antitrypsín, hapoglobulín a fibrinogén. Pozdné proteíny akútnej fázy sú zastúpené zložkami komplementu C3 a C4 a ceruloplazmínom, u ktorých sa zmeny rozvíjajú až po 48-72 hodinách po začiatku ochorenia. Vzostup koncentrácii je v porovnaní z obomi predchádzajúcimi skupinami menej vyjadrený a vrcholu dosahujú až po 6-7 dňoch. Negatívne reaktanty akútnej fázy sú bielkoviny, ktorých hladiny sa v priebehu akútnej záťaže znižujú- Hlavnými zástupcami sú albumín, prealbumín a transferín. Pre sledovanie a hodnotenie priebehu reakcie na záťaž majú menší význam ako pozitívne reaktanty. Často sa však využívajú ako kritérium syntézy bielkovín v pečeni a ako ukazatele malnutrície. Protilátky (imunoglobíny) sú špecifické globulíny krvnej plazmy s elektroforetickou pohyblivosť β-γ. Vznikajú v plazmatických bunkách ako humorálna súčasť imunitnej reakcie na určitý antigén. Molekula imunoglobulínu má schopnosť špecificky viazať príslušný antigén, proti ktorému sa vytvorila. Po väzbe vzniká imunitný komplex. Okrem toho imunoglobulíny plnia ďalšie funkcie zahŕňajúce napr. väzbu komplementu, väzbu na neutrofilné leukocyty a makrofágy. Imunoglobulíny delíme na 5 tried – IgG, IgM, IgA, IgD a IgE. U triedy IgG boli popísané ešte podtriedy – IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4, ktorých funkcie sa líšia. Rovnako trieda IgA nie je jednotná, ale tvoria ju podtriedy IgA-1 a IgA-2. Základná štruktúra imunogolublínu je tvorená dvomi rovnakými ťažkými reťazcami (H-reťazce), označených podľa jednotlivých tried γ, μ, α, δ, ε a dvomi ľahkými reťazcami (L-reťazce) κ a λ, ktoré sú pre jednotlivé triedy spoločné. Každá molekula imunoglobulínu obsahuje buď κ alebo λ reťazce. Pri prvej infekcii baktériami, či protozoami nastupuje v priebehu 2-3 dní tvorba protilátok IgM, ktorá je neskôr behom 5-7 dní vystriedaná tvorbou IgG s rovnakou špecifickosťou. Opakovaná infekcia spôsobí rýchle zvýšenie hodnôt IgG a malé zvýšenie koncentrácia IgM. Viac o protilátkach v otázke III/29. Transportné bielkoviny v plazme prenášajú rôzne látky. Najvýznamnejší z nich je albumín, ďalej transferín (viac otázka III/4), apoproteíny, transkortín, ceruloplezmín, etc. III/13. Hemokoagulace, kaskáda koagulačních faktorů, úloha trombocytů. Ak dôjde k poškodeniu cievnej steny, zaistí hemostáza zmiernenie krvných strát. Najprv dochádza aktiváciou trombocytov ku kontrakcii poškodenej cievy a vytvoreniu pohyblivej zátky z trombocytov (zástava krvácania). O niečo neskôr sa pod vplyvom enzýmu trombínu vytvorí polymérny fibrín a uloží sa do trombu (zrážanie krvi). Najdôležitejšou reakciou pri zrážaní krvi je enzymaticky podmienená zmena rozpustného plazmatického proteínu fibrinogénu (koagulačný faktor I) na polymérny fibrín ukladajúci sa do primárneho trombu ako vláknitá sieťovina. Túto reakciu katalyzuje serínová proteáza trombín (faktor IIa), ktorý odštiepuje od fibrinogénu malé peptidy. Tým sa odhalia väzobné miesta iniciujúce spontánnu agreagáciu fibrínových molekúl na polyméry. Trombus je následne stabilizovaný kovalentným prepojením fibrínových vláken vyvolaných transglutaminázou (faktor XIII). Za normálnych podmienok sa trombín nachádza v krvi ako inaktívny proenzým. Pre jeho aktiváciu existujú dve dráhy. Obe predstavujú kaskádu enzymatických reakcií, v ktorej priebehu sa inaktívne proenzýmy (zymogény) proteolyticky menia na aktívne proteázy, ktoré aktivujú ďalšie proenzýmy. Niektoré kroky v kaskáde vyžadujú ďalšie proteínové faktory (faktory III, Va a VIIIa) a aniónové fosfolipidy (PL) spolu iónmi Ca 2+ . Obe dráhy spúšťa poškodenie cievnej steny. V exogénnej dráhe aktivuje najprv tkáňový tromboplastín (faktor III), membránový proteín z hlbších vrstiev cievnej steny, zrážací faktor VII. Jeho aktivovaná forma (VIIa) autokatalyticky podporí vlastnú tvorbu a naviac uvoľní z jeho prekurzorov aktívne faktory IXa a Xa. Faktor IXa vytvorí za účasti faktoru VIIIa, PL a Ca 2+ ďalší Xa, ktorý s podporou Va, PL a Ca 2+ ďalší Xa, ktorý s podporou Va, PL a Ca 2+ konečne uvoľní aktívny trombín. Tiež endogénu dráhu pravdepodobne spúšťa poranenie cievy. Dráha smeruje v piatich stupňoch cez aktory XIIa, XIa, IXa a Xa k aktivácii protrombínu. Jej význam in vivo je spochybňovaný od doby, kedy sa preukázalo, že geneticky spôsobený nedostatok faktoru XII nemusí nutne vyvolať poruchu zrážanlivosti. Na hemokoagulačnej kaskáde sa podieľa Ca 2+ a PL, ktoré pochádzajú z trombocytárnej membrány. Spôsobia tvorbu lokálnych komplexov s proteínmi obsahujúcimi aminokyselinové zvyšky typu Gla (γ-karboxyglutamát) – faktorov II, VII, IX a X. Zvyšky Gla sú v zhlukoch prítomné v určitých doménach a prostredníctvom Ca 2+ vstupujú do kontaktu s membránovými PL. Z faktorov IXa a VIII sa tvorí tenázový komplex aktivujúci faktor X na Xa. Ten sa spojí s Va na protrombinázový komplex katalyzujúci na trombocytárnej membráne kľúčovú aktiváciu protrombínu (II) na trombín (IIa). Aktívny trombín nemení len fibrinogén na fibrín, ale nepriamo stimuluje aj svoj vlastnú tvorbu, keď aktivuje faktory V a VIII. Naviac katalyzuje tiež aktiváciu faktoru XIII, čím spôsobí zasieťovanie fibrínu a zintenzívni tak už prebiehajúcu zrážaciu reakciu, Trombín vyvoláva s určitým oneskorením aj fibrinolýzu. Patobiochémia Je popísaných mnoho defektov spomaľujúcich zrážanie krvi. Najčastejším genetickým ochorením je nedostatok von Willebrandtového faktoru v cievnom subendotele. Tento faktor podporuje adhéziu trombocytov. Hemofíliu A spôsobí chýbanie funkčného zrážacieho faktoru VIII. Príčinou hemofílie B je mutácia génu pre faktor IX. Pretože obe typy hemofílie sa dedia recesívne na X-chromozóme, sú nimi postihnutí prakticky len muži. III/14. Fibrin, fibrinolýza. Mechanismus účinku antikoagulačních látek. Hemostáza ako tvorba trombov z fibrínu a trombocytov sa nachádza v krehkej rovnováhe s rozpúšťaním týchto trombov fibrinolýzou. Poruchy týchto procesov môžu viesť na jednej strane ku krvácaniu spôsobenému príliš pomalou hemostázou, na strane druhej potom k tromózam a embóliám následkom zvýšenej zrážanlivosti. Pri hroziacich trombózach je možné zrážaniu predísť podaním antikoagulačných prípravkov podobne ako pri srdečnom infarkte podporujeme fibrinolýzu enzýmami. Protizrážanlivý účinok aktívneho trombínu môže byť potlačený jeho väzbou na trombomodulín, membránový proteín endotelových buniek. Viazaný trombín naopaj vykazuje protizrážanlivé účinky. Aktivuje proteín C, ktorý sa viaže na svoj kofaktor proteín S. Tak vznikne komplex APC (aktivovaný proteín C) blokujúci koagulačnú kaskádu likvidáciou koagulačných faktorov Va a VIIIa. V plazme sa vyskytujú rôzne inhibítory serínových proteáz nazývané serpíny (serín-proteázové inhibítory). Serpíny môžu blokovať enzýmy koagulačnej kaskády aj fibrinolýzy. Pritom pôsobia ako pseudosubstráty. Tak je napr. trombín kontrolovaný serpínom antitrombínom III (ATIII). Inaktiváciu trombínu vytvorením komplexu trombín-ATIII môže významne stimulovať heparín a podobné glykosaminoglykany. Heparín podporuje ATIII a môže preto inaktivovať nielen trombín, ale aj ďalšie koagulačné faktory. Pre prevenciu trombóz a embólií je možné zrážanie spomaľovať, čo je možné podaním liekov zvaných antikoagulantia. Heparín je glykosaminoglykan prirodzene sa vyskytujúci v tukových bunkách a spojivovom tkanive, ktorý aktivuje serpín ATIII. Pretože je heparín trávený v čreve, musí byť tento rýchlo pôsobiaci preparát aplikovaný injekčne. Výrazne pomalšie naopak pôsobí antagonisti vitamínu K, ktoré je možné podávať perorálne. Potláčajú regeneráciu aktívneho vitamínu K v pečeni, a tým nepriamo blokujú γ-karboxyláciu glutamátových zvyškov v priebehu biosyntézy koagulačných faktorov II, VII, IX a X rovnako ako proteínov C a S. Tieto plazmatické bielkoviny potom nemôžu viazať ióny Ca 2+ a sú preto nefunkčné. K dôležitým antagonistom vitamínu K patria kumaríny. Príkladom by mohol byť fenprokumon (obchodný názov Marcumar), ktorého štruktúra je veľmi podobná vitamínu K. Medzi antikoagulantia počítame tiež inhibítory agreagácie trombocytov používané k „riedeniu krvi“. Jednou z látok tejto skupiny je acetylsalicylát (ASS, aspirín), ktorý zastavením syntézy prostaglandínov blokuje agregáciu trombocytov. In vitro je možné zrážaniu krvi zabrániť heparínom alebo chlátormi Ca 2+ , ako je citrát alebo EDTA (etyléndiamíntetraacetát). Účinok antikoagulancií je možné stanovením hodnoty INR (international normalized ratio), skôr označovanej ako Quickov čas. Fibrín je aktívna forma koagulačného faktoru I (fibrinogén). Vzniká proteolytickým pôsobením trombínu na fibrinogén. Trombín štiepi fibrinogén na fibrín-monomér a malé fibrinopeptidy, ktoré nemajú koagulačnú aktivitu. Molekuly fibrín-monoméru potom spontánne polymerizujú, čím vznikajú fibrínové vlákna, ktoré tvoria základ krvnej zrazeniny. V priebehu fibrinolýzy dochádza pôsobením plazmínu k opätovnému rozpusteniu fibrínového trombu (zrazeniny) vzniknutého pri hemokoagulácii. Plazmín, tiež serín proteáza, vzniká limitovanými proteolýzami z plazminogénu zabudovaného do trombu. Medzi enzýmy, ktoré ho aktivujú, patrí aktivátor plazminogénu z ľadvín (urokináza – uPA) a aktivátor tkanivového plazminogénu z cievneho endotelu. Fibrinolýzu naopak potláča plazmatický proteín α 2 -antiplazmín viažuci aktívny plazmín v plazme, čo spôsobí jeho inaktiváciu. Urokináza, tPa a streptokináza, bakteriálny aktivátor živočíšneho plazminogénu, sa klinicky používajú k rozpusteniu trombov pri infakte myokardu. III/15. Moč – fyziologické a patologické součásti. Voda a v nej rozpustné látky sa vylučujú z tela močom. Jeho objem a zloženie je veľmi variabilné a záleží na príjme potravy, stavbe tela, veku, pohlaví a životných podmienkach, ako napr. teplota, vlhkosť, fyzická aktivita a zdravotný stav. Keďže vylučovanie moči podlieha cirkadiannym rytmom, tak množstvo a zloženie moču sa udáva za 24h obdobie. Dospelý človek vyprodukuje 0,5-2 l moču za deň a asi 95% moču tvorí voda. Moč má väčšinou mierne kyslé pH (okolo 5,8). Avšak pH moču je veľmi závislé od metabolického stavu jedinca. Po skonzumovaní veľkého množstva rastlinnej potravy sa môže pH zvýšiť až na viac ako 7. Dusíkaté látky sú jednými z najdôležitejších organických zložiek moču. Močovina (urea), ktorá je hlavne syntetizovaná v pečeni, predstavuje formu v ktorej je vylučovaný dusík z aminokyselín. Degradácia pyrimidínových nukleotidov tiež produkuje určité množstvo urei. Keď je dusíková bilancia stála, presne také množstvo dusíku je vylúčené, aké je prijaté a množstvo urei v moči teda odráža degradáciu proteínov; 70 g proteínov z jedla dá vzniku asi 30g urei v moči. Kyselina močová je konečným produktom metabolizmu purínových báz. Pri poruche vylučovania kyseliny močovej ľadvinami sa môže vyvinúť dna (otázka II/36). Kreatinín vzniká v svalovom metabolizme, kde vzniká spontánnym a irreverzibílnym zacyklením kreatínu a keratín fosfátu. Pretože množstvo vylúčeného kreatinínu v moči u jedinca za deň je konštantné, mäže byť táto endogénna zlúčeniny byť využitá na meranie glomerulárnej filtrácie. Množstvo voľných aminokyselín vylúčených v moči veľmi závisí od potravy a na účinnosti pečeňových funkcií. Deriváty aminokyselín môžeme tiež nájsť v moči (napr. hippurát, detoxikačný produkt kyseliny benzoovej). Modifikované aminokyseliny, ktoré sa nachádzajú v špeciálnych proteínoch, ako napr. hydroxyprolín v kolagéne alebo 3-metylhistidín v aktíne a myozíne, môžu byť použité ako indikátory degradácie týchto tkanív. Ďalšími zložkami moču sú konjugáty s kyselinou sírovou, glukurónovu, glycínom a inými polárnymi látkami, ktoré sú syntetizované v pečeni biotransformáciou (otázka III/9). Okrem toho, metabolity viacerých hormónov (katecholamíny, steroidy, serotonín,...) sa tiež nachádzajú v moči a môžu poskytnúť informácie o produkcií hormónov. Peptidový hormón choriový gonadotropín, ktorý sa tvorí na začiatku tehotenstva, sa dostáva do moču vďaka svojej relatívne malej veľkosti. Jeho dôkaz v moči imunochemickými metódami využívajú tehotenské testy. Choriový gonádotropín sa patologicky tvorí v tele pri nádorových procesoch. Žltá farba moču je spôsobená hlavne urochrómami, ktoré sú príbuzné žlčovým farbivám vznikajúcim degradáciou hemoglobínu. Ak sa moč nechá postáť dostatočne dlho, oxidácia urochrómov môže spôsobiť jeho stmavnutie. Farba moču sa môže meniť pri rôznych patologických procesoch, napr. moč postátím sčerná pri alkaptonurií, zhnedne pri rhamdomyolýze (tzv. „coca-cola urine“), mierne sčervená pri haematurii (krv v moči) a podobne. Hlavnými anorganickými zložkami moču sú katióny Na + , K + , Ca 2+ , Mg 2+ a NH 4 + a anióny Cl - , SO 4 2- a HPO 4 2- a tiež stopy iných iónov. Na + a Cl - predstavujú 2/3 všetkých elektrolytov vo finálnom moči. Vápnik a horčík sa nachádzajú v oveľa väčších množstvách v stolici. Množstvá rôznych anorganických látok v moči tiež závisí na zložení stravy. Napr. pri acidóze je možné sledovať vzostup amoniaku v moči. Vylučovanie Na + , K + , Ca 2+ a fosfátov ľadvinami je riadené hormonálne (otázka III/5). Bielkoviny sa fyziologicky v moči vyskytujú iba vo veľmi malom množstve (asi 50-80 mg/24h) – fyziologická proteinúria. Asi 40% týchto bielkovín predstavujú plazmatické bielkoviny a zvyšných 60% sú bielkoviny z ľadvín a vývodových ciest močových. Množstvo a zloženie bielkovín v moči závisí na ich filtrácii stenou glomerulárnej membrány, na resorpcii v tubulárnych bunkách a na renálnej hemodynamike. Proteinurie sa môžu klasifikovať do 3 základných skupín a ich delenie má vysokú diagnostickú hodnotu. Prerenálna proteinuria (proteinuria z „pretekania“) vzniká pri vysokých plazmatických koncentráciách nizkomolekulových bielkovín, ktoréaj za fyziologických podmienok môžu prechádzať do ultrafiltrátu. Glomerulárna permeabilita bielkovín nemusí byť porušená. Tubulárna resorpcia môže byť tiež normálna, ale vzhľadom k zvýšenej náloži časť bielkovín uniká do moču, pretože je prekročená resorpčná kapacita proximálneho tubulu. Prerenálna proteinúria vzniká napr. pri nadmernej intravaskulárnej hemolýze, kedy sa v moči objavuje hemoglobín (hemoglobinuria) alebo pri crush sydróme a rabdomyolýze v moči preukazujeme myoglobín (myoglobinemia). Prítomnosť ľahkých reťazcov imunoglobulínov v moči (tzv. Bence-Jonesova bielkovina) svedčí o myelome. Prerenálna proteinuria často sprevádza začiatok niektorých akutných zánětlivých a nekrotizujúcich ochorení, ktoré sú podmienené vylučovaním tkanivových degradačných produktov a v určitej miere aj niektorých nízkomolekulových bielkovín akútnej fázy. Renálna proteinúria sa rozdeľuje podľa postihnutej časti nefrónu na glomerulárnu, tubulárnu a zmiešanú. Globulárna proteinúria je prejavom priepustnosti glomerulárnej steny pre bielkoviny. Pri selektivnej glomerulárnej proteinúrii, kedy zaniká negatívny náboj glomerulárnej membrány, sú v zvýšenej miere do moču vylučované bielkoviny o stredne veľkých molekulách s Mr medzi 70 000-100 000 (hlavne albumín a transferín), zatiaľ čo bielkoviny s vysokou molekulovou hmotnosťou sú zadržiavane. V moči prevažuje albumín, ktorý má najvyšší negatívny náboj. Pri ťažšom poškodení glomerulárnej membrány stráca schopnosť rozlišovať pri filtrácii bielkoviny podľa veľkosti, do moču prenikajú okrem bielkovín o strednej veľkosti aj proteíny o Mr nad 100 000 ako je napr. IgG. Hovoríme o neselektívnej glomerulárnej proteinúrii väčšinou denné straty bielkovín presahujú 2g. Tubulárna proteinúria je podmienená zníženou tubulárnou resorpciou normálne prefiltrovanou bielkovín. Je charakterizovaná zvýšeným vylučovaním nízkomolekulových bielkovín, ktoré sú za fyziologických podmienok v tubuloch resorbované (mikroglobulíny, voľné ľahké reťazce). Veľmi častou príčinou je poškodenie tubulov niektorými nefrotoxicky pôsobiacimi liekmi (cytostatika, niektoré antibiotiká, analgetiká,...) alebo ťažkými kovmi (Hg, Pb, Cd). Tubulárna proteinúria môže sprevádzať niektoré prerenálne proteinúrie, pretože dochádza ku kompetitívnej relatívnej nedostatočnej tubulárnej resorpcie ostatných voľne filtrovaných proteínov. Straty proteínov pri tubulárnej proteinuriinebývajú veľké, asi len 0,3-1,5 g/24 h. Zmiešaná proteinuria je kombináciou neselektívnej glomerulárnej proteinúrie a tubulárnej proteinúrie. Býva prejavom zániku väčšiny nefrónov. Postrenálna proteinúria vzniká pri krvácaniach, nádoroch a zanětoch vývodných ciest močových, kedy dochádza k priamemu prieniku plazmy alebo exsudácii bielkovín do moči. Spoľahlivo sa identifikuje preukázaním plazmatických makromolekulárnych bielkovín o vysoko molekulárnej hmotnosti (mikroglobulíny, IgM), ktoré ani pri neselektívnej proteinúrii neprenikajú stenou glomerulárnej kapiláry. Glukóza filtrovaná do moču z plazmy sa aktívnym transportom spätne resorbuje v proximálnych tubuloch. Organizmus si chráni glukózu pre zbytočnými stratami, preto majú ľadvinové tubuly značnú rezervnú glukózu – za fyziologických okolností je transportný systém vyťažený len asi z jednej tretiny. Pri hyperglykémii využitie transportného systému stúpa a ak prekročí glykémia hodnoty okolo 10 mmol/l (tzv. ľadvinový práh pre glukózu), je kapacita tubulárnej resorpcie prekročená a glukóza prechádza do moču. Straty glukózy v moči väčšie než 0,72 mmol/24 h označujeme ako glukosuriu- Glukozuria je najčastejším nálezom vedúcim k odhaleniu diabetes mellitus. Negatívny nález glukózy v moči však toto ochorenie nevylučuje. Stanovenie glukozurie preto nepatrí medzi základné biochemické parametre pre diagnózu a sledovanie DM. Nález glukozurie je nutné hodnotiť spoločne s vyššou glykemiou na lačno. Na základe glykémie rozlišujeme:  Hyperglykemickú glykosuriu, ktorá je typickým nálezom pri DM. Pri dlhotrvajúcom ochorení sa ale zvyšuje renálny prah pre glukózu a glukozuria môže dokonca vymiznúť. Preto ide iba o orientačné vyšetrenie, na ktorého základe nie je možno riadiť terapiu DM. Prechodne sa môže vyvinuť ak tzv. „alimentárna glykosuria“ ako dôsledok stravy bohatej na sacharidy alebo v priebehu oGTT.  Normoglykemická renálna glykosuria, pri ktorej koncentrácia glukózy v krvi nie je zvýšená. Je dôsledkom poruchy ľadvinných tubulárnych buniek, ktoré zaisťujú spätnú resorpciu glukózy. Môže byť prejavom autozomálne recesívneho ochorenia, častejšie sa vyskytuje napr. pri toxickom poškodení ľadvín postihujúcom funkciu proximálneho tubulu. Zvýšené vylučovanie ketolátok v moči ukazuje na zvýšenú lipolýzu a zvýšenú syntézu acetyl-CoA, ktorý v dôsledku nedostatočnej utilizácie glukózy pri nedostatku inzulínu nie je metabolizovaný normálne v Krebsovom cykle. Výsledkom je hromadenie acetyl-CoA, ktorý kondenzuje na acetoacetát. Väčšia časť acetoacetátu je v pečeni redukovaná na kyselinu 3- hydroxymaslovú a menšia časť spontánne dekarboxyluje na acetón. Stanovenie ketolátok má význam predovšetkým u diabetikov 1.typu. U správne liečeného diabetika ketolátky v moči nenachádzame. Ich prítomnosť svedčí pre metabolickú ketoacidózu a je sprevádzaná hyperglykémiou. Malé množstvo ketolátok v moči sa môže objaviť pri redukcii telesnej hmotnosti alebo pri hladovaní a v tehotenstve. Ketonuria môže svedčiť aj pre poruchu tubulárnych funkcii, kedy je nedostatočná resorpcia ketolátok. U zdravých ľudí sa močom vylúči až milión erytrocytov za deň. Toto veľmi malé množstvo nie je možné preukázať bežnými skúškami. Výskytu väčšieho množstva erytrocytov (hematuria) alebo prienik voľného hemoglobínu, prípadne myoglobínu v definitívnom moči (hemoglobinuria) je takmer vždy patologickým nálezom. Makroskopickú hematuriu pozorujeme okom; moč na naružovelé sfarbenie a spektrofotometricky sa dá v ňom prukázať hemoglobín. V moči býva najmenej 1g hemoglobínu na liter. V prípade masívnej hemoglobinurie môže mať moč až farbu čierneho piva (degradácia hemoglobínu na hemín). Mikroskopická hematuria je preukázateľná iba biochemicky. Leukocyturia je príznakom zánětu ľadvín alebo močových ciest. Príčinou pozitívnych nálezov býva bakteriálna infekcia močových ciest. Dusitany sa v moči stanovujú ako nepriama známka bakteriurie. Normálny moč ich v merateľných množstvách neobsahuje. Niektoré baktérie majú schopnosť redukovať dusičnany na dusitany v moči. Bunky (krvné elementy, epitélie, tubulárne, nádorové), baktérie, mikrooranizmy, válce, kryštály a iné sa môžu stanovovať vyšetrením močového sedimentu. III/16. Extracelulární matrix, extracelulární polysacharidy a proteiny (kolagen, elastin) – struktura, vlastnosti, funkce. Metabolismus kolagenu. Súdržnosť buniek v tkanivách zaisťujú priame kontakty za účasti molekúl bunkovej adhézie, ako je kadehrín alebo extracelulárna matrix (ECM). Táto ECM je u mnohých tkanív prítomná len ako úzky medzibunkový lem, napr. v svaloch alebo pečeni, v iných zaujíma väčší priestor. Mnohým tkanivám, ako je koža, sval alebo ľadvinový glomerulus, dodáva ECM ich charakteristické vlastnosti. Výrazne zastúpená je ECM v pojivových tkanivách, napr. v kostiach, chrupavkách, väzoch alebo šľachách. ECM vykonáva rôzne funkcie: vytvárajú medzi bunkami mechanické spoje, buduje štruktúry so zvláštnymi mechanickými vlastnosťami (pevnosť v ťahu, pružnosť, stálosť tvaru; napr. v kostiach, chrupávkach, šľachách a kĺboch), tvorí filter (napr. v bazálnej membráne ľadvinných teliesok), navzájom oddeľuje bunky a tkanivá (napr. pre dosiahnutie klzkosti vo vnútri kĺbu) a vytvára vodiace dráhy podľa ktorých sa orientujú putujúce bunky (dôležité pre embryonálny vývoj). Rovnako ako je rôznorodá funkcie, je rôznorodá aj chemická štruktúra zložiek ECM. ECM je tvorená predovšetkým bielkovinami a polysacharidmi secernovanými zúčastnenými bunkami, ktoré sa spájajú do komplexnej siete viazanej na povrchu buniek. Medzi hlavné zložky ECM patria stabilizujúce vláknité proteíny, siete tvorené adhezívnymi proteínmi, priestor medzi nimi vypĺňajú glykoproteíny a patria sem aj ECM receptory na povrchu buniek. Medzi vláknité proteíny patrí hlavne skupina kolagénov. Vyskytujú sa v najrôznejších variantách, z ktorých je možné vytvoriť vlákna, fibrily, siete a väzy. Ich charakteristickou vlastnosťou je pevnosť v ťahu a flexibilita. Iný vláknitý proteín elastín vzišuje pružnosť ECM. Adhezívne proteiny vytvárajú spoje medzi rôznymi súčasťami ECM. Radíme k nim laminin, fibrilin a fibronektín. Tieto multifunkčné proteíny sa viažu na rôzne ďalšie zložky matrix a s ich pomocou sa bunky prostredníctvom svojich povrchových receptorov na ECM fixujú. ECM-receptory sa nachádzajú na bunkovom povrchu. Ich najdôležitejšími zástupcami sú integríny. Glykosaminoglykany viažu vďaka svojej polarite a negatívnemu náboju molekuly vody a katióny, napr. bielkoviny ECM. Vypĺňajú ako homogénny „tmel“ medzery medzi vláknami ECM. Integríny tvoria rodinu dimerických membránových proteínov, ktoré spájajú bunky s ECM alebo susednými bunkami. Integríny pritom reverzibilne viažu proteíny, ktorým je často spoločná sekvencia aminokyselín –Arg-Gly-Asp- (RGD-sekvencia), napr. v laminine a fibronektíne. Na vnútornej strane bunky sú integríny v aktívnom stave spojené prostredníctvom talínu a ďalších kotviacich proteínov, ako je vinkulín, a aktínovými filamentami, teda s cytoskeletom (otázka III/37). Naviazanie ECM-proteínu môže byť signalizované do vnútra bunky (outside-in-signal). Tiež podmienky vo vnútri bunky môžu byť signalizované navonok a riadiť tak väzbu na ligandy (inside-out-signal). Integríny sa vyskytujú ako v aktívnej forme, tak aj v neaktívnej väzby neschopnej forme. Mechanický ťah upevňuje spojenie proteínov v ECM. K typickým zástupcom adhezívnych proteínov patria fibronektíny. Sú to vláknité diméry tvorené dvomi príbuznými peptidovými reťazcami (každý o hmotnosti 250 kDa), ktoré sú navzájom spojené disulfidickými väzbami. Fibronektíny sa členia na početné domény, ktorých prostredníctvom sa viažu na bunkové povrchy, kolagény, fibrín a rôzne proteoglykany. Preto sa chovajú ako „molekulárne lepidlo“. Štruktúra fibronektínových domén je tvorená niekoľkými typmi peptidových modulov, ktoré sa mnohokrát opakujú. Každý z viac ako 50 modulov je kódovaný jedným exonom fibronektínového génu. Z hnRNA fibronektínového génu sa alternatívnym zostrihom tvoria fibronektíny rôzneho zloženia. Proteoglykany sú obrovské molekulárne komplexy zo sacharidov (asi95%) a bielkovín (asi 5%) s hmotnosťou presahujúcou až 2.10 6 Da,. Ich štruktúru pripomínajúcu kefu na čistenie fliaš (kartáč načistění lahví) podporuje osa tvorená kyselinou hyaluronovou. Na tomto vláknitom polysacharide sú pripojené proteíny, z ktorých opäť vyčnievajú dlhé polysacharidové reťazce. Tieto polysacharid radíme k skupine gylkosaminoglykanov. Glykosaminoglykany sú zložené z opakujúcich sa disacharidových jednotiek, ktoré tvorí jedna kyselina urónová (kyselina glukurónová alebo iduronová) a jeden aminocukor (N-acetylglukosamin alebo N-acetylgalaktosamin). Početné amincukry sú naviac esterifikované (sulfatované) kyselinou sírovou, čo zvýši ich polaritu. Medzi 5 najdôležitejších glykosaminoglykanov patrí hyaluronát, dermatansulfát, heparín, keratansulfát a chondroitinsulfát. Proteoglykany nesú následkom prítomnosti mnohých karboxylových a sulfátových skupín silne negatívny náboj. Viažu preto značné množstvo iónov, ktoré sú opäť spojené veľkým množstvom vody. Ako hydratovaný gél vypĺňajú medzery medzi fibrilárnymi štruktúrami medzibunkovej hmoty. Proteoglykany nie sú len štrukturálnou súčasťou ECM, ale viažu aj iné secernované proteíny, čím regulujú svoju aktivitu. Bazálna membrána predstavuje zvláštnu formu ECM. Ako tenká vrstva sa nachádza pod epitelovými bunkami a tiež povlieka niektoré druhy buniek, napr. svalové alebo tukové. Bazálna membrána oddeľuje tieto bunky od pojivového tkaniva a mechanicky ich spája s okolím. Môže fungovať ako filter (v ľadvinách), riadi polaritu buniek, organizuje bielkoviny priliehajúcej plazmatickej membrány, kontroluje prežitie, proliferáciu a diferenciáciu buniek a slúži ako vodiaca dráha pre putovanie buniek. Hlavnými súčasťami bazálnej membrány sú kolagén IV.typu, laminin, nidogen a proteoglykan prelekan. Okrem nich sú prítomné podľa typu tkaniva aj ďalšie proteíny ako kolagény a fibronektín. Proteín ECM laminin organizuje plochú štruktúru bazálnej membrány. Tvorí ho dlhá krížovitá molekula z troch peptidových reťazcov spojených disulfidickými väzbami. Laminin môže na povrchu buniek sám agregovať do plochej siete, ktorá je následne prepojená s ďalšími komponentmi ECM. Nidogen a perlekan sa pritom zúčastňujú ako spojovacie elementy, obzvlášť medzi sieťami lamininu a kolagénu. Komponenty ECM vykazujú veľmi pomalý metabolizmus. Iba v niektorých situáciách môže byť tvorba a/alebo štiepenie ECM urýchlené, napr. pri vývojových procesoch ako je rast alebo bunkové delenie, pri putovaní buniek, zánětu alebo zranení. Štiepenie proteínov ECM pritom prebieha pôsobením špecifických proteáz. Medzi nimi hrajú významnú úlohu matrixové metaloproteázy (MMP). Členovia tejto enzýmovej rodiny obsahujú v svojom aktívnom centre zinočnaté ióny. Jednotlivé MMP sa špecifikujú na odbúravanie určitých proteínov medzibunkovej hmoty. Následkom štiepenia matrixových proteínov sa štruktúra ECM rozpadá. Pritom sa môžu uvoľniť doposiaľ viazané tkanivové rastové faktory, ktoré stimulujú obnovenie ECM a rast tkanív. Metastázujúce nádorové bunky využívajú MMP k uvoľneniu a rozsevu. Vedľa MMP sa štiepenia matrixových proteínov zúčastňujú aj serínové proteázy, ktoré sa využívajú aj napr. na rozpúšťanie krvných zrazenín. V aktívnom centre obsahujú serínový zvyšok. Okrem iného sú významné ak enzýmy plazmín, tPA (tissue plasminogen activator) a uPA (urokináza). Aktivita matrixových proteáz je dôkladne kontrolovaná. Deje sa tak pomocou:  sekrécie enzýmov vo forme neaktívnych prekurzorov aktivovaných limitovanou proteolýzou; takto sa mení Pro- MMP na MMP a plazminogén na plazmín.  lokálneho obmedzenia účinku následkom väzby proteáz na membránové receptory, napr. MMP a uPA  špecifických inhbítorov TIMP (tissue inhibitors of metalloproteinases) inaktivujúcich MMP a serpínov inaktivujúcich serínové proteázy Medzi živočíšnymi bielkovinami zaujímajú kolagény svojimi 25% z hľadiska množstva prvé miesto. Ako charakteristické súčasti extracelulárnej matrix sú kolagény vláknité extracelulárne uložené štruktúrne proteíny zaisťujúce pevnosť tkaniva voči ťahu. Kolagény sú syntetizované vo veľkom množstve pojivových buniek. Doposiaľ bolo popísaných 28 rôznych typov kolagénov rozlíšených rímskymi čislicami. Ich spoločným znakom je pravotočivý trojitý helix (trojzávitnica) tvorený tromi veľmi dlhými α- reťazcami. V sekvencií tripelhelikálnych oblastí sa stále opakujú aminokyseliny –Gly-X-Y-. Každá tretia aminokyselina je tu glycín. Na pozíciách X a Y sa často nachádza aminokyselina prolín (Pro), pozíciu Y niekedy zaujíma 4-hydroxyprolín (4Hyp), 3-hydroxyprolín (3Hyp) alebo tiež 5-hydroxylyzín (5Hyl). Tieto aminokyseliny sú charakteristickými zložkami kolagénov. Vytvárajú sa posttranslačne hydroxyláciou aminokyselinových zvyškov v peptidovej väzbe až po biosyntéze proteínov. Ich tvorba je katalyzovaná oxygenázami (prolinhydroxyláza a lyzinhydroxyláza), obsahujúcimi železo, ktorých funkčnosť je udržiavaná askorbátom (vitamín C) ako redukčným činidlom. Množstvo symptómov amvitaminózy C (skorbut) je možné vysvetliť ako poruchu biosyntézy kolagénu. Hydroxyprolíové zvyšky trojzávitnicu stabilizujú vytvorením vodíkových mostíkov medzi α-reťazcami, zatiaľ čo sú hydroxylové skupiny hydroxylyzínu čiastočne glykozylované disacharidom (-Glc-Gal). Rôzne typy kolagénu sú rozdelené podľa typu tkaniva. Tvoria ich odlišné kombinácie α-reťazcov (α1 až α3 s ďalšími subtypmi). Asi 90% všetkých kolagénov sa skladá z typov I (vyskytujú sa hlavne v koži a kostiach), II (v chrupavke), III (v retikulárnych vláknach) a IV (v bazálnej membráne). Podľa ich vlastností je možné kolagény rozdeliť na:  fibrilárne kolagény: I, II, III, V a IX  sieťovité: IV, VIII a X  asociované s fibrilami: IX, XII, XIV a XXII  podobné šnúrke perál: VI  kotviace: VII  transmembránové: XIII, XVII, XXIII a XXV Trojzávitnicu kolagénu I.typu tvoria 2 reťazce α 1 a jeden α 2 . Extracelulárne agregujú početné molekuly tropokolagénu (hmotnosť 285 kDa) v definitívnom usporiadaní na cylindrické fibrily. V elektrónovom mikroskope vykazujú tieto fibrily typické pruhované usporiadanie. Molekuly tropokolagénu sú predovšetkým na koncoch navzájom pevne spojené kovalentnou sieťou lyzínových bočných reťazcov. Počet týchto spojení sa vekom zvyšuje. Konečne sa fibrily skladajú do kolagénnych vláken a spájajú sa s bunkovou membránou. Kolagénové prekurzovy (preprokolagen) vznikajú na rER postrtranslačnými modifikáciami. Odštiepením signálneho peptidu vzniká prokolagén nesúci na svojich koncoch ešte veľké peptidové úseky (1). Najprv dochádza k hydroxylácií väčšiny prolínových a časti lyzínových zvyškov pokolagénu (2). Potom je prokolagén na hydroxylovaných zvyškoch glykozilovaný (3) Medzi prepeptidami sa vytvoria intramolekulárne disulfidové mostíky (4), čo umožní korektné zloženie peptidových reťazcov na trojzávitnici (5). Po prebehnutí tohto kroku je prekolagén transportovaný do Golgiho aparátu, kde sa zbalí a exocytózou vylúči do extracelulárneho priestoru (6). Teraz dôjde k proteolytickému odtrhnutiu N a C- terminálnych prepeptidov (registračné peptidy) (7) a vznikne tropokolagén, ktorý stupňovitým navrstvením agreguje na fibrily. Konečne dôjde k oxidatívnej zmene niektorých ε-aminoskupín lyzínových zvyškov na aldehydové skupiny. Následkom vzájomnej kondenzácie sa molekuly kovalentne sieťovito prepoja. Tak získa kolagén svoju definitívnu štruktúru vyznačujúcu sa pevnosťou v ťahu a rezistenciou k proteázam. Elastín je proteín pojiva, ktorý je pružný a dodáva pojivu pružné vlastnosti. Elastické vlakna pozostávajúce z elastínu a glykoproteínových mikrofibril nachádzame v pľúcach, stenách veľkých artérií a elastických ligament. Môžu sa natiahnuť na viacnásobok ich dĺžky, ale vrátia sa do pôvodného stavu, keď ťažná sila prestane pôsobiť. Elastín je nerozpustný proteín, ktorý sa syntetizuje zo svojho prekurzoru, tropoelastínu, ktorý je lineárnym polypeptidom zloženým z okolo 700 aminokyselín, ktoré sú primárne nepolárne (napr. glycín, alanín, valín,...). Elastín tiež obsahuje mnoho prolínu a lyzínu, ale obsahuje iba malé množstvo hydroxylzínu a hydroxyprolínu. Tropoelastín je vylučovaný bunkami do ECM, kde interaguje so špecifickými glykoproteínovými mikrofibrilami (napr. fibrilínom), ktorých funkciou je vytvárať oporu, do ktorej sa zakomponuje tropoelastín. Niektoré lyzíny v tropoelastíne sú oxidatívne deaminázované lyzilovou oxidázou, čím vznikajú allyzínové zvyšky. Tri allyzínové zvyšky a jeden nezmenený lyzínový zvyšok z rovnakého alebo susedných polypeptidov vytvoria demozínové spojenie. Takto vzniká elastín – veľmi prepletená, pružná sieť, ktorá sa vie natiahnuť a ohnúť do všetkých smerov, čím dodáva tkanivu elasticitu. III/17. Biochemie pojiva (chrupavka, kost). Bunky pojivového tkaniva pochádzajú z mezenchýmových kmeňových buniek. Zahŕňajú fibroblasty, bunky chrupavky a kostné bunky (osteoblasty) a tiež bunky endotelové a žírne. Pojivové bunky sú špecializované na sekréciu extrecelulárnych bielkovín, hlavne kolagénov, s ktorými vytvárajú extracelulárnu matrix (otázka III/16). Týmto spôsobom vznikajú kosti, chrupavky, šľachy a väzy. Pojivové bunky tiež zodpovedajú za premeny týchto štruktúr. Kosti predstavujú zahustenú špecializovanú formu pojivového tkaniva. Okrem funkčnej opory tiež zodpovedajú za ukladanie fosfátových a kalciových iónov, naviac v kostnej dreni prebieha tvorbe krvných buniek. Najdôležitejšou minerálnou zložkou kostí je zo 70% apatit, forma kryštalického fosforečnanu vápenatého Apatity sú katiónové komplexy zlúčeniny z troch ligandov Ca 2+ a troch (PO 4 ) 2- , ku ktorým sa zaradzujú ďalšie anióny HPO 4 2- , CO 3 2- , OH - alebo F - . V závislosti na protejším iónu sa apatit vyskytuje ako karbonátapatit Ca 10 (PO 4 ) 6 CO 3 , hydroxyapatit Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 alebo fluoroapatit Ca 10 (PO 4 ) 6 F 2 . Naviac je v kostiach ešte uhličitan vápenatý. U dospelého človeka sa v kostiach nachádza cez 1 kg vápniku. S pomocou osteoblastov a osteoklastov sa vápnik nepretržite do kostí ukladá a z kostí vyplavuje, čo je riadené viacerými hormónmy. Kalcitonín zvyšuje ukladanie vápniku do kostnej hmoty, parathormón (paratyrín, PT) podporuje uvoľňovanie vápniku a kalcitriol zlepšuje mineralizáciu. Najdôležitejšími organickými zložkami kostí sú kolagény (hlavne I. typu) a proteoglykany. Vytvárajú extracelulárnu matrix, do ktorej sa ukladajú kryštale apatitu (biomineralizácia). Na tomto procese tvorby kostí sa podieľajú rôzne proteíny, medzi nimi kolagény a fosfatázy. Alkalická fosfatáza je prítomná v osteoblastoch a kyslá fosfatáza v osteoklastoch. Obe enzýmy sú pre kostné bunky považované za markerové. Ukladanie vápniku do kostí (mineralizácia) a jeho mobilizácia z kostí je riadená najmenej 15 hormónmi a ním podobnými signálnymi látkami. Ovplyvňujú predovšetkým zrenie a aktivitu kostnýchbuniek. Osteoblastydeponujú kolagén, vápenaté ióny a fosfát a tvoria tak novú kostnú hmotu, zatiaľ čo osteoklasty, odvodené od makrofágov secernujú H + a kolagenázy, ktoré kosti lokálne rozpúšťajú (prestavba kostí). Osteoblasty a osteoklasty sa navzájom aktivujú cytokínmi a rastovými faktormi, ktoré sami produkujú. Prispievajú tak k udržaniu rovnováhy medzi tvorbou adeštrukciou kostí. DO týchto vzťahov kostných buniek zasahujú Ca 2+ -selektívne hormóny kalcitriol, parathormón a kalcitonín. Parathormón podporuje uvoľnenie vápniku stimuláciou tvorby cytokínov v osteoblastoch. Cytokíny následne pozitívne ovplyvňujú zrenie osteoklastov z nezrelých buniek. Kalcitonín tieto procesy tlmí za súčasnej podpory zrenia osteoblastov. Estrogény bežne potláčajú stimulačný vplyv osteoblastov na diferenciacií osteoklastov. Keď sa účinok estrogénov oslabí, premnožia sa osteoklasty a dôjde k prehnanej deštrukcií kostnej štruktúry (osteoporóza). Účinok steroídneho hormónu kalcitriolu je komplexný. Na jednej strane podporuje cestou podpory diferenciácie osteoblastov tvorbu kostí. To je výrazne hlavne u malých detí, kde nedostatok kalcitriolu spôsobuje poruchy mineralizácie (rachitis). Na strane druhej zvyšuje kalcitriol zvýšenú mobilizáciu vápniku z kostí jeho hladinu v krvi. Predávkovanie vitamínom D (kalciol), prekurzorom kaltriolu, má preto na kostru rovnaký účinok ako jeho nedostatok (hypervitaminóza). Chrupavka je podporné pojivové tkanivo, ktoré vzniká z mezenchymu. Je bezcievna (živiny prijíma difúziou z okolia), pevná, poddajná a takmer neregeneruje. Chrupavka predstavuje základ pre vývoj kostrového skeletu. Chrupavka je tvorená chondrocytmi (bunky chrupavky) a extracelulárnou matrix, ktorú tvorí vláknitá (podmieňuje pevnosť a pružnosť) a amorfná zložka (uplatňuje sa pri výžive). Extracelulárnu matrix chrupavky tvorí kolegén, kyselina hyaluronová, proteoglykany, glykosaminoglykany, glykoproteíny, elastín (v elastickej chrupavke) a iné. Po chemickej stránke chrupavku tvorí zo 60% voda a 40% pripadá na proteíny (najmä kolagén a glykoproteíny). Rozlišujeme tri typy chrupavky: hyalinnú, elastickú a väzivovú. Hyalinná chrupavka je najrozšírenejším typom chrupavky v tele. Vyskytuje sa v nosnej chrupavke, skelete laryngu, spojení rebier so sternom a kĺbnych chrupavkách. Je pomerne tvrdá a tvorí základ skeletu plodu. CHondrocyty v nej sú usporiadané do tzv. izogenetických skupín. Extracelulárnu matrix hylinnej chrupavky tvorí kolagén typu II, chondroitínsulfát A, C a keratansulfát. Elastická chrupavka je veľmi pružná a ohybná vďaka obsahu elastínu. Vyskytuje sa v stene priedušiek, chrupavkách hrtanu, epiglottis, ušnom boltci a časti vonkajšieho zvukovodu. Elastická chrupavka je tvorená kolagénnymi a elastickými vláknami. Väzivová chrupavka predstavuje prechod hustého neusporiadaného kolagénneho väziva a chrupavky. Vyskytuje sa v medziobratlových doštičkách, symphysis pubica, vo vnútri kostí a v kĺbnom disku čeľustného kĺbu. V tomto type chrupavky prevažuje vláknitá zložka extracelulárnej matrix a vyskytuje sa v nej len málo chondrocytov. Extracelulárnu matrix tvorí hlavne kolagén I a II, ktorý chrupavke dodáva veľkú mechanickú odolnosť v ťahu a tlaku, čo sa uplatňuje v stavbe medziobratlových doštičiek. III/18. Biochemie kůže (bariérová funkce, vitamín D, cytokeratiny, mezibuněčná spojení, biosyntéza melaninů). Koža cicavcov sa skladá z epidermis ektodermálneho pôvodu a z koria, ktoré patrí medzi spojivové tkanivá. Chemicky sa koža skladá najmä z vody (kolísa s vekom od 80% u novorodencov až k 63% u starších ludí), z elektrolytov najmä z chloridov a zastúpenie organických látok sa líši v každej vrstve kože. V epidermis výrazne prevláda keratín, nerozpustná bielkovina s α- konformáciou, ktorá sa môže navlhčením (pričom sa rozrušia vodíkové mostíky) meniť na roztiahnutú β-štruktúru. Tento prechod je typický pre keratín vlasu – po navlhčení sa roztiahne a je pružný, ale po vysušení sa vracia do pôvodnej štruktúry. Pre keratín je vysoké percento cystínu. Keratín v koži sa označuje aj ako tzv. „mäkký“ keratín s približne 2% síry a keratín vlasov sa označuje ako „tvrdý“ keratín s obsahom aj viac ako 5%. Keratín je vzhľadom k vysokej hustote disulfidických mostíkov vo vode úplne nerozpustný a spoľahlivo odoláva kyselinám, soliam a slabým zásadám. Bazálna membrána v dermoepidermálnom spojení je zložená z kolagénu IV a lamininu. Hlavnou súčasťou kória a podkožného väziva je kolagén I (vo fetálnej koži je kolagén III), menej sa tu nachádza vláken elastínu, ktorý aj tak rozhoduje o pružnosti kože. Ďalšou funkčne významnou súčasťou kória sú proteoglykany, zložené z glykosaminoglykanov hyluronátu a dermatansulfátu a proteínovej zložky. Glykosaminoglykany zodpovedajú za hydratáciu kože, trvalý pokles obsahu GAG s vekom sa odráža v stále klesajúcej hydratácií a tvorbe vrások. V podkoží sú hojné adipocyty. Produktom kožných žliaz je kožný maz, ktorý sa produkuje pod vplyvom androgénov ako olej, ktorý pri nízkej teplote tuhne. Je zložený hlavne z triacylglycerolov, cholesterolu a jeho esterov a fosfolipidov a nachádzajú sa tu aj hydrofóbne vosky. Tiež v ušnom maze (cerumen) je obsah lipidov vysoký. O permeabilite kože pre vodu a lipidy rozhoduje obsah ceramidu, z tohto dôvodu sa používa ako zložka kozmetických prípravkov. Produktom potných žliaz je pot. Látky obsiahnuté v pote sú buď obsiahnuté vo vyššej alebo nižšej koncentrácií ako v krvnej plazme. Z komponentov s vyššou koncentráciou sú v pote obsiahnuté ióny K + , uráty, pyruvát a urokanát. Naopak nižšie zastúpenie má väčšina anorganických iónov a hlavne NaCl, ktoré sa však pri výdatnom potení môžu vylučovať aj v podstatnom množstve. Nižšiu koncentráciu v pote majú aj dusíkaté látky a glukóza. V pote je obsiahnutá aj kyselina mliečna, ktorá môže mať antibakteriálne účinky. K provokácií exkrécie potu sa používa alkoloid pilokarpín. V koži prevažuje anaeróbny metabolizmus a menej často sa uplatňuje aeróbny metabolizmus. Metabolizmus v epidermis (okrem najvrchnejšej rohovej vrstvy) je zreteľne živší ako v dermis. V koži sú podstatným zdrojom energie sacharidy. Koža metabolizuje glukózu hlavne anaeróbne. Ako východisko slúži do istej miery v epidermis a vo vlasových folikuloch prítomný glykogén, enzýmy jeho syntézy a degradácie v bunkách kože sú výkonné. V období reparácie tkaniva a v koži postihnutej psoriázou sa uplatňuje okrem glykolýzy aj pentózový cyklus. V koži prítomné glykosaminoglykany v podobe proteoglykanov odpovedajú za hydratáciu tkaniva. Kožný hyaluronát podlieha účinku hyaluronidázy bakteriálneho pôvodu; hyalurnidáza je útočnou zbrańou niektorých baktérií, ktorou si otvárajú prostredníctvom poklesu viskozity cestu k šíreniu v podkoží – to je mechanizmus šírenia plošných zánětov alebo flegmón. Koža – kórium a spodné vrstvy epidermis – sú miestom syntézy lipidov. Obsah lipidov je dôležitý pre priestupnosť kože pre vodu. Dermatologovia zdôrazňujú zvláštny význam ceramidu v tomto zmysle. Pôsobeným acetónu a detergentov obsah lipidov v koži klesá, ale pokles hneď vyvolá novú syntézu lipidov. Mastné kyseliny predstavujú ďalší energetický zdroj pre bunky kože, obzvlášť pri nedostatočnom prísune glukózy. Dôležitým zdrojom energie pre kožu je taktiež glutamín, ktorého je v koži veľa, ale aj v plazme je veľmi bežný. Pri urýchlenom katabolizme (napr. po popáleninách), sa z kože vyplavujú veľké množstvá glutamínu. Histidín uvoľnený z kožných bielkovín je zdrojom urokanátu, ktorý prispieva (spolu s melanínom) k absorpcií ultrafialového žiarení, predstavuje súčasť prirodzeného UV-A filtra. Proces keratinizácie je v epidermis trvalý dej, sprevádzaný zánikom buniek a stratou vody. Zdá sa, že ho vyvoláva stále výraznejší nedostatok kyslíku so vzdiaľovaním sa od stratum germinativum. Spolu so zahusťovaním keratínu sa zvyšuje tiež obsah organických kyselín. Rýchlosť proliferácie buniek stratum basale, teda počet mitóz v nich, je premenlivá a závislá na poškodení . už drobné poškodenie epidermis rýchlosť zvyšuje. Epidermis produkuje tkanivové hormóny chalony, ktoré regeneračné pochody stimulujú. Rýchlosť „posunu“ keratinu k povrhu kože a vytvorenie zrohovatelých šupín na povrchu tela sa zvyšuje za patologických okolností. Ale aj za normálnych okolností stráca telo v podobe šupín značné množstvo dusíku – priemerne 2 g denne. Melanocyty ľudskej kože obsahujú ťažko štiepitelné častice – melanosomy, ktoré svojím obsahom pigmentu melanínu zodpovedajú za pigmentáciu kože a vlasov. Melanín vzniká z DOPA cez dopachinon, ktorý sa zložitými reakciami polymerizuje na hnedočervený eumelanín. Doposiaľ nie je jasné, aká je u človeka fyziologická úloha hormónu melanotropínu (MSH), aj keď bolo preukázané, že aplikácia melanotropínu zvyšuje syntézu melanínu a koža behom 24 hodín viditeľne stmavne. Naproti tomu nedostatočnou tvorbou melanínu v koži a v očiach sa vyznačuje albinizmus. Koža albínov je citlivá na ožiarenie slnkom a reaguje naňho rýchlym vznikom erytému (začervenenie). Intenzita pigmentácie – tvorba kožného melanínu – závisí na ožiarení slnkom. Začiatok melanogenézy, reakcie katalyzovanej tyrozinázou, je tlmená kyselinou L-askorbovou. Výrazný útlm tvorby melanínu bol popísaný v pokusoch in vitro. Zosvetlenie vlasov opálených ľudí sa vykladá oxidačným pôsobením reaktívnych metabolitov kyslíku vzniknutých ožiarením UV- svetlom. Ľudská koža je producentom špeciálnych faktorov pôsobiacich na celé telo. Pôsobením ultrafialového žiarenia sa konvertuje 7-dehydrocholesterol na pre- vitamín D a ďalej na D-hormón (otázka II/31). Z keratinocytov sa vyplavujú niektoré rastové faktory a interleukíny 1, 3, 6 a 8. Pre imunitné deje majú význam Langerhansové bunky epidermis, ktoré majú za úlohu prezentáciu antigénov; predávajú ich T-lymfocytom v regionálnych lymfatických uzlinách. Hlavne UV- A vyvoláva imunosuprésiu; kde je imunosupresia najsilnejšia, je aj najväčšia náklonnosť k vzniku zhubného bujenia (melnómu aj nemelanómových nádorov). Za tvorbu vrások na starnúcej koži odpovedajú hlavne reaktívne metabolity kyslíku, ktoré sa tvoria vplyvom UV-A žiarenia a ešte viac cigaretovým dymom. Proti týmto vplyvom chránia kožné antioxidanty – α-tokoferol a askorbat. Pri ožarovaní koncentrácia kožného askorbátu klesá. III/19. Kontraktilní aparát, řízení kontrakce hladké a kosterní svaloviny. Vďaka existencií svaloviny sa môže organizmus pohybovať. Okrem kostrovej svaloviny, ktorej kontrakcie sú kontrolované vôľou, existuje aj autonómne aktívnej srdcovej svalovine (myokard) a tiež samovoľne pracujúca hladká svalovina. Vo všetkých typoch svaloviny prebiehajú kontrakcia na princípe kooperácie aktínu a myozínu. Priečne pruhované svaly sú tvorené paralelne prebiehajúcimi zväzkami svalových vláken. Každé vlákno predstavuje jednu veľkú mnohojadrovú bunku. Jej cytoplazma obsahuje 2-3μm hrubé myofibrily väčšinou prebiehajúce po celej dĺžke vlákna. Pre kostrové svaly je charakteristickou vlastnosťou priečne pruhovanie. Spôsobuje ho pravidelné usporiadanie molekúl rôznej hustoty. Opakovane sa kontrahujúce jednotky, sarkoméry, sú ohraničené Z-prúžkami, z ktorých po oboch stranách vybiehajú slabé filamenta z F-aktínu. V A-zóne sú naviac paralelne uložené silné filamentá z myozínu. H-prúžok v centre A-zóny obsahuje iba myozín, zatiaľ čo po oboch stranách Z-prúžku sa nachádza iba aktín. Myozín je s asi 65% kvantitatívne najdôležitejšou bielkovinou myofibríl. Má tvar golfovej palice . Ide o hexamernú molekulu tvorenú dvomi identickými ťažkými peptidovými reťazcami a štyrmi ľahkými reťazcami. Na N-konci každého ťažkého vlákna je vytvorená globulárna hlavica prechádzajúca do 150 nm dlhého chvosta, v ktorom sú obe vlákna vzájomne spletené vo forme superhelixu. Menšie podjednotky sú uložené v hlavovej oblasti. Myozín je organizovaný ako zväzok mnohých stoviek molekúl stupňovito usporiadaných ako „silného myozínového filamenta“. Jeho hlavová časť pôsobí ako ATPáza, ktorej aktivita je modulovaná malými podjednotkami. Aktín je najdôležitejšou zložkou „slabých filament“ a tvorí 20- 25% svalových bielkovín. F-aktín je tiež dôležitým konštrukčným prvkom cytoskeletu (otázka III/37). Tento vláknitý polymér sa nachádza v rovnováhe so svojím monomérmom G-aktínom, K ďalším bielkovinovým zložkám svalu patria tropomyozín a troponín. Tropomyozín sa ukladá ako tyčkovitý dimér na F-aktín a navzájom spojuje asi sedem akínových jednotiek. Na konci tropomyozínu je naviazaný heterotrimérny troponín. Vedľa týchto bielkovín existuje množstvo ďalších svalovo špecifických proteínov, medzi nimi titín, ktorý patrí s necelými 3000 kDa medzi najväčšie doposiaľ známe bielkoviny, ďalej aj α- a β-aktinín, dezmín a vimentín. Mechanizmus svalovej kontrakcie je vysvetľovaný na modely kĺzavých filament. Podľa neho sa sarkoméry skracujú, keď sa slabé a silné filamentá navzájom posúvajú za spotreby ATP. Behom kontrakcie opakovane nasledujú reakcie: (1) V kľudovom postavení sú myozínové hlavice viazané na aktín. K jemu vzájomnému odlúčeniu dôjde spojením myozínu s ATP (zmäkčujúci účinok ATP). (2) Myozínová hlavica hydrolyzuje ATP na ADP a P i , obe reakčné produkty však najprv zostávajú naviazané, Rozklad ATP spôsobí alosterické „napnutie“ myozínovej hlavice. (3) Teraz vytvorí myozínová hlavica nové spojenie s okolnými aktínovými molekulami. (4) Aktín vyvolá uvoľnenie P i a zakrátko tiež ADP. Tým sa konformačne zmení postavenie myozínovej hlavice, ktoré sa prejaví ako „úder veslom“. (5) Pohyb sa uskutočnil. Ak je k dispozícií ATP, môže sa cyklus opakovať, takže silné filamentá sa stále pohybujú pozdĺž slabých smerom k Z-prúžku. Každý „úder veslom“ zhruba 500 hlavíc jedného silného filamenta vyvolá skrátenie asi o 10 nm a opakuje sa pri silnej svalovej kontrakcií asi 5x za sekundu. Tak dôjde k vzájomnému priblíženiu celého komplexu slabých filament, H-prúžok sa zúži a Z-prúžky sa navzájom priblížia. Svalová kontrakcia je vyvolaná motorickými neurónmi, ktoré vylúčia na neuromuskulárnej platničke neurotransmiter acetylcholín (ACh). Ach difunduje úzkou synaptickou štrbinou, viaže sa na nikotínový acetylcholinový receptor na plazmatickej membráne svalovej bunky (sarkoléma) a tým otvorí s receptorom integrovaný iónový kanál. Jeho prostredníctvom preniká Na + vyvolávajúci na sarkoléme vznik akčného potenciálu. Akčný potenciál z platničky sa šíri všetkými smermi a kompletne podráždi všetky svalové vlákna. S oneskorením niekoľkých milisekúnd na podráždenie odpovie kontraktilný mechanizmus skrátením svalových vláken. Akčný potenciál vzniknutý na neuromuskluárnej platničke v svalovej bunke vyvolá prechodný vzostup koncentrácie Ca 2+ v cytoplazme svalového vlákna (sarkoplazma). V kľudovom stave je tu hladina Ca 2+ veľmi nízka (pod 10 -7 mol/l). Sarkoplazmazmatické retikulum (SR), obdoba endoplazmatického retikula, naopak obsahuje ióny Ca 2+ v približnej koncentrácií 10 -3 mol/l. SR je rozvetvená organela sieťovito obopínajúca myofibrily vo vnútri svalových vláken, Vysoká koncentrácia Ca 2+ iónov v SR je udržovaná Ca 2+ -transportujúcimi ATPázami. Naviac sa tu nachádza kalsekvestrín, proteín viažuci prostredníctvom kyslých aminokyselinových zvyškov množstvo Ca 2+ iónov. Prenos akčného potenciálu na SR facilizujú transverzálne tubuly (T- tubuly), ktoré sú otvorené smerom do extracelulárneho priestoru a tvoria úzke spojenie na SR, Zmena membránového potenciálu aktivuje dihydropyridínové receptory (DHPR), kalciové kanály na T-tubuloch, ktoré následne navodia aktiváciu ryanodinových receptorov na SR. To sú tiež kalciové kanály otvárajúce sa mechanickým kontaktom s DHPR či väzbou na Ca 2+ alebo iného posla. Kalciové ióny potom prejdú zo SR do sarkoméry, kde spôsobia rýchly vzostup koncentrácie Ca 2+ , čo následne stimuluje myofibrily ku kontrakcií. Priebeh kontrakcie v myokarde je podobný ako v bunkách kostrovej svaloviny, ale extracelulárna Ca 2+ vyvolávajúca vzostup intracelulárneho Ca 2+ má pre kontrakciu väčšiu dôležitosť. Naopak v hladkej svalovine má Ca 2+ odlišnú funkciu. Bunkám chýba troponín prítomný v kostrovej svalovine. Aktivácia aktín-myozínovej kontrakcie preto prebieha buď prostredníctvom Ca 2+ - vižuceho kaldesmonu alebo fosforyláciou malej myozínovej podjedntoky. Svalové uvoľnenie (relaxácia) závisí na poklese koncentrácie Ca 2+ na menej ako 10 -6 mol/l. Tohto stave je dosiahnuté transportom Ca 2+ pomocou kalciovej pumpy poháňanej ATP do SR a extracelulárneho pristrou. Využívaný je tiež antiportér Na + /Ca 2+ . Uvedené procesy priamo či nepriamo spotrebúvajú ATP. V uvoľnenom kostrovom svale blokuje komplex tvorený troponínom a tropomyozínom prístup myozýnových hlavíc k aktínu. Troponín je zložený z troch odlišných podjednotiek (T, C a I). Rýchly vzostup cytoplazmatickej koncentrácie Ca 2+ následkom otvorenia kalciových kanálov SR navodí väzbu Ca 2+ na troponínovú podjednotku C veľmi podobnú kalmodulínu. Tá vyvolá konformačnú zmenu troponínu, následkom čoho sa celý komplex z troponínu a tropomyozínu trochu posunie a uvoľní jedno väzbové miesto pre myozín. Tým je spustený kontrakčný cyklus. Hneď ako dôjde aktívnym transportom do SR k rýchlemu zníženiu sarkoplazmatickej koncentrácie Ca 2+ , stráca troponín naviazané ióny Ca 2+ a vracia sa do pôvodného stavu, v ktorom je väzobné miesto pre myozín a aktín blokované. Tým sa kontrakcia ukončuje. III/20. Markery poškození svalové tkáně, význam, stanovení. Akútne koronárne syndrómy (AKS; akútny infarkt myokardu a nestabilná angina pectoris) vznikajú na podklade uzáveru koronárnej tepny väčšinou v dôsledku trombotických komplikácií. Pri obmedzenom krvnom prietoku nastáva ischémia myokardu, ktorá je zo začiatku reverzibilná. Ak sa nepodarí dostatočne skoro obnoviť prietok krvi, nastupujú zhruba po hodine ireverzibilné zmeny sprevádzané zánikom buniek a nekrózou (definitívny infarkt myokardu). Na diagnostike akútneho koronárneho syndómu sa významným spôsobom podieľajú laboratórne vyšetrovacie metódy. Biochemicky dôležité zložky kardyomyocytu sa nachádzajú v cytoplazme alebo v mitochondriách a ďalšie sú súčasťou kontraktilneho aparátu. Pri infarkte myokardu sa uvoľňujú do cirkulácie. Priebeh ich sérových hladín je závislí od:  Lokalizácií v bunke – pri krátkodobej ischémií sa v dôsledku funkčných a neskôr aj štrukturálnych zmien bunkovej membrány do krvnej cirkulácie vyplavujú cytoplazmatické bielkoviny; pri dlhodobej ischémií sa vyvíja nekróza tkaniva a do obehu sa uvoľňujú aj štrukturálne bielkoviny; cytoplazmatické bielkoviny sa teda uvoľňujú rýchlejšie než štrukturálne bielkoviny  Relatívnej molekulovej hmotnosti – menšie bielkoviny sa uvoľňujú rýchlejšie  Rýchlosti vylučovania – menšie molekuly sú rýchlejšie eliminované ľadvinami  Prietoku krvi v postihnutej oblasti Medzi cytoplazmatické markre patrí myoglobín, laktatdehydrogenáza, kreatinkináza; medzi mitochondriálne aspartátaminotransferáza; medzi štrukturálne markre patria troponíny. Myoglobín je globulárna bielkovina tvorená jedným reťazcom aminokyselín, ktorý obsahuje ako prostetickú skupinu hem. Reverzibilne viaže kyslík v svalových bunkách. Myoglobín z kostrového a srdcového svalstva je rovnaký. V ľadvinách je filtrovaný glomerulárnou membránou a vylučovaný do moči. Má veľmi krátky biologický polčas – 10-20 min. Na rozdiel od hemoglobínu obsahuje myoglobín iba jednu hemovú skupinu a jeden globínový reťazec a preto môže transportovať iba jednu molekulu O 2 . Afinita myoglobínu ku kyslíku je v porovnaní s hemoglobínom vyššia. Ako cytoplazmatický proteín s nízkou molekulovou hmotnosťou je rýchlo uvoľňovaný z postihnutého tkaniva. Vzostup sérových koncentrácií myoglobínu u akútneho infarktu myokardu nastupuje rýchlo (za 0,5-2 h) od začiatku bolesti na hrudi. Hladiny myoglobínu, ktoré môžu dosahovať 20-násobku fyziologických hodnôt, kulminujú asi za 6-12 h a v priebehu 12-24 h sa vracajú k pôvodným hodnotám. Myoglobín je považovaný za najcitlivejší biochemický marker akutného infarktu myokardu vhodný pre skorý záchyt. Nevýhodou stanovenia myokardu pri infarkte je nedostatok kardiošpecifity. Jeho zvýšenie je možné tiež pozorovať pri akomkoľvek poškodení kostrového svalstva (aj napr. intramuskularnej injekcií alebo drobného poškodenia po páde), po veľkej svalovej záťaži (aj napr. po zapojovaní brušného lisu pri dlhotrvajúcom zvracaní) alebo pri renálnej insuficiencií. Stanovenie myoglobínu môže vylúčiť akútny infarkt myokardu, ak je istota, že odber krvi bol spravený mimo diagnostické okno, teda viac ako 2h od začiatku bolesti na hrudi alebo iných príznakov a ak je sérový myoglobín v referenčných hodnotách, je diagnóza infarktu prakticky vylúčená. Ak je myoglobín pozitívny, je nutné diferenciálne zvážiť dôvod jeho zvýšenia (myokard, kostrové svalstvo, renálna insuficiencia) a spravidla je nutné hodnotiť špecifickejšie kardiomarkre. Na stanovenie myoglobínu sa používajú rôzne imunochemické metódy (napr. ELISA, imunoturbidimetria,...). Fyziologická horná hranica myoglobínu pre ženy je 76 μg/l a pre mužov 92 μg/l. Kreatinkináza je prevažne cytoplazmatický enzým, ktorý katalyzuje fosforyláciu kreatínu na kreatinfosfát pomocou ATP. Pri nedostatku ATP prebieha reakcia opačným smerom. Kreatinkináza je obsiahnutá predovšetkým v kostrovom svalstve, myokarde a v mozgovom tkanive. Je tvorená dvomi podjednotkami, ktoré sú dvojitého typu – M (muscle) a B (brain), každá o relatívnej molekulárnej hmotnosti okolo 40 00. Rôznym zastúpením podjednotiek sa odlišujú 3 izoenzýmy kreatinkinázy: CK-BB (v mozgu), CK-MB (v myokarde) a CK-MM (v kostrovom svalstve). V kostrovom svalstve prevažuje CK-MM, ale je prítomný aj CK-MB. V mozgu nachádzame CK-BB, ktorý sa pri neporušenej hematoencefalickej bariére nedá v krvi preukázať. Pre myokard je typická CK-MB, ale nachádza sa tam aj CK- MM. Katalytická koncentrácia celkovej CK sa zvyšuje v priebehu 3-6 hodín od začiatku ischémie myokardu. Vzhľadom k nedostatočnej kardiošpecifite má jej stanovenie u akútneho infarktu obmedzený význam. Hodnota celkovej CK je ovplyvnená rôznymi faktormi ako je vek, pohlavie, objem svalovej hmoty a fyzická aktivita. Väčšiu diagnostickú hodnou má vyšetrenie izoenzýmu CK-MB. Ani CK-MB nie je úplne kardiošpecifická. Zvýšenie môže byť spôsobené aj poškodením kostrového svalstva (trauma, svalová dystrofia, intramuskulárna injekcia, resuscitácia, defibrilácia), extrémnym cvičením a chronickou renálnou insuficienciou. CK-MB je možné stanovovať enzymatickou aktivitou, ktorá zachytí iba aktívne molekuly enzýmu, alebo imunochemicky ako proteín vo forme hmotnostnej koncentrácie. V druhom prípade hovoríme o CK-MB mass, ktoré dnes jednoznačne prevažuje. Stanovenie CK-MB mass je špecifickejšie a detailnejšie, pretože sa ním preukazujú aj čiastočne degradované molekuly, ktoré už stratili enzýmovú funkciu. Stanovenie CK-MB je podľa súčasných doporučení prijateľné iba v prípade nedostupnosti stanovenia kardiošpecifickejších troponínov. Ďalej sa CK-MB mass používa na dôkaz reinfarktu v dobe, kedy ešte pretrváva vysoká koncentrácia cTn. Fyziologická horná hranica CK-MB mass pre dospelých je 0,5 μg/l. Laktátdehydrogenáza je oxidoredukčný enzým katalyzujúci reverzibilnú premenu laktátu na pyruvát. Štruktúra molekuly je tvorená 4 podjednotkami o relatívnej hmotnosti 34 000. Každá z týchto podjednotiek môže byť buď M (muscle) alebo H (heart), takže celkom existuje 5 izoenzýmov označovaných LD 1 až LD 5 . LD je prítomná v cytoplazme buniek mnohých tkanív. Do cirkulácie sa uvoľňuje už pri miernom tkanivovom poškodení. Zvýšené katalytické koncentrácie celkovej LD v plazme sprevádza mnohé ochorenia. V súčasnosti sa stanovenie celkovej LD používa ako nešpecifický marker rozpadu buniek, napr. pri nádorových ochoreniach. Charakteristické je tiež neskoré zvýšenie celovej LD po infarkte, ktoré môže pretrvávať až 15 dní. Vzhľadom k vysokému obsahu v erytrocytoch môže plazmatickú koncentráciu pozitívne zvýšiť hemolýza. Použitie LD a jej izoenzýmov pre diagnostiku akútneho koronárneho syndrómu sa dnes považuje za zastaralé. Fyziologická horná hranica LD pre dospelých je 4,10 μkat/l. Pre stanovenie sa používa Warburgov optický test a zastúpenie izoenzýmov je možné určiť elektroforézou. Aspartátaminotransferáza je v myokarde obsiahnutá v relatívne vysokej koncentrácií. Historicky patrí medzi k prvým používaným biochemickým ukazateľom akútneho infarktu, dnes už ale nie je v tejto indikácií doporučená. Ako kardiomakre sa využívajú troponín T (TnT) a troponín I (TnI). TnT aTnI sa vyskytujú v kostrovom svalstve a myokarde. Kardiálne izoenzýmy (cTnT acTnI) majú jedinečné aminokyselinové zloženie a sú preto pre myokard špecifické. Väčšinou sú kardiálne izoenzýmy TnT a TnI obsiahnuté v kontraktilnom aparáte a sú uvoľnené v dôsledku proteolytickej degradácie. Iba 6-8% cTnT a 2,8-8,3% cTnI tvorí neviazanú cytosolovú zložku. V krvi sa troponín cTnT normálne nevyskytuje. Priebeh uvoľnenia cTnT je dvojfázový. Zvýšenie troponínu po začiatku akútneho infarktu nastupuje v priebehu 3-8 hodín a prvého vrcholu je dosiahnuté za 12-28 h po poškodení myokardu. Je vyvolaný rýchlym uvoľnením voľnej cytoplazmatickej frakcie cTnT. Počiatočný vrchol je nasledovaný ďalším vrcholom za 3-4 dni, ktoré zodpovedajú pomalšiemu vyplavovaniu cTnT viazaného v troponín-tropomyzínovom komplexe v nekrotickom ložisku. Behom 7- 10 dní klesá na nedetkovateľné hodnoty. Pri skorom obnovení krvného prietoku koronárnou artériou je maximálny vzostup asi za 14 hodín a potom nasleduje neskorší druhý, podstatne nižší vrchol. Dĺžka zvýšenia závisí na veľkosti infarkt. U rozsiahlejších infarktov môže byť cTnT preukázateľných až 21 dní. Určitou nevýhodou cTnT je jeho nešpecifické zvýšenie u pacientov s renálnou insuficienciou. Nástup zvýšených hladín cTnI, ktorý sa vyznačuje vysokou špecifickosťou, nastáva podobne ako u cTnT už asi za 3h po začiatku ischémie. Zvýšené hladiny pretrvávajú 5-10 dní. V porovnaní s cTnT nie je u cTnI väčšinou pozorované druhé maximum (menšia cytosolová frakcia). Troponín C (TnC) nie je pre diagnostiku infarktu vhodný, pretože je identický v kostrovom aj srdcovom svalstve. Troponíny sa stanovujú citlivými imunochemickými metódami. Pri akútnom infarkte myokardu je nevyhnutná rýchla diagnostika, ktorej súčasťou môže byť aj použitie biochemických testov na stanovenie myoglobínu a troponínov, ktoré je možné spraviť priamo u lôžka pacienta. Rýchly test na stanovenie srdcového troponínu T, založený na technológií GLORIA (Gold Labelled Optically Read Immuno Assay), ktorý využíva dvoch rôznych monoklonárnych protilátok proti cTnT – jedna je značená biotínom, druhá koloidným zlatom. Pri teste sa krv pacienta nanesie do aplikačnej zóny obsahujúcej značené protilátky, ktoré v reakčnej zóne vytvoria s molekulami troponínu vo vzorke (ak je prítomný) sendvičový komplex. Pred vstupom do detekčnej zóny sa pomocou sklených vláken oddelia erytrocyty a ďalej postupuje iba plazma obsahujúca imunokomplexy. V detekčnej zóne je signálny prúžok so zakotveným streptavidinom (bielkovinou s vysokou afinitou k biotínu) a ďalší kontrolný prúžok s imobilizovaným troponínom. Na kontrolný prúžok sa viaže nadbytok protilátok značených zlatom. Sfarbenie kontrolného prúžku potvrdzuje, že test je funkčný a vyšetrenie je platné. Sendvičový imunokomplex s troponínom je zachytený streptavidínom, čo sa prejaví druhým farebným prúžkom. Pri pozitívnom teste sa teda vyvinú 2 prúžky – v oblasti kontrolnej aj signálnej línie, pri negatívnom výsledku pozorujeme iba farebnú kontrolnú líniu. Pre diagnózu akutného kornárneho syndrómu sa odporúča stanovenie dvoch laboratórnych ukazateľov – rýchleho a definitívneho. V skorej fáze po vzniku akútneho kornárneho syndrómu má najvyššiu diagnostickú citlivosť myoglobín – „rýchly ukazateľ“. Ide o skorý, ale nešpecifický marker, ktorý pri bolesti na hrudi a chýbajúcom alebo nejasnom náleze na EKG odlíši pacientov bez infarktu a pacientov s pravdepodobnou diagnózou akútneho infarktu myokardu. U myoglobínu sa hodnotí predovšetkým negatívna (nezvýšená) hladina, ktorá vylúči akútny infarkt myokardu. Konečná diagnóza infarktu musí byť potvrdená druhým markrom. Troponíny sú definitívnym ukazateľom poškodenia myokardu. Umožňujú veľmi citlivý a špecifický dôkaz nekrózy myokardu – aj mikroskopickej. Výhody stanovenia troponínov pri diagnostike inafraktu je niekoľko:  vysoká špecifickosť pre myokard  takmer nedetekovateľné hladiny u zdravých jedincov  mnohonásobné zvýšenie koncentrácií u akútneho infarktu  vysoká citlivosť umožňuje odhaliť aj minimálne poškodenie myokardu  dlhodobejšie pretrvávanie zvýšených hodnôt môže poslúžiť aj pre neskoršiu diagnostiku infarktu  jediný parameter, ktorý je možné stanoviť aj v hemolytickej vzorke Zvýšené hladiny troponínov odrážajú poškodenie myokardu, ktoré však okrem infarktu môže byť spôsobené aj inými príčinami ako je napr. zánět (myokarditída), pľúcna embólia alebo kardiochirurgický výkon. Stanovenie CK-MB mass je prijateľné iba v situácií, kedy nie je k dispozícií vyšetrenie troponínov. Okrem toho sa CK, CK-MB a/alebo CK-MB mass stanovujú pre posúdenie veľkosti ischemického ložiska. III/21. Biochemie vidění, Waldův cyklus, transducinový cyklus. V sietnici sa u človeka vyskytujú dva typy fotorecepčných buniek označované ako tyčinky a čípky. Tyčinky, ktorých je asi 120 miliónov, vnímajú slabé svetlo. Naopak čípky, ktorých je 6 miliónov, sú pri vyššej svetelnej intenzite zodpovedné za farebné videnie. Na videní sa podieľajú signálne látky a proteíny. Najprv vyvolá svetlom indukovaná cis-trans izomerácia farbiva retinalu konformačnú zmenu membránového proteínu rodopsínu. S ním asociovaný G-proteín transducín aktivuje enzým odbúravajúci druhého posla cGMP. Práve nedostatok cGMP konečne vyvolá hyperpolarizáciu svetlocitlivej bunky, ktorú pripojené neuróny registrujú ako zníženú tvorbu neurotransmiteru. Tyčinky sú oddelené membránovými diskami, do ktorých je integrovaný receptor s 7 helixami rodopsín. Na rozdiel od ostatných receptorov triedy 7-helix je rodopsín svetlocitlivý chromoproteín. Jeho bielkovinová časť opsín obsahuje aldehyd retinal, izoprenoid viazaný ako aldimín na εlyzínového zvyšku. Svetelná absorpcia sa u rodopsínu nachádza v oblasti viditeľného svetla s maximom v blízkosti 500nm. Absorpčné vlastnosti zrakového farbiva sú preto optimálne prispôsobené spektrálnemu rozdeleniu slnečného svetla. Absorpcia jedného fotónu vyvolá v rodopsíne izomeráciu retinalu formy 11-cis na formu all-trans-retinal. Tento fotochemický proces spôsobí behom niekoľko milisekúnd alosterickú konformačnú zmenu rodopsínu. V tejto aktívnej konformácii viaže rodopsín* (metarodopsín II) G-proteín transducín a aktivuje ho. Teraz začínajúca signálna kaskáda ovplyvní bunku – tyčinku, aby na svojej synapsii vylučovala menej neurotransmiteru (glutamátu). Napojené bipolárne neuróny ohlasujú túto zmenu ako svetelný signál ďalej do mozgu. Čípky obsahujú viac rozdielnych čípkových rodopsínov. Ako svetlocitlivé komponenty sa vo všetkých nachádzajú retinalové molekuly, ktorých absorpčné schopnosti sú rôznym podielom opsínu modulované do tej miery, že dovoľujú rozpoznanie jednotlivých farieb. Neosvetlené tyčinky obsahujú relatívne vysokú koncentráciu (70 μmol/l) cyklického nukleotidu cGMP vytvoreného guanylátcyklázou. Následne sa cGMP viaže na iónový kanál v membráne tyčinky a udržuje ho tak otvorený. Vstup katiónov (Na + , Ca 2+ ) membránu depolarizuje a vyvoláva na synapsii trvalé vylučovanie neurotransmiteru glutamátu. Ak sa G-proteín transducín naviaže na svetlom aktivovaný rodopsín*, dôjde k zámene GDP za GTP.V takomto aktivovanom transducíne* sa α-podjednotka nesúca GTP uvoľní od zvyšku G-proteínu a následne aktivuje membránovú cGMP-fosfodiesterázu. Tá rýchlo hydrolyzuje cGMP na GMP a behom milisekúnd zníži hladinu voľného cGMP. Následkom je oddisociovanie cGMP viazaného na katiónové kanály a ich uzavretie. Aj keď sú z bunky stále odsávané katióny, zníži sa membránový potenciál, dôjde k hyperpolarizácii bunky a tvorba glutamántu sa zastaví. Po osvite sa viacero procesov vracia do pôvodnej situácie: 1. Transducínová α-podjednotka sa hydrolýzou GTP sama inaktivuje a znovu sa spojí s βγ- podjednotkou, čo ukončí aktiváciu cGMP esterázy. (týmto krokom sa uzatvára tzv. transducínový cyklus) 2. Znížená koncentrácia Ca 2+ aktivuje guanylátcyklázu, ktorá zvýši hladinu cGMP do tej miery, že sa katiónové kanály opäť uzavrú. 3. Opsín je fosforylovaný rodopsínkinázou a viaže proteín arestín. Následne dôjde k uvoľneniu all- trans-retinalu a jeho regenerácii na 11-cis-retinal, čo prebehne buď priamo pôsobením izomerázy alebo po redukcii na all-tans-retinol, zmene na 11-cis-formu a následnej oxidácii na 11-cis- retinal. (týmto krokom sa uzatvára tzv. Waldův cyklus) Ten sa môže viazať na voľný opsín a je k dispozícii pre ďalší cyklus. Patobiochémia Retinitis pigmentosa – mutácia génu pre rodopsín, dedičné ochorenie, pri ktorom umierajú svetlocitlivé bunky, čo vedie až k slepote Avitaminóza A – nielen obmedzuje regeneráciu rodposínu – šeroslepotu, spôsobuje morfologické zmeny až zničenie receptorov Daltonizmus – deficit fotoreceptorovej bielkoviny absorbujúcu zelenú alebo červenú, častý výskyt (1-2% populácie) Protanopia – porucha videnia červenej farby Tritanopia – porucha videnia modrej farby III/22. Biochemie smyslů (chuť, čich). Vyššie živočíchy vnímajú vône pomocou čuchového epitelu nosu. Aby mohla byť látka vnímaná čuchovým aparátom, musí byť najprv rozpustená v hliene pokrývajúcom senzorické neuróny. Riasinky, výbežky špeciálnych senzorických neurónov, ktoré vyčnievajú do nosnej dutiny, majú na svojej membráne množstvo rôznych receptorov spojených s G-proteínmi (GPCR) a tiež receptor pre guanyl cyklázu typu D. Kontakt odorantu (voňavej látky) s čuchovým GPCR odštartuje jeden z nasledujúcich procesov:  Aktivuje sa adenylát cykláza pomocou G-proteínu. Vzniknuté cAMP spôsobí otvorenie Na + iónových kanálov a následný prílev Na + iónov, čo depolarizuje membránu a vyvolá akčný potenciál.  Aktivuje sa fosfolipáza C, ktorá podporí vznik inositol-P 3 . Následne inositol-P 3 otvorí Ca 2+ kanály na membráne. Vtok Ca 2+ hyperpolarizuje membránu a potlačí vznik akčného potenciálu. Je stále nejasné ako tieto dva mechanizmy spolu interagujú a taktiež je nejasné ako čuchové receptory reagujú na rôzne odoranty. Obe mechanizmy sú účinné len po krátku dobu (cca 50 msec). Po ukončení signálu sa receptor inaktivuje fosforyláciou a odorant sa degraduje (najčastejšie pomocou oxidáciou P-450). Vnímanie chuti vyšších živočíchov dokáže rozoznať 5 chutí: kyslú, slanú, horkú, sladkú a umami. Japonské slovo „umami“ znamená v preklade „chutný“ a označuje chuť jedál s vysokým obsahom proteínov. Rôzne nervové bunky majú na svojich membránach špecifické receptory pre týchto 5 chutí. Tieto receptorové neuróny sa zhlukujú do chuťových pohárikov na jazyku. Receptor pre umami je aktivovaný pomocou glutamátu, čo tvorí molekulový základ vnímania chuti vyvolanej glutamátom sodným. Kyslá a slaná chuť ovplyvňuje iónové kanály – slaná chuť zvyšuje prítok Na + iónov cez príslušné kanály, naopak kyslá chuť spôsobuje blokádu Na + alebo K + kanálov pomocou H + iónov. GPCR z rodín T1R a T2R vnímajú sladkú, horkú a umami chuť. Horká chuť spôsobuje uvoľnenie Ca 2+ iónov cestou G-proteínu a IP 3 . Sladká chuť naopak zvyšuje koncentráciu cAMP pomocou adenylat cyklázy. Gustducín je heterotrimerický G-proteín, ktorý sa podieľa na signalizácii chuti. Sekvencia aminokyselín gustducínu je na 80% identická s transducínom (otázka III/21). Mnoho detailov o vnímaní chuti je stále nejasných. III/23. Biochemie nervových synapsí, neurotransmitery. K prenosu vzruchu dochádza na synapsiách, ktoré navzájom prepájajú jak jednotlivé neuróny, tak neuróny so svalovými vláknami. V terminálnych zakončeniach axónov sa ukladajú neurotransmitery. Tieto signálne látky sú produkované ako odpoveď na elektrický signál, aby preniesli vzruch na susedné neuróny alebo svalové bunky. Odhaduje sa, že každý z viac ako 10 11 mozgových neurónov je prostredníctvom synapsií v kontakte s viac ako 10 3 inými neurónmi a že existuje asi 10 15 synapsií. Všetky chemické synapsie pracujú na podobnom princípe. V oblasti synapsie je na povrch signalizujúcej bunky (presynaptická membrána) od povrchu prijímajúcej bunky (postsynaptická membrána) oddelený len úzkou synaptickou štrbinou. Ak dôjde akčný potenciál na presynaptickú membránu, otvoria sa v nej integrovsné napätím riadené Ca 2+ kanály. Uvoľnené Ca 2+ ióny vyvolajú exocytózu neurotransmiteru uloženého v presynaptickej bunke. Každý neurón vylučuje iba jeden druh neurotransmiteru. Neuróny produkujúce dopamín sa označujú ako „dopaminergné“, produkujúce acetylcholín ako „cholinergné“, etc. Vylúčené transmitery difundujú synaptickou štrbinou a viažu sa na opačnej strane na receptory postsynaptickej membrány. Tieto receptory sú integrálne membránové proteíny nesúce na vonkajšej strane väzobné miesta pre neurotransmitery. Podľa účinku vyvolávaného väzbou transmiterov delíme ich receptory do dvoch skupín. Ionotropné receptory sú ligandmi riadené iónové kanály. Hneď ako sa účinkom transmiteru otvoria, prúdia ióny podľa membránového potenciálu dovnútra. Ak sa jedná o katióny (napr. sodné) dôjde k depolarizácií membrány a k vyvolaniu akčného potenciálu na povrchu postsynaptickej bunky. Týmto spôsobom pôsobia transmitery vyvolávajúce vzruch (napr. acetylcholín alebo glutamát). Ak naopak do vnútra prúdia anióny (hlavne chloridové), dochádza k hyperpolarizácií postsynaptickej membrány sťažujúci vznik akčného potenciálu. Na tomto účinku je založené pôsobenie tlmivých transmiterov (glycín alebo GABA). Úplne opačný účinok vykazujú tzv. metabotropné receptory. Interagujú po naviazaní neurotransmiteru na vnútornú stranu postsynpatickej membrány s G-proteinmi, ktoré opäť aktivujú alebo tlmí syntézu druhých poslov. Tie nakoniec aktivujú alebo tlmia proteinkinázy, ktoré fosforylujú bunkové proteiny a tým menia chovanie postsynaptickej bunky. Účinok neurotransmiterov sa rýchlo zastaví ich rozštiepením alebo návratom do presynpatickej bunky. Neurotransmitery sú produktmi neurónov, ktoré sa ukladajú v synapsiách a na podráždenie vylučujú do synaptickej štrbiny. Na postsynaptickej membráne sa viažu na špecifické receptory a ovplyvňujú ich aktivitu. Kotransmitery sú signálne látky pôsobiace spoločne s neurotrasmitermua modulujú ich účinky. Rodina neurotransmiterov a kotransmiterov obsahuje viac ako 100 členov a najčastejšie ide o aminokyseliny, deriváty aminokyselín alebo peptidy. Acetylcholín (ACh), ester kyseliny octovej a katiónového cholínu, pôsobí na neuromuskulárnej platničke, kde vyvoláva svalovú kontrakciu, v gangliových autonómneho nervového systému a v cholinergných neurónoch mozgu a miechy. Acetylcholín sa tvorí v cytoplazme presynaptických axónov enzymaticky z acetyl-CoA a cholínu a je ukladaný do synaptických vačkov, z ktorých každý je schopný prijať asi 1000 až 10 000 molekúl Ach. Keď je exocytózou vylúčený, dostáva sa transmiter difúziou k receptorom postsynaptickej membrány. V synaptickej štrbine ihneď začína inaktivácia Ach jeho hydrolýzou na acetát a cholín. Reakciu katalyzuje acetylcholinesteráza, ktorá behom niekoľkých milisekúnd odstráni vylúčený ACh. Štiepený produkt cholín je prijatý presynaptickým neurónom a gliovými bunkami späť a znova použiť k syntéze ACh. Látky blokujúce serínový zvyšok v aktívnom centre ACh-esterázy, napr. nervový jed E605 a ďalšie organofosfáty, bránia štiepeniu ACh a vyvolávajú kŕčovú excitáciu postsynaptických buniek. Na rozdiel od nich ruší kurare, ochraňujúci šípový jed juhoamerických indiánov, kompetíciou väzbu Ach na nikotínové a atropín na muskarinové receptory, čo vyvoláva svalovú relaxáciu. Neurotransmiterové účinky vykazuje aj množstvo aminokyselín. Obzvlášť dôležitý je glutamát pôsobiaci ako vzrušivý transmiter v CNS. Viac než polovica synapsií v mozgu je glutaminergných. Naopak glycín pôsobí v mieche a častiach mozgu ako inhibičný neurotransmiter. Biogénne amíny vznikajú z aminokyselín dekarboxyláciou. Do tejto skupiny patrí z glutamátu tvorená GABA (kyselina γ- aminomaslová), najdôležitejší inhibičný transmiter v CNS. Katecholamíny ako dopamín, noradrenalín a adrenalín sú odvodené od tyrozínu, naopak serotonín a melatonín od tryptofanu a histamín od histidínu. Tieto signálne látky sú neurotransmitery a niekedy súčasne aj mediátory a/alebo hormóny. Peptidy tvorí medzi neurosekrety s transmiterovou funkciou najväčšiu skupinu. Niektoré z nich sú súčasne aj peptidovými hormónmi, napr. tyreoliberín (TRH) alebo angiotenzín II. Väčšina neuropeptidov má krátky reťazec (3-30 AMK). Mnohé nesú na N-konci na pyroglutamát (5- oxyprolín), cyklizovaný glutamatový zvyšok, zatiaľ čo ich C-koniec je pre rozštiepením peptidázami chránený formou kyslého amidu (-CONH 2 ) bez náboja. Veľmi zaujímavú skupinu neuropeptidov predstavujú endorfíny, dynorfiny a enkefaliny. Pôsobia pri extrémnych situáciách ako „endogénne opioidy“, teda analgeticky, sedatívne a euforizačne. Drogy ako morfín alebo heroín aktivujú receptory pre tieto peptidy. Všetky purínové deriváty s kontransmiterovou funkciou sú nukleotidy alebo nukleozidy obsahujúce adenín. ATP je vylučovaný spoločne s acetylcholínom a ďalšími transmitermi a reguluje hlavne sekréciu transmiterov z ich pôvodnej synapsie. Stimulačný účinok kofeínu (1,3,7-trimetylxantín) spočíva predovšetkým na jeho väzbe k adenozínovým receptorom. Pre účinok neurotransmiterov sú charakteristické nasledovné reakcie: 1. Biosyntéza v cytoplazme presynaptických nervových zakončení z ľahko prístupných prekurzorov (často aminokyselín) s pomocou charakteristických enzýmov. 2. Aktívny príjem v zásobných vačkoch prostredníctvom transportu závislého na H + . Ukladajú sa často s kotransmitermi. 3. Vylučovanie obsahu vačkov exocytózou riadenou Ca 2+ do synaptickej štrbiny. 4. Účinok je dosiahnutý väzbou na špecifické receptory pre neurotransmitery na postsynaptickej membráne. 5. Rýchle ukončenie účinku spätným prijatím do presynaptických nervových zakončení a gliových buniek, spätnou difúziou alebo enzymatickou inaktiváciou v synaptickej štrbine (ACh, neurotransmitery). 6. Enzymatické štiepenie Liečivá môžu zasahovať na rôznych miestach tohto systému prostredníctvom:  prekurzorov neurotransmiterov (1)  agonistov imitujúcich pôsobenie na určitých typoch receptorov (4)  látok tlmiacich spätný príjem (5)  inhibítorov enzymatického štiepenia (6) Neurotransmiterové receptory sú integrovaný do membrány postsynaptickej bunky a kontrolujú tu pohyb iónov alebo procesy prenosu signálu. Množstvo známych receptorov pre neurotransmitery je veľké. Podľa účinku sa delia do dvoch veľkých skupín. Ionotropné receptory sú ligandami riadené iónové kanály. Receptory pre vzrušivé (excitačné) transmitery umožňujú vstup katiónov, hlavne sodných. Ak dôjde po väzbe transmiteru k ich otvoreniu, nastane lokálna depolarizácia postsynaptickej membrány. Tlmiace (inhibičné) neurotransmitery ako GABA alebo glycín naopak dovoľujú vstup chloridových aniónov, čo zvyšuje negatívny kľudový potenciál membrány a hyperpolarizáciou sťažuje pôsobenie excitačných transmiterov. Prenos signálu prebieha v ionotropných receptoroch rýchlo. Pomaly naopak pracujú metabotropné receptory. Sú viazané na G-proteíny a ich prostredníctvom ovplyvňujú tvorbu druhých poslov. Receptory spolupracujú s proteínmi typu G S zvyšujú hladiny cAMP v postsynaptickej bunke, naopak receptory aktivujú proteíny G i ju znižujú. Iné receptory zvyšujú prostredníctvom G-proteínov typu G q vnútrobunkovú koncentráciu vápenatých iónov. Glutamát, GABA, acetylcholín, serotnín a ATP môžu aktivovať ako ionotropné, tak metabotropné receptory. Pre väčšinu neurotransmiterov je k dispozícií viacero receptorových podtypov. Pre ich rozdelenie sa používajú číslice (napr. D 1 až D 5 ) alebo sa pomenúvajú podľa agonistov, tzv. molekúl experimentálne aktivujúcich receptor. Tak reaguje určitý typ glutamátových receptorov tiež na NMDA (N-metyl-D-aspartát), iný na zlúčeninu AMPA, atd. Acetylcholín (ACh) sa viaže na 2 druhy receptorov. Tzv. niktínový receptor reaguje aj na alkaloid nikotín obsiahnutý v tabaku. Množstvo fyziologických účinkov nikotínu súvisí s touto skutočnosťou. Nikotínový receptor patrí k ionotropným receptorom. Pri väzbe s ACh sa iónový kanál otvorí a dovolí sodným iónom difundovať do postsynaptickej bunky, draselným iónom naopak prúdiť von. Muskarínové receptory (najmenej 5 podtypov) sú naopak metabotropné. Ich označenie súvisí s alkaloidom muskatínom vyskytujúcim sa hlavne v muchotrávkach (muchomůrkach) Amanita muscarina. Muskarín sa viaže podobne ako ACh na receptor, ale na rozdiel od ACh sa neštiepi a preto vyvoláva trvalé podráždenie svaloviny. Muskarínové receptory ovplyvňujú hladinu cAMP v postsynaptických bunkách. Podtypy M 1 , M 2 a M 4 ju naopak znižujú. III/24. Katecholaminy − biosyntéza, biodegradace. Dopamín, noradrenalín a adrenalín sú biologicky aktíve (biogénne) amíny, ktoré súhrnne nazývame katecholamíny. Dopamín a noradrenalín sú syntetizované v mozgu a fungujú ako neurotransmiter. Adrenalín a noradreanlín sa tiež syntetizujú v dreni nadľadvín. Mimo nervového systému pôsobia noradrenalín a jeho metylovaný derivát, adrenalín, ako hormóny regulujúce metabolizmus sacharidov a lipidov. Noradreanlín a adrenalín sa uvoľňujú zo zásobných vezikúl v dreni nadľadvín ako odpoveď na strach, záťaž, chlad a nízku hladinu glukózy v krvi. Zvyšujú degradáciu glykogénu a triacylglcerolov a tiež zvyšujú krvný tlak a srdečný výdaj. Tieto účinky sú súčasťou koordinovanej odpovede, ktorá pripravuje jedinca na stres a taktiež sa nazývajú ako reakcie „fight-or-flight“. Katecholamíny sa syntetizujú z tyrozínu. Tyrozín je najprv hydroxylovaný tyrozín hydroxylázou za vzniku 3,4- dihydroxyfenylalanínu (DOPA) v reakcii, ktorá je analogická k hydroxlácii fenylalanínu. Tetrahydrobiopterín (BH 4 ) – kľúčový enzým je rozšírený v CNS, sympatických gangliách a dreni nadľadvín - predstavuje jeden z hlavných regulačných krokov tejto dráhy. DOPA je dekarboxylovaná reakciou vyžadujúcou pyridoxal fosfát (PLP) za vzniku dopamínu, ktorý je hydroxlovaný pomocou dopamín β-hydroxylázy za vzniku noradrenalínu v reakcii vyžadujúcej vitamín C (askorbát) a meď. Adrenalín vzniká z noradrenalínu N-metyláciou za pomocou S-adenosylmationínu (SAM) ako donora metylovej skupiny. Degradácia katecholamínov začína ich inaktiváciou oxidatívnou deamináciou katalyzovanou monoamín oxidázou (MAO) alebo O-metyláciou katalyzovanou katechol-O- metyltransferázou (COMT), ktorá využíva SAM ako donor metylu. Obe reakcie nemôžu prebiehať súčasne. Aldehydové produkty MAO reakcie sú oxidované na príslušné kyseliny. Metabolické produkty týchto reakcii sú potom vylučované v moči ako kyselina vanillylmandeliková (VMA) vznikajúca z noradreanlínu a adrenalínu, a ako kyselina homovanilliková vznikajúca z dopamínu. Zvýšená koncentrácia VMA nastáva pri feochromocytómoch, tumoroch nadľadvín sprevádzaných nadmernou produkciou katecholamínov. MAO je enzým, ktorý sa nachádza v nervovom a iných tkanivách, ako napr. čreve alebo pečeni. V neuróne tento enzým oxidatívne deaminuje a inaktivuje všetky nadbytočné neurotransmitery (noradrenalín, dopamín, serotonín), ktoré môžu uniknúť zo synaptických vezikúl, kým je neurón v kľude. Inhibítory MAO môžu reverzibilne alebo ireverzibilne inaktivovať enzým, čím umožňujú molekulám neurotransmiterov uniknúť degradácii a tak sa súčasne hromadiť v presynaptickom neuróne a tiež unikať do synaptického priestoru. Toto spôsobí aktiváciu noradrenalínových a serotoninových receptorov, čo môže mať za následok antidepresívne účinky týchto liekov. III/25. Steroidní hormony − struktura receptorů pro steroidní hormony, mechanismus účinku, funkce. Steroidné hormóny sú hormóny lipofilnej povahy, ktoré vznikajú z cholesterolu procesom steroidogenézy. Nie sú ukladané do zásoby, ale v prípade potreby sa zvyšuje ich syntéza. V krvi sú transportované z veľkej časti naviazané na plazmatické bielkoviny, malá časť steroidov je v plazme vo voľnej (nenaviazanej) forme. V cieľovom tkanive pôsobia cestou intracelulárnych receptorov (cytoplazmatických alebo jadrových). Medzi steroidné hormóny patria glukokortikoidy (napr. kortizol), mineralokortikoidy (napr. aldosteron), androgény (napr. testosteron), esrogény, progesterón, kalcitriol, etc. Miestom syntézy sú endokrinné bunky kry nadľadvín, Leydigové bunky testis, folikulárne bunky ovárií, placenta a corpus luteum. Základným krokom je skrátenie bočného reťazca cholesterolu o 6 uhlíkov a tvorba pregnenolonu, čo katalyzuje mitochondriálny enzým desmoláza. Z pregnenolonu sa následne syntetizujú všetky steroídne hormóny (viac otázka II/31). Receptory steroidných hormónov sú proteíny lokalizované v cytoplazme bunky (intracelulárne receptory), na ktoré sa v neaktívnom stave viažu heat shock proteíny (hsp). Z funkčného hľadiska ide o transkripčné faktory, ktoré sú aktivované ligandom (v tomto prípade steroidným hormónom). Tieto receptory obsahujú niekoľko domén:  Ligand viažuca doména (LBD) – slúži k väzbe hormónu  Dimerizačná doména (DD) – umožňuje dimerizáciu receptoru po jeho aktivácii ligandom  Nukleárny lokalizačný signál (NLS) – smeruje aktivovaný receptor do bunkového jadra  DNA-viažuca doména (DBD) – umožňuje väzbu receptoru na steroidný responzibilný element (SRE – sekvenčne špecifický úsek DNA) v oblasti veľkého žliabku DNA  Transaktivačná doména (TAD) – umožňuje transaktiváciu (aktiváciu rôznych proteínov transkripčného aparátu) Steroidné hormóny sú hydrofóbne a sú preto transportované v krvi vo väzbe na transportné proteíny (napr. SHBG sex hormone-binding globulin). Malá časť steroidných hormónov je viazaná tiež na albumín a iba 1-2%z celkovej koncentrácie steroidných hormónov sa v krvi nachádza voľne. Táto voľná frakcia prechádza cytoplazmatickou membránou do cieľových buniek a v cytoplazme sa viažu na ligand viažucu doménu receptoru. Dôjde tak k aktivácii receptoru a k odpojeniu heat shock proteínu. Odpojenie hsp umožňuje dimerizáciu dvoch receptorov (prostrednícvom dimerizačných domén) a odhalenie nukleárneho lokalizačného signálu, čo vedie k translokácii receptoru do jadra. Dimerizovaný receptor v jadre obsadí steroidný responzibilný element, nachádzajúci sa v promotorových oblastiach génov regulovaných steroidnými hormónmi. Steroidné hormóny následne ovplyvňujú génovú expresiu (v zmysle aktivácie alebo represie). Väčšinou génovú expresiu ovplyvňujú prostredníctvom koaktivátorov (alebo korepresorov), ktoré na rozdiel od steroidných hormónov interagujú s komplexom transkripčného aparátu a ovplyvňujú ho. III/26. Peptidové hormony − mechanismy účinku, funkce. Peptidové hormóny sú hydrofilné signálne látky, tvorené peptidovým reťazcom o rôznej dĺžke, ktoré sa v krvi prenášajú voľne bez väzby na transportnú bielkovinu. Veľká časť peptidových hormónov patrí štrukturálne medzi glykoproteíny. Peptidové hormóny prenášajú signál do cieľovej bunky interakciou so špecifickými transmembránovými receptormi, čím spúšťajú intracelulárne signálne kaskády. Peptidové hormóny vznikajú ako iné bielkoviny proteosyntézou. Často sa stretávame s tým, že proteosyntézou vzniká hormonálne neaktívny prekurzor (preprohormón a prehormón), ktorý je zvyčajne väčšou molekulou ako samotný hormón a proteolýzou z neho vzniká aktívna forma (napr. inzulín alebo glukagón). U peptidových hormónov sa stretávame s medzidruhovými rozdielmi v primárnej štruktúre bielkoviny. Tieto rozdiely sú príčinou toho, že hormón jedného živočíšneho druhu nie je účinný u iného druhu alebo dokonca pôsobí ako antigén a vyvoláva imunitnú reakciu. Niekedy sa protilátky vytvoria aj proti vlastnému hormónu (napr. inzulínu). Peptidové hormóny vznikajú v hypofýze (somatotropín, thyreotropín, kortikotropín, folikuly stimulujúci hormón,luteinizačný hormón, prolaktín, antidiuretický hormón, oxytocín), príštitných telieskach (parathormón), štítnej žľaze (kalcitonin), endokrinnej časti pankreasu (inzulín, glukagón, somatostatin) a iných tkanivách – tzv. tkanivové hormóny (napr. v tukovom tkanive, GIT a iných). Peptidové hormóny pôsobia na bunku väzbou na receptor. Konformačná zmena, ktorá nastane po väzba hormónu, vyvolá aktiváciu membránového enzýmu adenylátcyklázy, lokalizovanej na vnútornej strane membrány. Enzým potom katalyzuje rozpad ATP za vzniku cAMP a P i -P i . Cyklický AMP okrem významného vplyvu na Ca 2+ (znižuje jeho intracelulárnu koncentráciu) pôsobí na proteinkázy. Proteinkázy sú špecifické alosterické enzýmy zložené vo výchozím stavu zo 4 podjednotiek. Na nich pôsobí cAMP ako alosterický efektor a modifikuje konformáciu proteinkinázy, čím ju aktivuje. Aktivované proteinkinázy, ktoré majú formu dimérov, katalyzujú potom veľký počet reakcii v bunke, napr. premenu fosforylázy b na fosofrylázu a v metabolizme polysacharidov alebo významne ovplyvňuje lipolýzu za prítomnosti cAMP. Všeobecne je možné povedať, že zabudovanie novej molekuly fosfátu do inaktívneho enzýmu (tetraméru) vedie k jeho aktivácii (prechod na dimér). Koncentrácia cAMP je okrem toho regulovaná enzýmovou degradáciou: enzým fosfodiesteráza (PDE) štiepi cAMP na 5 ́-AMP. Aktivitu PE znižujú metylxyntíny (napr. kofeín) a stimulujú ju vápenaté ióny. V niektorých bunkách, napr. v tých, ktoré obsahujú na membráne cholinergné receptory, vystupuje v podobne úlohe ako cAMP analogická zlúčenina cGMP, ktorý vznikol podobnou cestou účinkom guanylátcyklázy. Na rozdiel od cAMP tu Ca 2+ -ATPáza zvyšuje intracelulárnu koncentráciu vápniku. Niektoré výsledné efekty, napr. bronchokonstrikcia, sú vyvolané práve vápenatými iónmi. Väčšina peptidových hormónov je po aktivácii receptoru degradovaných na aminokyseliny pomocou hydrolýzy v lyzozómoch. Peptidové hormóny s cyklickou štruktúrou tvorenou disulfidovým mostíkom (oxytocín, vazopresín, somatostatín) sa degradujú rozrušením disulfidického mostíku. III/27. Lokální mediátory (cytokiny, růstové faktory, chemokiny) − funkce, mechanismus účinku. Ako cytokíny označujeme hormónom podobné peptidy a proteíny syntetizované a vylučované bunkami imunitného systému. Ich rozsiahle biologické účinky sa prejavujú v troch oblastiach: Riadia vývoj a homeostázu imunitného systému, kontrolujú systém tvorby (hematopoetický) krviniek a podieľajú sa na nešpecifickej imunitnej odpovedi cestou ovplyvňovania zánetlivých procesov, zrážanie krvi a krvného tlaku. Cytokíny majú všeobecný vplyv na rast, diferenciáciu a prežívaniu buniek. Zúčastňujú sa aj apoptózy. Existuje veľké množstvo cytokínov. K cytokínom patria interleukíny (IL), monokíny, lymfokíny, chemokíny, interferóny (IFN) a kolonie stimulujúce faktory (CSF). Prostredníctvom interleukínov stimulujú imunocyty proliferáciu a aktivitu ostatných imunocytov. Interferóny sú terapeuticky využívane pri vírusových infekciách a ďalších ochoreniach. Cytokíny síce len zriedka vykazujú štrukturálnu podobnosť, ale ich účinky sa navzájom podobajú. Od hormónov sa cytokíny líšia iba čiastočne – nie sú vylučované definovanými žľazami, ale mnoho rôznymi bunkami a kontrolujú ďaleko širšie spektrum cieľových buniek než hormóny. Ako peptidy alebo proteíny patria cytokíny medzi hydrofilné signálne látky pôsobiace väzbou na receptory bunkového povrchu. Väzba cytokínu na určitý receptor prebieha cez množstvo medzistupňov až po aktiváciu transkripcie príslušného génu. Cytokínové receptory nenesú – na rozdiel od receptorov pre inzulín a rastové faktory – až na výnimky žiadnu tyrozínkinázovú aktivitu. Po naviazaní cytokínu asociujú sami so sebou na homodiméry, spojujú sa s ostatnými signálnymi transdukčnými proteínmi (STP) do dimérov a podporujú ich dimerizáciu. Cytokínové receptory I. triedy reagujú s tromi rôznymi STP (gp130, β a γ). STP síce neviažu žiadne cytokíny, ale vedú signál ďalej na tyrozínkinázy. Prekrývajúca sa biologická aktivita viacerých cytokínov súvisí s ich možnosťou aktivovať prostredníctvom svojich receptorov rovnaké STP. Ako príklad signálnej transdukčnej dráhy cytokínov môže byť aktivácia receptoru IL-6 po naviazaní svojho ligandu IL-6, ktorý podporí dimerizáciu STP gp130. Dimérny gp130 viaže cytoplazmatické tyrozínkinázy z rodiny Jak („Janusové kinázy“ s dvomi kinázovými centrami), ktoré aktivuje. Janusové kinázy fosforylujú cytokínové receptory, STP a rôzne cytoplazamatické proteíny, ktoré vedú signál ďalej. Naviac ešte fosforylujú transkripčné faktory označované ako STAT („signal transducers and activators of transcripton“). STAT patria medzi proteíny s doménou SH2 schopné viazať fosfotyrozínové zvyšky a preto sa viažu na cytokínové receptory fosforylované Janusovými kinázami. Ak potom dochádza k fosforylácií samotných STAT, prejdú do svojej aktívnej formy a tvoria diméry. Po prenose do bunkového jadra sa viažu spolu s pomocnými proteínmi fungujúcimi ako transkripčné faktory na promotory indukovateľných génov a riadia ich transkripciu. Aktivita cytokinových receptorov je ukončená proteinfosfatázami, ktoré hydrolyticky štiepia fosfotyrozínové zvyšky. Niektoré cytokínové receptory môžu proteolýzou stratiť svoje extracelulárne domény viažuce ligandy. Tie sa potom objavia v krvi, kde konkurujú o väzbu na molekuly cytokínov, čo má za následok zníženia účinnej koncentrácie cytokínov v krvi. (Patobiochémia) Anafylxia („cytokínová búrka“) je prehnane zvýšená reakcia imunitného systému. Dochádza pri nej v reakcií na imunogény k masívnemu vyplaveniu zánět vyvolávajúcich cytokínov z makrofágov – hlavne IL-1, IL-6 a TNF. Tie môžu spôsobiť poruchy krvného obehu a následne aj mnohočetné orgánové zlyhania. Chemokíny sú podtypom cytokínov . Tieto proteíny väzbou na určité receptory regulujú migráciu buniek vzhľadom k určitému chemickému zloženiu okolia (chemotaxia). Príkladom je mográcia leukocytov do oblasti zánětu. Rastové faktory sú látky (najčastejšie bielkovinovej povahy), ktoré sú produkované rôznymi bunkami tela a ktoré ovplyvňujú veľké množstvo bunkových procesov ako napr. rast, proliferáciu, diferenciáciu, prežitie a zranie buniek alebo tkanív. Okrem týchto funkcií môžu ovplyvniť aj bunkový metabolizmus. Medzi rastové faktory patrí napr. doštičkový rastový faktor (PDGF), epidermálny rastový faktor (EGF), inzulínu podobné rastové faktory (iGFs), inzulín, nervový rastový faktor (NGF), fibroblastový rastový faktor (FGF), erytropoetín (EPO), trombopoetín, etc. Rastové faktory pôsobia ako lokálne mediátory iba v okolí miesta ich syntézy (parakrinné pôsobenie). Odpovede na nich sú pomalé (rádovo v hodinách) a vyžadujú mnoho intracelulárnych prevodných krokov, ktoré nakoniec vedú k zmenám v génovej expresií. Rastové faktory často signalizujú cez signálnu kaskádu mitogénmi aktivovaných kináz (MAPK). Táto kaskáda má často stimulujúci účinok na bunkový cyklus. Receptory pre rastové faktory sú transmembránové proteíny prenikajúce cytoplazmatickou membránou a intracelulárnu časťou, ktoré majú tyrozínkinázovú aktivitu. Naviazanie ligandu na receptor spôsobí dimerizáciu s ďalším aktivovaným receptorom a to vedie k zmene konformácie proteínu. Zmena konformácie aktivuje tyozínkinázovú aktivitu a dôjde k autofosforylácií tyrozínových vyškov dimerizovaných receptorov. Aktivovaný receptor je po krátkej dobe inaktivovaný endocytózou s naviazaným rastovým faktorom a degradáciou v bunke. Aktivovaný (fosforylovaný) receptor interaguje s množstvom cytoplazamatických proteínov. Dôležitými proteínmi v signalizácií rastových faktorov sú Ras proteíny. Ras proteíny sú G-proteíny a onkogénny, ktoré majú GTP-ázovú aktivitu podobne ako α podjednotka G-proteínov (štiepy naviazané GTP na GDP a P). Ras proteín neinteraguje s aktivovaným receptorom priamo, ale prostredníctvom tzv. adaptorových proteínov (napr. Sos, Grb). Táto interakcia má za následok zmenu GDP v molekule Ras proteínu na GTP. Ras proteín s naviazaný, GTP je signálne aktívna forma, ktorá umožňuje naviazanie a aktiváciu (autofosforyláciu) prvej z kaskády niekoľkých kináz. Touto kinázou je proteín Raf (tiež MAPKKK alebo MAP3K – mitogénmi aktivovaná proteín kináza kináza kináza). Proteín Raf predáva signal v bunke fosforyláciou ďalších proteínkináz a dochádza k amplifikácií signálnej kaskády. Medzitým dôjde k inaktivácií Ras proteínu hydrolýzou GTP na GDP a fosfát samotným Ras proteínom. Ďalšou proteínkinázou fosforylovanou Raf proteínom je MEK (MAP a ERK Kináza, tiež MAPKK alebo MAP2K). Proteínkináza MEK fosforyluje ERK (Extracelulárne Regulovaná Kináza alebo MAPK – mitogénmi aktivovaná proteín kináza) a tá po tejto fosforylačnej aktivácií dimerizuje a translokuje do bunkového jadra a tu fosforyluje transkripčné faktory a tým ovplyvňuje génovú expresiu viacerých génov (často ďalších transkripčných faktorov). III/28. Hormony štítné žlázy a jejich funkce v regulačních dějích. Hormón štítnej žľazy tyroxín a jeho metabolity sú odvodené od aromatickej aminokyseliny tyrozínu. Základnou súčasťou tyroxínu je tyronín. Tyroxín nesie na oboch aromatických cykloch štyri atómy jódu a preto sa označuje ako 3,5,3 ́,5 ́- tetrajodtyronín (T 4 – tyroxín). Jeho najdôležitejším metabolitom je 3,5,3 ́-trijódtyronín (T 3 ), ktorý predstavuje aktívnu formu hormónov štítnej žľazy. Tyroxín a trijódtyronín sa tvoria vo folikulárnych bunkách štítnej žľazy. Ich biosyntéza je podobná syntéze peptiodvých hormónov. Folikulárne bunky syntetizujú veľký dimérny glykoproteín tyreoglobulín (660 kDa) a secernujú ho do lumen folikulu, ktorý je nim naplnený. Tu dochádza na niekoľkých tyrozínových zvyškoch k jódovaniu proteínu. Pri tejto reakcií odoberajú folikulárne bunky z krvi jodid a koncentrujú ho. Transport jodidu do bunky sa uskutočňuje ako kotransport s dvomi iónmi Na + . Na luminálnej strane buniek dochádza k oxidácii jodidu spoločným pôsobením peroxidázy a H 2 O 2 na jodonium (I + ). O reaguje pomocou tyreoperoxidázy s tyrozínovými zvyškami tyreoglobulínu, ktoré sú na pozíciách 3 a 5 aromatického kruhu nahradené atómami jódu (organifikácia jodidu). Tiež prenos jódovaných fenolových skupín medzi rôznymi tyrozínovými zvyškami tyreoglobulínu je sprostredkovaný tyreoperoxidázou. Vo forme tohto makromolekulového prekurzoru sa tyroxín ukladá do koloidu vo vnútri folikulov štítnej žľazy. V prípade potreby vstupuje tyreoglobulín do folikulárnych buniek a je lyzozomálne rozštiepený. Pritom dôjde k uvoľneniu jódovaných tyronínov T 3 a T 4 do krvi. Denne tak bunky štítnej žľazy secernujú asi 80-100 μg hormónov (T 4 :T 3 asi 2:1). Menej jódované tyroníny sú ešte vo folikuloch pôsobením dejodáz zbavené jódu. V krvi sa T 4 a T 3 z viac ako 99% viažu na transportné proteíny. Iba asi 0,025% T 4 a 0,5% T 3 sa tu vyskytujú voľne (fT 3 a fT 4 ) a sú hormonálne aktívne. Najdôležitejší väzbový proteín v krvi predstavuje tyroxin viažuci globulín (TBG), okrem neho majú väzbovú schopnosť aj transtyretín (prealbumín) a albumín. Väzba hormónov štítnej žľazy na proteín spôsobuje ich neobyčajne dlhý biologický polčas trvajúci u T 4 asi sedem dní a u T 3 asi jeden deň. K zmene T 4 na aktívnu formu T 3 dochádza pôsobením dejodáz aj na periférii. Tento lipofilný hormón vykazuje rovnaký mechanizmus účinku ako steroídne hormóny. Jadrové receptory pre T 3 sú prítomne v mnohých tkanivách. Pri inaktivácii v pečeni a ľadvinách sú T 4 a T 3 zbavené jódu. Niektoré dejodázy patria medzi najzaujímavejšie enzýmy obsahujúce selén. Štítne žľaza je pod kontrolou hypotalamo-hypofyzárnej osy. Podráždenie chladom alebo stresom registruje mozog v hypotalame, ktorého vybrané neuróny zahajujú sekréciu hormónu tyroliberínu (thyreotropin-realising hormone, TR), malého neuropeptidu zloženého iba z troch aminokyselín. TR stimuluje príslušné bunky predného laloku hypofýzy k tvorbe a sekrécii peptidového hormónu tyreotropínu (tyreocyty stimulujúci hormón, TSH). Tento peptidový hormón zložený z dvoch podjednotiek (28 kDa) kontroluje aktivitu buniek štítnej žľazy tým, že stimuluje prakticky všetky procesy podieľajúce sa na biosyntéze tyroidálnych hormónov. Ďalším významným regulačným faktorom je príjem jódu. Hormóny štítnej žľazy riadia vývoj plodu, sú klasickými diferenciačnými hormónmi. Zvyšujú spotrebu kyslíka stimuláciou dýchacieho reťazca, ovplyvňujú metabolizmus takmer všetkých látok v tele (sacharidov, tukov, proteosyntézu, expresiu génov,..), stupňujú bazálny metabolizmus a stimulujú termogenézu, najmä indukciou Na + /K + -ATPázy. 29. Struktura a funkce jednotlivých částí imunoglobulinů. Třídy imunoglobulinů, vlastnosti a funkce. Monoklonální protilátky − příprava, využití. Imunoglobulíny (protilátky) sú syntetizované B-lymfocytmi a syntizujú a vylučujú sa aj z plazmatických buniek. Plazmatické bunky sú terminálne diferencované B-lymfocyty. Pojem protilátka sa používa v súvislosti s imunoglobulínom, ktorý je špecifický pre určitý epitop antigénu. Protilátky sa nekovalnetne viažu na antigény, čím ich imobilizujú, zneškodnia ich alebo ich „označia“ pre zničenie inými zložkami imunitného systému. V poslednom prípade imunoglobulíny uľahčujú iným bunkám a molekulám imunitného systému identifikáciu a interakciu s antigénom. Pretože sú protilátky často rozpustné, sú významnou zložkou humorálnej imunitnej odpovedi. Ľudské imunoglobulíny obsahujú 4 polypeptidy: 2 identické ľahké reťazce a 2 identickéťažké reťazce spojené disulfidickou väzbou za vzniku monomérnej jednotky. Ťažké a ľahké reťazce sú usporiadané tak, že N-koniec jedného ľahkého a jedného ťažkého reťazca vytvoria väzobné miesto pre epitop. Každý ľahký a ťažký reťazec môže byť rozdelený na homologické úseky, označované ako domény. Ľahké reťazce, označované buď κ alebo λ, sú kódované génmi na chromozómoch 2 a 22. Existuje 5 typov ťažkých reťazcov, všetky sú kódované génmi na chromozóme 14 a označujú sa ako μ, δ, γ, ε a α. Geneticky rozdielne formy ľahkých reťazcov a ťažkých reťazcov sa nazývajú izotypy. Imunoglobulínová trieda alebo podtrieda je určovaná izotypom ťažkého reťazca. Imunoglobulínový monomér obsahuje buď 2 identické κ alebo 2 identické λ ľahké reťazce, ale nikdy nie jeden z každého typu. Ľahké reťazce obsahujú variabilnú (V L ) a konštantnú (C L ) doménu. Každá doména obsahuje 110 aminokyselín a vnútromolekulovú disulfidickú väzbu. Variabilné časti (ľahkých aj ťažkých reťazcov) majú svoje meno kvôli rozdielom v sekvencií aminokyselín medzi imunoglobulínami syntetizovanými rozdielnymi B- lymfocytmi. Ťažké reťazce obsahujú jednu variabilnú (V H ) a tri alebo štyri konštantné (C H ) domény. Variabilné domény ťažkých reťazcov sú veľmi rozdielne a konštantné domény (C H ) vykazujú relatívne malé rozdiely medzi členmi izotypu. Ťažké reťazce δ, γ a α obsahujú 3 konštantné domény a ťažké reťazce μ a ε obsahujú 4 konšantné domény, čo z nich robí dlhšie a hrubšie ťažké reťazce oproti ostatným. Variabilné časti ľahkého a ťažkého reťazca spolu vytvárajú „kapsu“, ktorá tvorí väzbové miesto pre antigén (epitop) imunoglubulínu. Pretože imunoglobulínový monomér obsahuje 2 rovnaké ľahké reťazce a 2 rovnaké ťažké reťazce, v každom monomérickom imunoglobulíne sú teda aj 2 väzbové miesta. Variabilita sekvencie aminokyselín vo V L a V H doménach spolu s náhodným párovaním ľahkých a ťažkých reťazcov, ktoré sa líši v každom B-lymfocyte, vytvárajú dostatočné množstvo väzobných miest pre väzbu veľkého množstva rôznych antigénov. Imunoglobulínové molekuly môžu byť enzymaticky rozštiepené na fragmenty buď pomocou pepsínu alebo papínu. Disulfidické väzby spájajú ťažké reťazce v mieste alebo v blízkosti na prolín bohatého pantového miesta(hinge region), ktoré dodáva imunoglobulínu flexibilitu. Štiepením teda vznikajú následné fragmenty:  Fab alebo antigén (epitop) viažuci fragment, vzniknutý štiepením papínom, obsahuje V H , C H 1, V L a C L . Dva Fab fragmenty vznikajú štiepením imunoglobulínového monoméru papaínom, pričom každý fragment má jedno väzobné miesto.  Fc alebo konštantný fragment vzniká štiepením imunoglobulínovej molekuly papaínom. Fc fragment obsahuje C H 2, C H 3 a (v prípade IgM a IgE) aj C H 4 regióny imunoglobulínovej molekuly. Je zodpovedný za veľa biologických aktivít, ktoré sa odohrávajú po naviazaní epitopu.  Fd je ťažkoreťazcová (V H , C H 1) časť Fab fragmentu.  Fd ́ je ťažkoreťazcová (V H , C H 1) časť Fab fragmentu, ktorý vzniká štipením pepsínom. Čiarka ( ́) naznačuje dlhší reťazec vznikajúci iným štiepiacim miestom.  F(ab ́) 2 je dimérová molekula vznikajúca pepsínovým štiepením. Imunoglobulínový monomér dáva vznik jedného F(ab ́) 2 fragment obsahujúci 2 segmenty (V H , C H 1 ́)segmenty spojené disulfidovými väzbami. Tento fragment obsahuje 2 väzbové miesta. Izotypy ťažkých reťazcov (μ, δ, γ, ε a α) tiež určujú imunoglobulínovú triedu alebo izotyp (IgM, IgD, IgG, IgA a IgE). Za normálnych podmienok sa v ľudkom tele tvorí všetkých 5 imunoglobulínových tried. B-lymfocyty môžu exprimovať imunoglobulíny buď ako membránové receptory alebo ako voľné molekuly. Pri vylúčení do telových tekutín zostáva IgG a IgE vo forme monomérov, IgM vytvára pentamér a IgA môže byť vo forme monoméru alebo diméru. IgM existuje buď vo forme monomérového membránového receptoru (2μ + 2κ alebo 2λ) alebo ako pentamér v telových tekutinách, ktorý pozostáva z 10 H a L reťazcov spojených disulfidickými väzbami a J („joining“) reťazcov. Väčšina nestimulovaných B-lymfocytov majú na svojej membráne prítomné IgM. Vo všeobecnosti je IgM prvým imunoglobulínom vznikajúcim po antigénnej stimulácií. IgM je efektívny v imobilizácií antigénu (aglutinácií) a aktivácií komplementu. IgD má monomérnu štruktúru (2δ + 2κ alebo 2λ) a je takmer výhradne membránovým receptorom. O jeho funkcii sa nevie veľa. IgG existuje aj v receptorovej aj v sérovej forme (2γ + 2κ alebo 2λ), kde vytvára monoméry. Existujú 4 podtriedy IgG na základe 4 typov γ reťazca: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Spoločne IgG imunoglobulíny tvoria väčšinu sérových imunoglobulínov. Viacero IgG aktivujú komplement, opsonizujú a neutralizujú mikroorganizmy a vírusy a spúšťajú cytotoxicitu imunocytov a sú tiež významné v mnohých alergických reakciách. IgA sa nachádza vo forme monomérov a dimérov. Monomérne IgA (2α + 2κ alebo 2λ) sa nachádza v sére. Pridaním J reťazca k dvom IgA monomérom vzniká IgA dimér. Epitelové bunky využívajú špeciálny receptor na transport IgA dimérov na povrch sliznice. Tento receptor sa následne stáva prídavnou molekulou na IgA dimére a vzniká ak sekréčny komponent (SC, secretory component). Sekréčne IgA diméry sa nachádzajú v hliene, slinách, slzách, materskom mlieku a črevných sekrétoch. SC vykazuje zvýšenú rezistenciu voči enzymatickej degradácií. 2 izoformy IgA (α 1 a α 2 ) vykazujú mierne rozdielnu funkciu. IgA1 prevláda v plazme a v sekrétoch orgánov uložených nad bránicou. Sekrečný IgA2 zase prevláda v sekrétoch orgánov v dolnej časti GI. Veľké množstvá IgA sú syntetizované a vylučované do slizničných povrchov GIT, dýchacích ciest a iných sekréčnych epitélií. IgA je kvantitatívne najviac vylučovaným izotypom imunoglobulínov (denne sa vylúči viac IgA ako ostatných izotypov spolu). IgE sa v sér nachádza vo veľmi nízkych hladinách, pričom väčšina je naviazaná na povrch žírnych buniek a eosinofilov. Základná štruktúra je (2ε + 2κ alebo 2λ). Žírne bunky a bazofily majú izotyp-špecifické receptory pre Fc časť voľných IgE. Naviazanie epitopu na IgE žírnej bunky odštartuje uvoľnenie histamínu a iných mediátorov zánětu, čo vyvolá okamžitú alergickú reakciu. Monoklonálne protilátky (MABs) sú vylučované imunocytmi, ktoré sú odvodené od jednej bunky produkujúcej protilátky (od jedného klona). Preto je každá MAB špecifická proti iba jednému epitopu antigénu (antigénny determinant). Veľké molekuly antigénovobsahujú viacero epitopov, proti ktorým je produkované množstvo protilátok viacerými B-lymfocytmi. Antisérum, ktoré obsahuje zmes všetkých týchto rôznych protilátok sa nazýva polyklonálne. Monoklonálne protilátky sa využívajú na analytické (analýza určitých proteínov pomocou protilátok), diagnostické (imunochemické metódy, napr. ELISA) alebo terapeutické účely (liečba určitých druhov nádorov). Aby sme získali MABs, musíme fúzovať lymfocyty izolované zo sleziny immunizovanej myši s myšími nádorovými bunkami (myelomové bunky). Tento krok je dôležitý, lebo protilátky produkujúce lymfocyty majú v kultúre životnosť iba niekoľko týždňov. Fúzia lymfocytoc s nádorovými bunkami dá vzniku bunkovým hybridom, nazývaným hybridomy, ktoré sú teoreticky nesmrteľné. Úspešná fúzia je zriedkavá, ale jej úspešnosť môžeme zvýšiť pridaním polyetylén glykolu (PEG). Aby sme získali iba úspešne fúzované bunky, je nutná dlhodobejšia inkubácia v primárnej kultúre s HAT médiom, ktoré obsahuje hypoxantín, aminopterin a tymidín. Aminopterín, analóg dihydrofolátu, kompetentne inhibuje dihydrofolát reduktázu a tak inhibuje aj syntézu dTMP. Pretože dTMP je nevyhnutný pre syntézu DNA, nádorové bunky teda nemôžu prežívať prítomnosti aminopterínu. Aj keď sú slezinné bunky schopné odolať inhibitorovému efektu aminopterínu použitím hypoxantínu a tymidínu, majú iba obmedzenú dĺžku života a umierajú. V kultúre teda prežívajú iba hybridomy, pretože majú aj nesmrteľnosť myelomových buniek a aj schopnosť slezinných buniek odolávať inhibítorom. Iba zopár fúzovaných buniek je vlastne schopných produkovať protilátky. Aby sme mohli identifikovať tieto bunky, hybridomy musíme izolovať a rozmnožovať klonovaním. Následne sa klony testujú na produkciu protilátok a pozitívne kultúry sú vybrané a selektujú sa ďalším klonovaním. Takto dostaneme hybridomy, ktoré syntetizujú monoklonálne protilátky. Nakoniec sa produkcia MAB odohráva in vitro použitím bioreaktoru alebo in vivo opäť v tele myši. III/30. Molekulární podstata diverzity imunoglobulinů primární a sekundární protilátkové odpovědi, somatická rekombinace, izotypový přesmyk. Získaná (adaptívna) imunity je založená na schopnosti lymfocytov vytvárať obrovské množstvá rôznych a jedinečných antigénnych receptorov a sérových protilátok, pripravených na použitie, čo umožňuje schopnosť sa brániť aj voči novým patogénom. Široké spektrum imunoglobulínov (Ig) je produkované genetickou rekombináciou a mutáciami počas vývoja a dozrievania jednotlivých lymfocytov. Predpokladá sa, že v ľudskom organizme sa nachádza asi 10 8 rôznych protilátok. Táto variabilita ovplyvňuje ľahké aj ťažké reťazce imunoglobulínov. Rôzne druhy Ig vznikajúce kombináciou rôznych ľahkých a ťažkých reťazcov, sa nazývajú izotypy. Počas biosyntézy imunoglobulínov, môžu plazamatické bunky premieňať jeden izotyp na druhý („izotypový prešmyk“). Allotypová variácia je založená na existencii viacerých alel jedného génu – teda genetických rozdieloch medzi jedincami. Pojem idiopatická variácia označuje fakt, že väzobné miesto antigénu v F ab fragmentoch je veľmi variabilné. Idiopatická variabilita ovplyvňuje variabilné domény ľahkých a ťažkých reťazcov. V určitých miestach - známych ako hypervariabilné oblasti – je variabilita aminokyselín obzvlášť široká; tieto sekvencie sú priamo zapojené do väzby antigénu. Existuje viacero dôvodov pre extrému variabilitu protilátok: 1. Viaceré gény. Rôzne gény môžu kódovať rôzne proteínové domény. Iba jeden gén z nich je ale vybraný a exprimovaný. 2. Somatická rekombinácia. Gény sú rozdelené do viacerých segmentov, od ktorých existujú viaceré verzie. Viaceré kombinácie segmentov počas dozrievania lymfocytov dáva vznik náhodne kombinovaným novým génom („mozaikové gény“). 3. Somatická mutácia. Počas diferenciácie B-buniek na plazmatické bunky, mutujú kódujúce gény. Týmto spôsobom sa „primordiálne“ zárodočné gény môžu stať inými somatickými génmi v jednotlivých klonoch B-bunky. 4. Izotypový prešmyk. Ide o mechanizmus jedného izotypu protilátky z iného (napr. vznik izotypu IgM z izotypu IgG). Počas tohto procesu sa mení konštantná doména ťažkého reťazca zmení a nemení sa jeho variabilný úsek. Pretože sa nemení variabilná doména, prešmyk neovplyvňuje afinitu k antigénu, ale protilátka môže interagovať s inou efektorovou bunkou. Prešmyky sú regulované cytokínmi. Na príklade biosyntézy κ reťazca u myši je možné ukázať základné vlastnosti génovej organizácie a syntézy imunoglobulínov. Génové segmenty pre ľahké reťazce sa označujú ako L, V, J a C- Všetky sú lokalizované u myši na chromozóme 6 (u človeka na chromozóme 2) a sú od seba oddelené pomocou intrónov o rôznej dĺžke. Okolo 150 rovnakých L segmentov kóduje signálny peptid („leader sequence“) pre sekréciu produktu. V segementy, ktorých je asi 150 rôznych druhov, kódujú väčšinu variabilných domén (95 zo 108 aminokyselín). Segmenty L a V sa vždycky vyskytujú v pároch (v tandemoch). Na rozdiel od nich existuje iba 5 variant J segmentov (joining segements). Tieto kódujú peptid o 13- tich aminokyselinách, ktorý spája variabilné časti κ reťazca ku konštantnej časti. Jediný C segment kóduje konštantnú doménu ľahkého reťazca (84 aminokyselín). Počas diferenciácie B-buniek vznikajú v každej B-bunke jednotlivé V/J kombinácie. Jeden zo 150 L/V tandémových segmentov je vybratý a pripojený k jednému z 5 J segmentov. Takto vzniká somatický gén, ktorý je oveľa menší ako zárodočný gén (germiline gene). Transkripciou tohto génu vzniká hnRNA pre κ reťazec z ktorého sú odstránené vystrihnutím intróny a prebytočné J segmenty. Nakoniec je kompletná mRNA, obsahujúca jeden z každého L-V-J-C segementu, po prenose do cytoplazmy, schopná translácie. Následné kroky biosyntézy Ig je rovnaká ako pri syntéze iných membránových alebo sekrečných proteínov. III/31. Molekulární základy buněčné imunity – rozpoznání patogenu, efektorové mechanismy. MHC molekuly - struktura, funkce, mechanismy prezentace antigenů Tc a Th lymfocytům Vírusy, baktérie, huby a paraziti prenikajúci do organizmu vyšších živočíchov sú imunitným systémom rozpoznané a likvidované. Tiež pozmenené vlastné somatické bunky, napr. nádorové bunky, sú väčšinou rozpoznané ako cudzie a degradované. Imunitnému systému pritom pomáhajú fyziologické zmeny v infikovanom tkanive pod súhrným označením zánět. Táto reakcia pomáha imunitným bunkám produkciou cytokínov k rýchlejšiemu postupu k miestu infekcie. Na imunitnej odpovedi sa podieľajú 2 systémy – vrodená a získaná imunita. Základom získanej (adaptívnej, špecifickej) imunity je schopnosť lymfocytov vytvárať „pri podozrení“ vysoko špecifické antigénne receptory bez toho, aby niekedy došlo ku kontaktu s príslušným antigénom. U človeka existuje mnoho miliard lymfocytoy, z ktorých každý nesie iný antigénny receptor. Ak takýto receptor rozpozná „svoj“ antigén, dôjde k aktivácií tohto lymfocytu, ktorý následne splní svoju špecifickú úlohu v imunitnej odpovedi. Rozlišujeme odpoveď bunkovú a humorálnu. Za bunkovú imunitu zodpovedajú T-lymfocyty (T-bunky). Sú pomenované podľa tymu (brzlík, detská žľaza), kde prebiehajú najdôležitejšie fázy ich diferenciácie. Podľa funkcie rozlišujeme cytotoxické T-bunky (Tc bunky) a pomocné T-bunky (Th bunky). Humorálna imunita súvislí s aktivitou B-lymfocytov (B-bunky) dozrievajúce vo fetálnej pečeni a kostnej dreni. Po aktivácii T-bunkami sú B-bunky schopné vylučovať do krvnej plazmy svoje špecifické receptory v tekutej (humorálnej) forme – protilátky. „Pamäť“ imunitného systému predstavujú pamäťové bunky, ktoré môžu vzniknúť z ľubovoľného druhu lymfocytov (imunocyty). Patogénne zárodky, ktoré vniknú do organizmu, napr. vírusy, sú pohltené antigén prezentujúcimi bunkami a v nich proteolyticky rozložené (1). Takto vzniknuté vírusové fragmenty sú potom s pomocou špeciálnych membránových proteínov (MHC- proteíny) prezentované na bunkovom povrchu (2). Medzi APC patria makrofágy, B-lymfocyty a tzv. dendritické bunky (napr. kožné Langerhnasové bunky). Komplexy vytvorené MHC-proteínom a vírusovým fragmentom sú rozpoznávané T-bunkami nesúcimi receptor viažuci sa k antigénu(receptor T-buniek)(3). Táto väzba aktivuje príslušnú T-bunku a jej selektívne pomnoženie (4; „klonálna selekcia“): Proliferáciu imunocytov stimulujú interleukiny (IL). Tento termín zahŕňa viac ako 20 signálnych peptidov zo skupiny cytokínov, ktoré umožňujú vzájomnú komunikáciu medzi imunocytmi. Napr. aktivované makrofágy vylučujú IL-1 (5), naopak T-bunky stimulujú vlastné delenie aj množenie ďalších imunocytov produkciou IL-2 (6). Aktivované T-bunky preberajú podľa typu rôzne úlohy. Cytotoxické T-bunky sú schopné rozpoznať vírusom napadnutú somatickú bunku alebo bunku nádorovú a naviazať sa na ňu (7). Následne infikovanú bunku prevedú do apoptózy a usmrtia ju sekréciou perfornu a granzymu B. Bielkovina perforín prederaví plazmatickú membránu cieľovej bunky a vpustí do vnútra proteázu grazym B, ktorá spúšťa apoptózu (8). Ako alternatíva prichádza do úvahy aktivácia Fas na cieľových bunkách pomocou Fas-ligandov na povrchu cytotoxických T-buniek, čo vedie iniciácii kaspázovej kaskády smerujúcej tiež k apoptóze. B-lymfocyty prezentujúce ako APC na svojom povrchu vírusové fragmenty sú rozpoznávané pomocnými (helper) T-bunkami prostredníctvom svojich receptorov T-buniek (9). Za súčasnej stimulácie interleukínmi dochádza následne k selektívnemu klonárnemu pomnoženiu tých B-buniek. ktoré nesú antigénny receptor odpovedajúci patogénu (10). Tie dozrejú na plazmatické bunky (11) a začnú secernovať veľké množstvo rozpustných protilátok (12). Pre selektivitu imunitnej odpovede je rozhodujúce, či zúčastnené bunky spoľahlivo rozpoznávajú cudzorodé antigény a proteíny na ostatných imunocytoch. K tomuto účelu obsahujú antigénne receptory na bunkového povrchu ešte korecepetory, ktoré rozlíšenie podporujú. Mnohé antigénne receptory patria do tzv. imunoglobulínovej nadrodiny. Spoločným znakom týchto proteínov je prítomnosť „imunoglobulínových domén“. Sú pre ne charakteristické zbalené subštruktúry zložené zo 70-110 aminokyselín. Nachádzajú sa aj v rozpustných imunoglobulínoch. Proteíny Ig-nadrodiny sú zostavené z konštantnej a variabilnej časti. Na C-konci receptory obsahujú transmembránové helixy kotviace ich v membráne. V proteínoch Ig-rodiny je tiež možne nájsť intramolekulárne a intermolekulárne disulfidové mostíky. Imunoglobulín M (IgM) je povrchový membránový proteín B- lymfocytov, ktorý slúži k naviazaniu voľných antigénov na B- bunky. Naopak receptory T-buniek viažu antigény len v prípade, že sú prezentované inou bunkou ako komplex s MHC-proteínom. Interakcia medzi antigénom viazaným na MHC a receptorom T-buniek podporujú koreceptory. Do tejto skupiny radíme CD8, membránový receptorový proteín, ktorý je typický pre cytotoxické T-bunky a viaže sa na MHC-proteiny I.triedy. Naopak pomocné T-bunky využívajú ako koreceptor CD4 a viažu sa na MHC-proteiny II.tiredy. Skratka „CD“ (cluster of differentiation“) sa používa na označenie veľkej skupiny proteínov lokalizovaných na bunkovom povrchu, čo umožňuje ich preukázanie pomocou protilátok. Okrem CD4 a CD8 existuje na imunocytoch množstvo ďalších koreceptorov. Proteíny MHC sú membránové proteíny somatických buniek prezentujúce antigénne peptidy T-lymfocytom (antigénna prezentacia). Označujú sa podľa úseku DNA „major histocompatibility complex“, ktorý ich kóduje. Ľudské MHC proteíny sú nazývané aj HLA-antigény (human leukocyte-associated antigens). Ich polymorfizmus je tak veľký, že takmer vylučuje, aby dvaja jednotlivci – s výnimkou jednovaječných dvojčiat – mali rovnakú sadu MHC-proteínov. MHC-proteíny I.triedy sa vystavujú takmer na všetkých bunkách s jadrom. Interagujú hlavne s cytotoxickými T-bunkami a sú príčinou odhojenia transplantovaných orgánov. MHC-proteíny I.triedy sú heterodiméry (αβ), podjednotka β býva označovaná tiež ako β 2 -mikroglobulín. MHC-proteíny II.triedy sú zložené tiež z dvoch navzájom príbuzných peptidových reťazcov. Ich molekuly sú prítomné na všetkých antigén-prezentujúcich imunocytoch. Slúžia k interakcii medzi týmito bunkami a pomocnými T- bunkami nesúcimi CD4. Na obrázku vedľa je znázornená interakcia vírusom infikovanej somatickej bunky s cytotoxickým T- lymfocytom nesúcim CD8. Infikovaná bunka syntetizuje v cytoplazme vírusové proteíny, štiepi ich na peptidy a peptidové fragmenty transportuje s pomocou špecifického transportéru (TAP) do endoplazmatického retikula. Tu dôjde k spojeniu novo vytvorených MHC-proteínov I.triedy s vírusovými peptidmi a ich vezikulárnemu transportu na bunkový povrch. Vírusové peptidy sú na povrchu α 2 - domény MHC-proteínu fixované v „jamke“ vytvorenej zo zloženého listu („dno“) a dvoch hélixov („steny“). T–bunka s vhodným T-bunkovým receptorom je viazaná na komplex MHC- peptidov. Podporuje ju pritom množstvo koreceptorov vrátane CD8, ktorý sa viaže na konštantnú časť MHC. Väzba MHC- komplexu na receptor T-buniek aktivuje vo vnútri T-bunky proteinkinázy, ktoré vyvolajú sériu ďalších reakcii (prenos signálu). Na záver dôjde k likvidácii vírusom napadnutej bunky cytotoxickými T-bunkami. III/32. Základní imunochemické metody. Imunoturbidimetrie, ELISA, RIA. Imunochemické metódy sú založené na reakcii antigénu s protilátkou. Presnejšie ide o reakcie epitopov antigénov s väzbovými miestami protilátok. Pomocou týchto metód určujeme prítomnosť patogénov alebo určitých protilátok vo vzorke. Antigén je makromolekulová látka (prírodná alebo synteticky vyrobená), ktorú organizmus rozpoznáva ako cudziu. Prítomnosť antigénu v organizme vyvolá imunitnú odpoveď, pri ktorej dôjde k stimulácii lymfocytov, ktoré začnú produkovať protilátky. Protilátka je molekula, ktorá je schopná sa naviazať na antigén a spustiť tak obrannú reakciu organizmu. Rozlišujeme polykonárne (namierené voči viacerým epitopom určitého antigénu), monoklonárne (namierené voči jednému epitopu) a rekombinantné protilátky (kombinácia obidvoch predchádzajúcich prípadov). Imunoprecipitačné metódy sú založené na reakcii rozpusteného antigénu s protilátkou, pri čom vzniká precipitát (jemná zrazenina). Môže ísť o kvantitatívne alebo kvalitatívne metódy. Môžu prebiehať v roztoku alebo v géle. Počas imunoprecipitancie sa do skúmaviek s konštantným množstvom protilátky pridáva zvyšujúce sa množstvo rozpusteného antigénu, vzniká precipitát, ktorý sa oddelí centrifugáciou. Vzťah medzi koncentráciou antigénu a množstvom antigénu charakterizuje kvantitatívna imunoprecipitačná krivka. Imunoprecipitačná krivka je základom pre rôzne imunochemické metódy. Krivka má tri oblasti. V oblasti nadbytku protilátky so zvyšujúcou sa koncentráciou antigénu vzniká väčšie množstvo precipitantu; na všetky väzbové miesta antigénu sú naviazané protilátky, vznikajú malé rozpustné komplexy antigénov s protilátkou, vo vzorke nepreukážeme žiaden voľný antigén, ale môžu sa vyskytovať voľné protilátky, množstvo vzniknutých komplexov je úmerná koncentrácii prítomného antigénu. V oblasti ekvivalencie dochádza k vzájomnému spájaniu molekúl antigénu a protilátky, čím vznikajú veľké nerozpustné komplexy s mriežkovitou štruktúrou, ktoré vytvárajú po agregácii precipitant; vo vzorke nevieme preukázať ani voľný antigén ani voľnú protilátku. V oblasti nadbytku antigénu klesá koncentrácia precipitantu v dôsledku vysokej koncentrácie antigénu; veľké nerozpustné komplexy sa rozpadajú; všetky väzbové miesta protilátok sú nasýtené antigénom a niektoré antigény ostávajú bez väzby s antigénom; vznikajú malé rozpustné komplexy; vo vzorke sú prítomné voľné antigény a nevyskytujú sa voľné protilátky. Medzi základné imunoprecipitačné metódy v géle patria najmä imunodifúzne metódy, ale aj imuelektroforézy alebo imunofixácie. Pri jednoduchej radiálnej imunodifuzií je vzorka s antigénom aplikovaná do jamiek v agarózovom géle obsahujúcich špecifickú protilátku. Nasleduje 2-3 dňová inkubácia pri laboratórnej teplote. Počas inkubácie sa antigén začne radiálne difundovať do tohto gélu. Pri reakcii antigénu so špecifickou protilátkou sa vytvorí imunoprecipitačný prstenec, ktorého plocha je úmerná množstvu antigénu. Výsledky vzoriek vyhodnocujeme pomocou špeciálneho pravítka, ktoré meria plochu prstencov a tým stanovuje koncentráciu antigénu vo vzorkách. Táto metóda je veľmi lacná a nenáročná, ale vyžaduje dlhú inkubáciu; využíva sa napr. pri stanovení koncentrácie väčšiny plazmatických bielkovín (IgG, IgM, IgA, transferín,...). Imunoprecipitačné metódy v roztoku využívajú na stanovenie koncentrácie fakt, že pri reakcii antigénu s protilátkou vzniká v roztoku zákal, patrí sem imunonefelometria a imunoturbidimetria. Pri imunoturbidimetrii sa meria spetrofotometrom intenzita svetla pohlteného zákalom a následne sa na základe absorbancie stanoví koncentrácia antigénu v neznámej vzorke (určuje sa pomocou oblasti nadbytku protilátky imunoprecipitačnej krivky, kde je koncentrácia antigénu je priamo úmerná koncentrácii precipitantu). Imunonefelometria je založená na meraní intenzity rozptýleného svetla, ktoré vychádza z roztoku všetkými smermi. Intenzita sa meria pod uhlom, ktorý je odlišný od smeru dopadajúceho žiarenia (väčšinou 45°alebo 90°), pričom na meranie sa využíva nefelometer, kde je zdrojom žiarenia laser. Koncentrácia antigénu sa meria analogicky ako pri imunoturbidimetrii. Imunoanalytické metódy so značenými reaktantami sú založené na značení antigénu alebo protilátky určitou látkou, ktorej detekcia je citlivejšia ako dôkaz imunoprecipitátu. Takouto označujúcou látkou môže byť enzým, rádioizotop alebo aj florescenčná látka. Medzi tieto metódy patrí najmä ELISA a RIA. ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) je analytická metóda využívaná ku kvantitatívnemu stanoveniu rôznych antigénov. Táto metóda má množstvo variant. Všetky sú založené na vysoko špecifickej interakcii antigénu a protilátky, pričom na jednu z týchto látok je kovalentne naviazaný enzým (najčastejšie peroxidáza alebo alkalická fosfatáza). Enzým katalyzuje chemickú premenu substrátu, ktorý je pridaný do reakčnej zmesi, na produkt, ktorý je farbený. Stanovuje sa potom spektrofotometricky alebo na základe fluorescencie. Koncentrácia produktu je úmerná koncentrácii antigénu alebo protilátky vo vzorke. Ďalším spoločným znakom metód ELISA je zakotvenie (adsorpcia alebo kovalentné naviazanie) antigénu alebo protilátky na nerozpustný nosič (často povrch reakčnej nádobky alebo mikrotitračnej doštičky), čo uľahčuje separáciu imunochemicky naviazaných molekúl. Štandardná sendvičová ELISA na zistenie koncentrácie antigénu sa robí následne: 1. naviaže sa protilátka na dno nádoby 2. pridá sa vzorka a inkubuje sa – dochádza k vzniku väzby antigén-protilátka 3. odmyje sa nenaviazaný antigén 4. pridá sa druhá protilátka, viažuca rovnaký antigén. na ktorej je kovalentne pripojený enzým 5. inkubuje sa a následne sa odmyje prebytočná protilátkay s enzýmom 6. pridá sa substrát a prebehne tak enzýmom katalyzovaná reakcia 7. zastaví sa reakcia a prebehne meranie Ako sendvičová sa nazýva preto, lebo antigén je ako sendvič medzi dvomi protilátkami. Podobne sa reakcia môže uplatniť pri detekcii protilátok vo vzorke. Táto prebehne podobne, akurát v je v 1. kroku naviazaný antigén a druhá protilátka je proti stanovovanej protilátke. Táto metóda sa označuje ako capture ELISA. RIA (radioimunoanalýza) je imunochemická reakcia antigénu so špecifickou protilátkou v in vitro prostredí za prítomnosti vhodnej radioaktívne značenej zlúčeniny ako radioindikátoru, ktorý umožňuje kvantifikáciu výsledku na základe určenia distribúcie aktivity. Ide o kompetetívnu reakciu, v ktorej značený antigén súperí s neznačeným antigénom o väzbové miesta protilátky, ktorá je v roztoku v obmedzenom množstve. Stanovovanou látkou v reakcii je neznačený antigén. Ďalší antigén je značený napr. rádioaktívnym izotopom jódu (používa sa pre proteíny) alebo tretiom či 14 C (používa sa pre nízkomolekulové látky). Výsledkom reakcie je vznik dvoch komplexov: komplexu značeného antigénu a protilátky a komplex neznačeného antigénu a protilátky. Množstvo značeného komplexu je nepriamo úmerné množstvu stanovovaného antigénu, čiže čím je viac stanovovanej látky sa vo vzorke nachádza, tým menšie množstvo značeného komplexu vznikne a tým menší bude výsledný signál. Dá sa to vysvetliť tým, že značené antigény sa nenaviažu na protilátku, kvôli nedostatku väzobných miest, ktoré obsadia neznačené antigény. V reakčnej zmesi sa budú nachádzať aj oba typy antigénov. Celková reaktivita (T) sa rozdelí do dvoch frakcií – viazané (B) a voľné (F), pričom platí T=B+F. III/33. Vitamíny rozpustné v tucích. Vitamíny sú životne dôležité organické zlúčeniny, ktoré živočíšny organizmus nie je schopný sám syntetizovať, ale v malých množstvách ich potrebuje pre svoj metabolizmus. Väčšinou ide o prekurzory konzýmov alebo antioxidačné látky. Potreba vit5amínov závisí na veku, pohlaví a fyziologickom stave, napr. gravidite, laktácií, fyzickej záťaži a výžive. Pri zdravom spôsobe výživy je potreba vitamínov pokrytá. Zdrojom vitamínov je potrava a črevná mikroflóra, ktorá ich však produkuje v oblasti so zlou resorpciou. Podvýživa, nevhodná výživa (jednostranné stravovanie starších osôb, alkoholikov, konzumácia polotovarov,...) alebo poruchy resorpcie môžu vyvolať vitaminovú karenciu, ktorá môže prejsť v hypovitaminózu a v extrémnych prípadoch aj v avitaminózu. Nedostatok vitamínov môže byť spôsobený aj medikamentóznou liečbou vyvolávajúcou hynutie črevnej mikroflóry, kedy napr. podávanie antibiotík zastaví bakteriálnu syntézu niektorých vitamínov (K, B 12 , H). Iba málo vitamínov môže telo ukladať (A, D, E, B 12 ), takže sa pri ich nedostatku potravou rýchlo objavia karenčné ochorenia často postihujúce kožu, krvinky a nervový systém. Nedostatok vitamínov môže byť kauzálne liečený zlepšením výživy a podávaním vitamínových liečebných preparátov. Predávkovanie vitamínmi je možné len u A, B 6 a D a spôsobí hypervitaminózu s príznakmi intoxikácie. Normálne sú prebytočné vitamíny rýchlo vylučované močom. Vitamíny rozdeľujeme na vitamíny rozpustné v tukoch a vo vode. V tukoch sa rozpúšťajú vitamíny A, D, E a K. Všetky patria medzi izoprenoidy. Vitamín A (retinol) je základnou zložkou retinoidov, ku ktorým počítame tiež retinal a kyselinu retinovú. Retinoidy sa môžu syntetizovať enzymatickým štiepením provitamínu β-karoténu. Retinoidy sú prítomné v potravinách živočíšneho pôvodu. β-karotén naopak v ovocí a zelenine (hlavne v mrkvi). Retinal sa vo forme chromoproteínového farbiva rodopsínu zúčastnia procesu videnia (otázka III/21). Kyselina retinová ovplyvňuje, podobne ako steroidné hormóny, transkripciu génov v bunkovom jadre. Pôsobí ako diferenciačný faktor behom rastu a vývoja organizmu. Nedostatok vitamínu A sa prejaví šeroslepotou, poškodením oka a poruchami rastu. Vitamín D (kalciferol, kalciol) je prekurzorom hormónu kalcitriolu. Spolu s dvomi ďalšími hormónmi (parathormónom a kalcitriolom) riadi kalcitriol metabolizmus vápniku. Kalcitriol sa tvorí v koži fotochemickou reakciou z 7-dehydrocholesterolu, medziproduktu biosyntézy cholesterolu. Ak je ožiarenie kože UV-svetlom nedostatočné a vitamín chýba v potrave, objavia sa karenčné príznaky, ktoré manifestujú u detí ako rachitis a u dospelých ako osteomalácia. V oboch prípadoch je zhoršená mineralizácia kostí. Vitamín E (tokoferol) a príbuzné zlúčeniny sa vyskytujú výhradne v rastlinách, napr. v kľučiacej pšenici. Obsahujú chromanový kruh. Vitamín E je prítomný hlavne v lipidovej zložke biologických membrán a ako antioxidant tu chráni nenasýtené lipidy pred ROS a inými radikálmi. Vitamín K (fylochinón) a podobné zlúčeniny s odvráteným bočným reťazcom sa zúčastňujú v pečeni a osteoblastoch na γ- karboxylácií glutamátových zvyškov. Týka sa to hlavne zrážacích faktorov II, VII, IX, X, proteínu C a S a osteokalcínu. Účinnou formá forma pôsobiaca ako kofaktor γ-karboxylázy sa tvorí z vitamínu enzymatickou redukciou. Anatagonisti vitamínu K (napr. deriváty kumarínu) túto redukciu aj následnú karboxyláciu potláčajú, čo sa terapeuticky využíva k znižovaniu zrážanlivosti krvi v rámci prevencie trombózy. Karencia vitamínu K je vzácna, pretože je produkovaný črevnými baktériami. U človeka tento dej prebieha v hrubom čreve, kde je však jeho resorpcia pomerne nízka. III/34. Vitamíny rozpustné ve vodě. Medzi vitamíny rozpustné vo vode patria vitamíny skupiny B spolu s vitamínmi C a H. Vitamín B 1 (tiamín) obsahuje jeden pyrimídínový a jeden tiazolový kruh spojené s metylovou skupinou. Jeho aktívnou formou je tiamindifosfát (tiamínpytofosfát, TPP) pôsobiaci ako koenzým pri prenose hydroxyalkylových zvyškov(aktívnych aldehydových skupín), oxidatívnej dekarboxylácie 2-oxokyselín a transketolázovej reakcií. Nedostatok tiamínu spôsobuje chorobu beri-beri, ktorú sprevádzajú neurologické poruchy, srdcovú nedostatočnosť a svalovú atrofiu. Vitamín B 2 je komplexom viacerých vitamínov: Riboflavín je súčasťou redoxných koenzýmov flavínmononukleotidu (FMN) a flavínadeníndinukleotidu (FAD). FMN a FAD sú ako prostetické skupiny kofaktory rôznych oxidoreduktáz. Špecifické karenčné ochorenie nie je známe. Folát, anión kyseliny listovej, je tvorený derivátom pteridínou, 4-aminobenzoátom a jedným či viacerými zvyškami glutamátu. Po redukcií na tetrahydrofolát (THF) slúži ako koenzým metabolizmu C L . Nedostatok folátu je predovšetkým príčinou poruchy biosyntézy nukleotiodv a tým aj bunkovej proliferácie (megaloblastická anémia). Nikotinát a nikotínamid (niacín) sú potrebné pre biosyntézu koenzýmu NAD + a NADP + . Živočíšny organizmus dokáže zmeniť tryptofán na nikotinát, avšak s nedostatočným výťažkom Nedostatok vitamínu sa manifestuje kožnými poruchami (pelagra), tráviacimi problémami a depresiami. Pantotenát, kyslý amid β-alanínu a 2,4-dihydroxy-3,3- dimetylbutyrátu (pantoinát) je prekurzorom koenzýmu A a acyl-carier-proteínu (ACP). Karenčné ochorenia sú veľmi vzácne. Vitamín B 6 sa skladá zo substituovaných pyridínov – pyridoxalu, pyridoxolu alebo pyridoxamínu. Pyridoxal nesie na C-4 aldehydovú skupinu (-CHO); pyridoxol je príslušný alkohol (-CH 2 OH) a pyridoxamín príslušný amín (-CH 2 NH 2 ). Aktívnou formou vitamínu B 6 je pyridoxalfosfát, najdôležitejší koenzým metabolizmu aminokyselín. Tiež glykogénfosforyláza obsahuje ako kofaktor pyridoxalfosfát. Nedostatok tohto vitamínu je vzácny. Vitamín B 12 (kobalamín) obsahuje tetrapyrolový systém (korín) s kobaltom ako centrálnym atómom. Je syntetizovaný výhradne mikroorganizmami. Kobalamín je v čreve resorbovaný len vtedy, keď žalúdočná sliznica secernuje tzv. vnútorný faktor, glykoproteín schopný viazať kobalamín („vonkajší faktor“) a chrániť ho pred rozštiepením. Veľa vitamínu B 12 môže skladovať pečeň a pokryť tak aj jeho niekoľkomesačnú spotrebu. Karenciu spôsobuje väčšinou nedostatok vnútorného faktoru arezultujúca porucha resorpcie. Následkom je postihnutie krvetvorby (perniciózna anémia). Deriváty kobalamínu sa zúčastňuje transportných reakcií. Vitamín C je kyselina L-askorbová (2-oxogulonolakton). Prívod vitamínu C potrebuje človek, väčšina opíc a morčatá, lebo im chýba enzým L-gulonolaktonoxidáza katalyzujúci posledný krok premeny glukózy na askorbát. Termolabilný vitamín C sa vyskytuje hlavne v ovocí aj zelenine. Do mnohých sladených nápojov a potravín sa kyselina askorbová pridáva ako oxidačná ochrana alebo chuťové korigens. V organizme pôsobí kyselina askorbová ako redukčné činidlo hlavne pri syntéze kolagénu, katecholamínov, žlčových kyselín a štiepenie tyrozínu. Jeho nedostatok sa manifestuje ako skorbut (kurděje) poškodením spojivových tkanív, krvácaním a vypadávaním zubov. Vitamín H (biotín) je v organizme svojim bočným reťazcom kovalentne spojeným s lyzínovými zvyškami enzýmov katalyzujúcimi karboxylačné reakcie. Medzi karboxylázy závislé na biotíne patria pyruvátkarboxyláza a acetyl-CoA-karboxyláza. Biotín vykazuje vysokú afinitu a špecifitu k avidínu, proteínu vtáčieho bielka. III/35. Struktura, složení a vlastnosti buněčných membrán. Membrána je heterogénna štruktúra, ktorá oddeľuje bunku od mimobunkového prostredia (bunková membrána), ale tiež rozdeľuje bunkové vnútro na niekoľko oddielov – bunkových kompártmentov. Membrána totiž obaľuje aj jednotlivé subcelulárne organely (membrány sarkoplazmatického retikula, mitochondrií, jadra atd.). Aj napriek tomu, že existujú rôzne typy membrány, ich morfologická štruktúra je veľmi podobná a tvorí ju vždy dvojvrstva amfipatických lipidov (široká 4-13 nm), do ktorej sú zanorené proteínové molekuly. V niektorých typoch membrán sú naviac aj molekuly sacharidov viazané na lipidy, prípadne aj bielkoviny. Táto rôznorodosť molekúl sa významne podieľa na biochemickej heterogenite membránových štruktúr. Hydrofóbne vnútro lipidovej dvojvrstvy je nepriepustný pre väčšinu látok, tvorí bariéru transportu z extracelulárneho do intracelulárneho priestoru či z jedného do druhého bunkového kompártmentu. Lipidová štruktúra je síce relatívne pevne organizovaná, ale jej jednotlivé komponenty vykonávajú náhodné Brownové pohyby, typické pre kvapalnú fázu. Membrána je selektívny predel, ktorý iba obmedzuje voľnú difúziu látok, nie je však rigídnou štruktúrou, ale viskóznou kvapalinou (tzv. tekutá mozaika). Kvalitatívne a kvantitatívne charakteristiky membránových lipidov, cukrov a bielkovín s ich vzájomné nekovalentné interakcie podmieňujú priepustnosť štruktúry a tým udržiavajú stále vnútorné prostredie. Ak akýkoľvek podnet ovplyvní fluiditu (tekutosť membrány) zmenou fyzikálno-chemických charakteristík a zásahom do hydrofóbnych a hydrofilných vlastností membránových komponentov, zmení sa významne schopnosť membrány transportovať látky, poruší sa kompartmentácia bunkových dejov a nasleduje postupné zrútenie všetkých interakcii medzi bunkami, tkanivami a orgánmi. Bunkové membrány sa podieľajú na: 1. Ohraničení a izolácii buniek a organel pomocou membrány. Poskytuje to fyzikálnu a chemickú ochranu pre okolitými vplyvmi. Existencia intaktnej plazmatickej membrány garantuje koncentračné rozdiely medzi obomi stranami membrány. 2. Kontrolovanom transporte látok, ktorý určuje vnútorne prostredie, je predpokladom homeostázy – stavu konštantnej koncentrácie látok a fyziologických parametrov. Selektívny transport látok pórmi, kanálmi a transportérmi je nutný pre ohraničenie buniek a organel membránovými systémami 3. Komunikácii medzi bunkami – uvoľnenie špecifickej látky z povrchu jednej bunky a jej prijatie povrchom inej bunky je podmienené paralelnou produkciou látok, ktoré sú nasledovne viazané na rôzne, v membráne zabudované proteíny (viac v otázkach o bunkovej signalizácii v IV. bloku –otázky IV/1 – IV/10) 4. Transporte proteínov z miesta ich syntézy na ribozómoch a tiež na ich chemických modifikáciách, ktoré prebiehajú v endoplazmatickom retikule a Golgiho aparáte 5. Skladovaní rôznych látok a ich následnom vylučovaní (viac otázka IV/27) 6. Enzymatickej katalýze. Na membránach, teda v hraničných olastiach medzi lipidovou a vodnou fázou sú lokalizované dôležité enzýmy. Na tomto mieste prebiehajú tiež reakcie s nepolárnymi substrátmi. Príkladom takejto reakcie môže byť biosyntéza lipidov a metabolizmus nepolárnych cudzorodých látok. Na membránach prebiehajú aj najdôležitejšie reakcie nutné pre zmeny energie – oxidatívna fosforylácia a fotosyntéza. 7. Membrána obsahuje aj antigénne systémy, ktoré sú podmienené sacharidovými komponentami v glykoproteínoch a glykolipidoch membrány 8. Interakcii s ostatnými bunkami nutnej pre fúziu a tvorbu tkanív a prepojenie s extracelulárnou matrix 9. Ukotvení cytoskeletu nutné pre udržanie tvaru buniek alebo organel ako základ pohybových aktivít Lipidy v membráne sú jednak fosfolipidy (glycerofosfolipidy aj sfingofosfolipidy), lysofosfolipidy a cholesterol. Všetky lipidy sú amfipatické molekuly – obsahujú polárnu (hydrofilnú) a nepolárnu (hydrofóbnu) časť. Glycerofosfolipidy sú odvodené od kyseliny fosfatidovej, ktorá na uhlíkoch C1 a C2 má esterovou väzbou viazané rôzne dlhé nasýtené alebo nenasýtené mastné kyseliny. Priepustnosť membrány je určovaná práve interakciami medzi lineárnou štruktúrou nasýtenej mastnej kyseliny a rôzne „zlomenými“ štruktúrami nenasýtenej mastnej kyseliny. Zlom vzniká v mieste dvojitej väzby – ide o cis-izoméry nenasýtenej mastnej kyseliny. Tieto mastné kyseliny sú buď monoenové alebo polyenové. Na treťom uhlíku kyseliny fosfatidovej sú na fosfátový zvyšok ďalej esterovo viazané ďalšie molekuly – buď aminokyselina serín, aminoalkoholy etanolamín a cholín alebo cukorný alkohol inositol. Hlavnými glycerolfosfolipidami sú fosfatidylcholín (lecitín) a fosfatidyletanolamín. Vedľajšími sú potom fosfatidylserín a fosfatidylinsitol. Špecifickým glycerofosfolipidom je kardiolipín, ktorý je súčasťou vnútornej mitochondriálnej membrány. Membránové lipidy sú rozdelené v membráne asymetricky. Vo vonkajšom liste sa nachádza viacej fosfatidylcholínu a sfingomyelínu, pričom na vnútornom liste prevažuje fosfatidylserín a fosfatidyletanolamín. Foasfatidylinositol je prítomný iba na vnútornej strane a glykolipidy iba na vonkajšej. Lysofosfolipidy vznikajú odštiepením jedného acylového zbytku z glykolipiodov (väčšinou z druhého uhlíku glycerolu). V tkanive sa ich zastúpenie zvyšuje pri krátkodobej tkanivovej ischémii alebo hypoxii. Plazmalogeny sú špecifické glycerofosfolipidy, ktoré majú na C1 uhlíku cez éterovú väzbu naviazanú mastnú kyselinu. Vyskytujú sa v rôznych koncentráciách v mozgu, srdcovej a kostrovej svalovine – ich prítomnosť v membráne ovplyvňuje fluiditu. Kvalitatívne a kvantitatívne zmeny plazmogenov sú vyvolané rôznymi fyziologickými a patologickými podnetmi, ale presný funkčný význam týchto biochemických zmien nie je doposiaľ presne objasnený. Fosfosfingolipidy – sfingomyelíny – sú prítomné predovšetkým v membránach nervového tkaniva a mozgu. Glykosfingolipidy – cerebrosidy, asialogangliosidy, gangliosidy a sulfamíny – sú charakteristické amfipatické lipidy membrán nervových buniek, kde môžu mať funkciu receptorov. Cholesterol je charakteristickou molekulou membrány všetkých živočíšnych buniek. Prítomnosť tejto steroídnej látky obmedzuje pohyb v membráne, cholesterol preto významne zvyšuje rigiditu membrány. Sacharidy prítomné v membráne (rôzne glykoproteíny alebo glykolipidy) vytvárajú morfologicky špecifickú vrstvu membránovej štuktúry – glykokalyx. Väzba sacharidu na bielkovinu sa realizuje cez OH skupiny (O-glykozidová väzba) určitej aminokyseliny (napr. serínu alebo treonínu) alebo cez aminoskupiny určitej aminokyseliny. Membrány okrem lipidov obsahujú aj proteíny. Tieto membránové proteíny majú rôzne funkcie: slúžia ako transportéry, kanály, receptory, enzýmy, antigény alebo štrukturálne proteíny a sú buď pevnou súčasťou membrán (integrálne membránové proteíny) alebo sú s nimi spojené len voľne (periférne membránové proteíny). Integrálne membránové proteíny husto pretkávajú lipidovú dvojvrstvu. Domény peptidových reťazcov lokalizované vo vnútri dvojvrstvy obsahujú väčšinou 20 až 25 prevažne hydrofóbnych aminokyselinových zvyškov tvoriacich pravotočivý α-helix. Mambránové proteíny typu I a II obsahujú iba jeden transmembránový helix, proteíny typu III ich majú viac. Len zriedka agregujú rôzne proteíny typu I a II k transmembránovému peptidu tyou IV. Proteíny typu V a VI majú lipidové kotvy, čo sú s peptidovým reťazcom kovalentne spojené mastné kyseliny (palmitové, myristinová), izprenoidy (farnesol, geranylgeraniol, dolichol) alebo glykolipidy ako glykozylfosfatidylinositol (GPI). Niektoré membránové proteíny prenikajú membránou antiparalelnými štruktúrami tvaru zloženého listu. Pre ich vzhľad sa táto terciárna štruktúra nazýva β-soudek (β-barel). Periférne membránové proteíny sú na membránu napojené len slabými vodíkovými väzbami alebo elektrostatickými interakciami, ktoré ich spájajú s hydrofilnými časťami membrány. Tieto bielkoviny sa pripájajú na vonkajšiu ale aj na vnútornú časť dvojvrstvy. Väčšina proteínov má naviac aj lipidovú kotvu. Tieto bielkoviny majú vlastnosti receptorv, enzýmov, alebo antigénov. Kadheríny sú špecifické transmembránové glykoproteíny, ktoré vytvárajú spojky medzi bielkovinnými komponentami membrány a proteínmi cytoskeletu. Často prepájajú rôzne bunky (aktivácia týchto špecifických glykoproteínov vyžaduje prítomnosť vápenatých iónov). III/36. Transport látek přes membrány. Základnou vlastnosťou membrán je permeabilita. Membrány sú nepriechodné pre ióny a silne polárne látky (aj s malou molekulou). Prestup látok cez membránu je určovaný predovšetkým chemickým zložením dvojvrstvy: dĺžkou reťazca mastných kyselín, počtom a polohou dvojitých väzieb, množstvom cholesterolu, typom glycerofosfolipidov, charakterom glykozidovej väzby, rotáciou a laterálnymi pohybmi fosfolipidov vo vnútri membránovej dvojvrstvy. Spolu s kvalitatívnymi a kvantitatívnymi charakteristikami membránových proteínov (bielkoviny „plavú“ v lipidovej dvojvrstve) štruktúra membrány podmieňuje rýchlosť transportu a určuje priestupnosť membrány podmieňuje rýchlosť transportu a určuje priestupnosť látok cez membránu. Prestup určitej látky cez membránu závisí prechodne aj na veľkosti a chemickej štruktúre danej látky. Zatiaľ čo nepolárne (hydrofóbne) látky (napr. etanol, éter, benzén, narkotiká, atď.) difundujú relatívne ľahko, hydrofilné látky sú cez membrány zle prenosné – spomalenie vnáša aj elektrický náboj hydrofilnej látky. Preto v prípade prestupu aj relatívne malých polárnych molekúl sú nutné rôzne komplikovanejšie štruktúry (špecifické proteíny – poríny, prenášače, pumpy, ATPázové mechanizmy). Selektívny transport cez membránu je jednou z jej základných funkcii. V podstate je možné transport látok rozdeliť do dvoch skupín, na pasívny prenos (jednoduchá (prostá) difúzia a uľahčená (usnadnená, facilizovaná) difúzia) a aktívny prenos. Základný rozdiel medzi pasívnym a aktívnym prenosom je v uplatnení buď iba fyzikálneho princípu (Fickov zákon) pre pasívny transport v smere koncentračného gradientu alebo sa uplatňujú aj pochody spočívajúce na reakciách katalyzovaných enzýmami za spotreby energie (ATP) – aktívny prenos, keď transport môže isť aj proti koncentračnému gradientu. Jednoduchá (prostá) difúzia – látka sa najprv rozpúšťa v membránových lipidoch a potom sa následne rozmiesti na druhej strane. Tak sú prenášané molekuly mnohých organických látok a plynov (O 2 , N 2 , CO 2 ). Iné hydrofóbne látky, ale aj niektoré nízkomolekulové polárne látky (močovina) prestupujú drobnými otvormi v membráne, ktoré sa opakovane tvoria a následne rýchlo zanikajú, pričom ich veľkosť je asi 0,3 nm. Voda prechádza cez membránu rôznymi nepravidelnosťami v usporiadaní lipidových štruktúr, existujú však aj špecifické kanály pre vodu (tzv. akvaporíny). Hydrofilné molekuly, ióny, ale aj väčšie molekuly či nízkolmolekulárne polárne látky vyžadujú už špecifické transportné mechanizmy. Môže však ísť o uľahčenú difúziu cez: 1. Kanály – proteínové útvary v membráne naplnené vodou, ktorými špecificky prechádzajú rôzne katióny a anióny 2. Transportéri – špecifické miesta v membráne, kadiaľ prechádzajú látky, ktoré sa na jednej strane membrány najprv naviažu na špecifický proteín, pritom sa zmení konformácia tohto proteín, a tým je umožnené, aby látka prešla na druhú stranu membrány Pohyb látok cez membránu pri jednoduchej aj uľahčenej difúzii je určený predovšetkým koncentračným spádom. Látka je transportovaná cez membránu buď individuálne – uniportom pomocou špecifických kanálov alebo transportérov (takto je transportovaná napr. glukóza) alebo symportom, kedy sú dve rôzne látky transportované naraz jedným smerom (takto sú napr. transportované sodné ióny a glukóza do enterocytov). Vnesené Na + ióny sú potom z bunky odstránené Na + /K + ATPázovou aktivitou. Ďalšou možnosťou je antiport – cez membránu prestupujú dve látky naraz, ale v opačnom smere. Takto prebieha napr. výmena Cl - a HCO 3 - na membráne erytrocytov. Pasívny transport určuje rozdiel v koncentrácii alebo chemickom náboji na oboch stranách membrány. Látky (molekuly) môžu byť transportované aj proti koncentračnému gradientu. Tento aktívny transport vyžaduje energiu. Tá je najčastejšie získavaná hydrolýzou ATP a pohyb látok cez membránu sa realizuje rôznymi ATPázovými systémami, hovoríme o rôznych „iónových“ alebo „peptidových pumpách“ zodpovedných za nerovnomerné rozloženie iónov, resp. peptidov v extracelulárnom a intracelulárnom prostredí. Príkladom je Na + /K + ATPáza, enzým, ktorý je viazaný na plazmatickú membránu a zodpovedá za obojstranný prenos monovalentných iónov z extracelulárneho do intracelulárneho priestoru. Štruktúru tohto enzýmu tvoria dva rôzne proteínové diméry. Behom transportu sodných a draselných iónov dochádza nielen k zmene konformácie, vyžaduje sa tiež prítomnosť Mg 2+ iónov, ale musí nastať aj fosforylácia proteínu (cyklická fosforylácia a defosforylácia enzýmového komplexu). Špecifický transportný mechanizmus pre glukózu: existujú rôzne prenášače glukózy (GLUT), ktoré zaisťujú prestup glukózy z krvného riečišťa cez plazmatickú membránu; tvorí sa niekoľko štrukturálne podobných proteínov. GLUT majú rôznu afinitu ku glukóze: a) vysokú afinitu ku glukóze – cca 1 mmol/l – sú vo väčšine tkanív s relatívne stabilnou dodávkou glukózy b) nízkou afinitou pre glukózu – cca 15 mmol/l – sú v tkanivách, kde je relatívny dostatok glukózy GLUT 1a 3 sú vo väčšine buniek – majú vysokú afinitu pre glukózu (K m – 1 mmol/l). GLUT2 sú v hepatocytoch a pankrease – majú o veľa nižšiu afinitu (K m – 15-20 mmol/l). GLUT4 sú vo svalových bunkách – vstup glukózy pre tento GLUT je dej závislý na inzulíne (K m – okolo 5 mmol/l). GLUT 5 sú v črevnom epitele a ľadvinách (vstup prebieha v symporte s Na + iónmi). Poríny sú špecifické proteínové štruktúry – kanály, ktoré majú stred naplnený vodou. Nájdeme ich predovšetkým v mitochondriálnej membráne. Cez poríny sú transportované rôzne látky až do relatívnej molekulovej hmotnosti okolo 600. Exocytóza je ďalší transportný mechanizmus, pri ktorom obsah určitej látky z intracelulárneho priestoru fúziou splynie s membránou a je následne vylúčený do extracelulárneho priestoru. Deje sa tak kontinuálne alebo sa exocytóza objavuje iba v určitých časových intervaloch a je regulovaná rôznymi chemickými signálmi(je charakteristická pre pohyb látok z Golgiho aparátu do cytoplazmy). Endocytóza a fagocytóza sú transportné mechanizmy, ktoré nachádzame napr. na membráne lyzozómov, odkiaľ prechádzajú látky z cytozolu, ktoré sú následne vo vnútri lyzozómu rozštiepené. Pri tomto pohybe opäť najprv k splynutiu prenášanej látky s membránou a potom k jej uvoľneniu do vnútra tejto organely, kde začnú pôsobiť rôzne enzýmové systémy – hydrolázy pre štiepenie lipidových, sacharidových a proteínových štruktúr. Všetky tieto enzýmy pôsobia v kyslom prostredí (pH = 4,5-5,5). Viac o endo- a exocytóze je napísané v otázke IV/27. III/37. Cytoskelet. V cytoplazme eukaryotických buniek sa nachádza trojrozmerný oporný systém tvorený filamentami (vláknami). Tento cytoskelet slúži k udržaniu tvaru bunky, ukotveniu organel, transportu molekul a ich agregátov v bunke a zaisťuje pohyb bunky. Filmenta je možné rozdeliť podľa ich priemeru do 3 skupín na mikrofilamenta (5-8 nm), intermediárne (stredné, 10-12 nm, IF) a silnejšie mikrotubuly (asi 25 nm). Všetky filamenta sú polyméry zostavené z typických bielkovín a sú spojené s inými proteínmi. Aktín ako najrozšírenejší proteín eukaryotických buniek vytvára aktín mikrofilamenta (aktínové filamenta). Aktín sa vyskytuje ako monomolekulárny globulárny G-aktín alebo ako polymérny filamentózny F-aktín. G-aktín je relatívne malý asymetrický proteín (42 kDa) a môže reverzibilne polymerizovať na helikálny D- aktín. Túto zmenu podporuje ATP, pretože G-aktín nesie molekulu ATP, ktorá v F-aktíne pozvoľne hydrolyzuje na ADP. Táto ATP- ázová aktivita dáva aktínu enzymatické vlastnosti. Pretože sa jednotlivé molekuly G-aktínu radia vždy rovnakým smerom. vykazuje aj F-aktín polaritu. Na oboch jeho koncoch prebieha polymerizácia odlišnou rýchlosťou. Ak nie sú tieto konce – ako tomu je v svalových bunkách – stabilizované pomocou zvláštnych proteínov, narastá plynulo pri kritickej koncentrácií G-aktínu (+) koniec F-aktínu, pričom sa (-) koniec súčasne rozpadá (treadmilling). Pomocou mykotoxínov je možné dielčie procesy experimentálne zastaviť. Faloidin, mykotoxín z muchotrávky zelenej, brzdí tento rozpad väzbou na (-) koniec. Naopak cytochalasiny, cytostaticky pôsobiace jedy izolované z plesní, brzdia polymerizáciu väzbou na (+) koniec. V cytoplazme sa nachádza viac ako rôznych proteínov, ktoré sa špecificky viažu na G a F-aktín. Spojenie s aktínom prináša rozličné funkcie: Môže slúžiť k sledovaniu G-aktínovej hotovosti (poolu), príkladom je profilin, či ovplyvňovať polymerizačnú rýchlosť G-aktínu (villin), stabilizovať konce reťazcov F-aktínu (fragin, β-aktinin), spojovať filamenta navzájom, či s inými súčasťami bunky (villin, α-aktinin, spektrín) či narušiť helikoidálnu štruktúru F-aktínu (gelosin). Uvedené proteíny teda kontrolujú rozmanité funkcie aktínu a sú riadené proteínkinázami. Proteíny intermediárnych filament (IF) sa radia do proteínových rodín a sú tkanivovo špecifické. Typickými zástupcami sú cytokeratíny, dezmín, vimentín, kyslí fibirlárny gliaproteín (GFAP), neurofilamenta a jadrové laminy. Tieto IF proteíny majú v strednej časti stĺpcovitú základnú štruktúru označenú ako superhelix („coiled coil“). Ako diméry sa spoločne ukladajú antiparalelne k tetramérom a vzájomným prikladaním hlavíc vytvárajú protofilamenta. Osem protofilament potom tvorí jedno IF. Na rozdiel od mikrofilament a mikrotubulov sa proteínové monoméry IF v cytoplazme takmer nevyskytujú. Ich polarizáciou vznikajú stabilné nepolarizované filamenta. Tvorba IF je riadená fosfryláciou resp. defosforyláciou. Základnými stavebnými súčasťami trubicovitých mikrotubulov sú α a β-tubulín, 2 globulárne proteíny (53 a 55 kDa). Spájajú sa v α,β- heterodiméry, ktoré polymerizujú na lineárne protofilamenta a vytvárajú prstencovitý komplex rastúci vďaka ďalším polymerizáciám na dlhé trubice. Na tvorbu jedného závitu je treba 13 tubulínových dimérov. Podobne ako mikrofilamenta sú aj mikrotubuly polárne dinamické štruktúry s jedným (+) a jedným (-) koncom. Koniec (-) je často stabilizovaný väzbou na centrozóm, koniec (+) vykazuje dynamickú nestabilitu, čo znamená, že môže buď pomaly rasť alebo sa rýchlo skracovať. Dôležitú úlohu pritom hraje GTP, ktorý sa viaže na tubuliny a následne hydrolyzuje na GDP. S mikrotubulmi môžu ragovať rôzne s mikrotubulmi asociaované proteíny (MAPs) a tak riadiť ich štruktúru a funkciu. Cytoskelet zaisťuje s pomocou svojich asociačných proteínov 3 dôležité funkcie:  Vytvára mechanickú kostru bunky, ktorá jej dodáva charakteristický tvar a navzájom prepája membrány a organely. Kostra má dynamické vlastnosti; na meniace sa nároky a zmeny v životných podmienkach neustále reaguje buď ďalším rastom alebo naopak, redukciou.  Je hnacou silou pohybu živčíšnych buniek. Nie len svalové bunky, ale aj bunky nekontraktilných tkanív obsahujú rôzne motorické proteíny, s ktorých pomocou sa môžu koordinovane a cielene pohybovať. Presuny buniek, zmeny tvaru v priebehu rastu, prúdenie plazmy a delenie buniek umožňujú práve zložky cytoskeletu.  Slúži ako komunikačná štruktúra („dráha“) vo vnútri bunky. S pomocou motorických proteínov môžu organely aďalšie bielkovinové komplexy putovať pozdĺž filament. Ako príklad štruktúry a funkcie jednotlivých zložiek cytoskeletu je možné uviesť výrez bunky črevného epitelu s jej mikroklkami (obrázok vedľa). Mikrofilamenta z F-aktínu prerastajú mikroklky v súmerných zväzkoch. Navzájom sú prepojené proteínmi asociovanými s aktínom, hlavne fimbrinom a villinom. Kalmodulín spolu s myozínu podobnou ATP.ázou spojujú mikrofilamenta bočne s plazmatickou membránou. Fodrín, ďalší z mnohých proteínov asociovaných s mikrofilamentami, spája aktínové vlákna na dolnom konci a súčasne ich fixuje na plazmatickú membránu aj na sieť intermediárnych filament. V tomto prípade majú mikrofilamenta prevažne statickú funkciu. V ďalších prípadoch sa aktín podieľa na dynamických procesoch, ku ktorým radíme svalovú kontrakciu, presuny buniek. fagocytózu imunocytmi, tvorbu hrotov (spikes) a lemelopodií (bunkových výbežkov) či akrozomálnu reakciu pri prieniku spermie do vajíčka. Mikrotubuly prebiehajú paprskovito všetkými smermi z centrálnej štruktúry v blízkosti jadra – centrozómu. Na (+) konci trubicovitých mikrotubulov prebieha neustále ich rast alebo skracovanie. Naopak na (-) konci je fixovaný pomocou proteínov asociovaných s mikrotubulmi v centriole. Tiež (+) koniec môže byť asociovanými proteínmi stabilizovaný napr. v dobe, kedy mikrotubuly dosiahnu až na plazmatickú membránu. Mikrotubuly sú zúčastňujú na vytvorení vzhľadu bunky a slúžia ako vodiace štruktúry pri pohybu organel. V súčasnosti s MAP dyneínom a kinezínom môžu mikrotubuly vykonávať mechanickú prácu, napr. pri transporte mitochondrií, pohybu riasiniek (na epitelu pľúc, čreva alebo vajcovodu) či v bičíku spermie. Významnú úlohu hrajú mikrotubuly tiež behom mitotickej fázy bunkového cyklu. V nervových bunkách vytvárajú komunikačné vlákna axónov, na ktorých prebieha anterográdny transport v periférnom smere k synapsiám a retrográdny transport opačným smerom k bunkovému jadru. Ako molekulárne motory („nanomotory“) označujeme proteíny, ktoré premieňajú chemickú energiu na mechanickú. Ako energie je využívaná hydrolyzovateľná energia väzieb nukleozidtrifosfátov alebo energia chemických gradientov s cieľom získať mechanickú prácu vo forme konformačných zmien motorických proteínov. Ako molekulárne motory bolo okrem rotujúcich proteínov, ako napr. ATP-syntáza, popísané množstvo enzymatických systémov meniacich chemickú energiu na lineárnu prácu. Príkladom sú ribozomálne elongačné faktory alebo s RNA alebo DNA reagujúce enzýmy ako RNA alebo DNA-polymeráza. V cytoskelete pôsobia ako motorické proteíny myozíny, kinezíny a dyneíny. Iba tieto tri proteínové rodiny sú označované ako molekulárne motory v užšom zmysle, pretože sú zodpovedné za svalovú kontrakciu a riasinkový pohyb alebo prepravujú náklad (cargo). Pritom využívajú energiu uvoľnenú pri hydrolýze ATP, aby sa mohli s pomocou konformačných zmien pohybovať pozdĺž cytoskeletálnych filament. Uvedené transportné procesy motorických proteínov sa významne uplatňujú pri svalovej kontrakcii, delení buniek, intracelulárnom transporte carga z organel alebo iných súčastí bunky, pri endocytóze a exocytóze a ďalších procesoch. Klasickým motorom cytoskeletu je myozín obsiahnutý v svalových vláknach. Jeho polyméry zaisťujú svalovú kontrakciu vo forem spolupráce myozínového filamenta so slabším aktínovým filamentom. Celá skupina viac ako 40 nekonvenčných myozínov sa vyskytuje aj v iných než svalových bunkách. Ako jednotlivé motorické proteíny prevádzajú náklad pozdĺž aktínových filament. Myozín typu V (na obrázku) sa skladá z 2 ľahkých a 2 ťažkých reťazcov. Nekonvenčné myozíny sa podieľajú na bunkovej motilite, endocytóze, vezikulárnom transporte a cytokinéze. Kineziny, ktorých početní zástupcovia sa delia do 14 skupín, sa svojou štruktúrou myozínom. Skladajú sa z 2 ťažkých a 2 ľahkých reťazcov. Na globulárnu hlavicu oboch ťažkých reťazcov sa môže viazať ATP. Transportovaný náklad sa potom pripája s pomocou ľahkých reťazcov na opačnom konci kinezínov. Kinezíny pracujú ako jednotlivé molekuly. Transportujú svoj náklad pozdĺž mikrotubulov väčšinou smerom k (+) konci: ide o vezikuly, organely, časti mitotického aparátu, chromozómy, m RNA, bielkoviny a ďalšie bunkové komponentny. Dyneiny sa vyskytujú v 2 typoch: 1. v axonematoch buniek, ktoré sa pohybujú pomocou bičikov alebo brv (napr. pľúcny epitel, spermie), a 2. v cytoplazme. Dyneiny majú komplexnejšiu štruktúru ako kinezíny a myozíny. Tvorí ich asi 20 polypeptidov (celkom 1,5 MDa). Obe ich ťažké reťazce obsahujú plošný kruh tvorený 7 modulmi. Väzba a štiepenie ATP v tejto oblasti spôsobí pohyb na mikrotubuloch. ATPáza nesie tzv. AAA- motín (ATPáza asociovaná s rôznymi bunkovými aktivitami). Rozsah pohybu dyneinu závisí na náklade a je kontrolovaný dynaktinom a mnohými ďalšími proteínmi. Na obrázku sú ukázané obe motorické proteíny kinezín a dyneín behom transportu carga pozdĺž mikrotubulu, kinezín v smere (+) koniec na periférií bunky, dynein smerom k (-) konci v centre. Pohyb poháňa ATP. Kinezíny putujú mechanizmom ruka cez ruku pozdĺž mikrotubulu, Na jeden krok v dĺžke 8 nm je treba hydrolyzovať jednu molekulu ATP na ADP. Dĺžka kroku cytoplazmatických dyneinov závisí na náklade a pohybuje sa medzi 8-32 nm. Spotrebujú pritom jednu molekulu ATP. III/38. Kompartmentace biochemických procesů na subcelulární úrovni. V bunke často prebiehajú dvojice „opačných“ metabolických dráh, napr. oxidácia mastných kyselín a ich biosyntéza. Reakcie v oboch smeroch majú značný počet medziproduktov, ktoré vstupujú do analogických reakcií. Preferencia priebehu metabolickej dráhy v jednom smere (v závislosti na potrebe organizmu) je zaisťovaná napr. tým, že niektoré rekcie z týchto „opačných“ dráh sú v jednom smere katalyzované určitými enzýmami, ale v opačnom smere prebiehajú za katalýzy inými enzýmami, iným mechanizmom a sú rozdielne regulované. Ďalšia možnosť regulácie smeru týchto reakcií umožňuje lokalizácia príslušných enzýmov v rôznych bunkových kompártmentoch. Napr. enzýmy na katabolizmus mastných kyselín lokalizované v mitochondriách, pričom enzýmy pre biosyntézu mastných kyselín sú lokalizované v cytozole. K tomu pristupuje aj kompártmentácia najdôležitejšieho metabolitu, ktorý je obom dráham spoločný – acetylkoenzým A. Vzniká v mitochondriách, ale nemôže sa dostať voľne cez mitochondriálnu membránu do cytozolu, kde by mohol byť požitý ako substrát pre syntézu mastných kyselín. K tomu je potrebný sled ďalších reakcií, ktoré sú samozrejme tiež regulované a zaisťujú tak fyziologicky požadovanú distribúciu metabolitu. Prekážky pre prestup metabolitov (substrátov aj disociovatelných koenzýmov), vyplývajúce z ich kompártmentácie, sú často prekonávané subcelulárnou lokalizáciou enzýmov, katalyzujúcich analogické reakcie. Napr. redukované koenzýmy NAD nemôžu prechádzať cez mitochondriálnu membránu, ich prenos z cytozolu k enzýmom dýchacieho reťazca v mitochondriách je umožnený sústavou reakcií, ktorých sa zúčastňujú cytozolové aj mitochondriálne izoenzýmy malátdehydrogenázy a aspartátaminotransferázy. Regulácia toku metabolitov cez membránu ovplyvňuje jeho koncentráciu a teda aj rýchlosť enzymatickej reakcie prebiehajúcej v kompártmente. Oddelenie „opačných“ metabolických dráh je niekedy dokonca tak dôkladné, že anabolické enzýmy sú lokalizované v bunkách iných orgánov než katabolické enzýmy. Napr. tzv. ketolátky sú pri prebytku acetylkoenzýmu A syntetizované v hepatocytoch, ale využívané sú ako náhradné palivo v bunkách extrahepatálnych tkanív, napr. v mozgu alebo svaloch. Metabolity nemôžu samovoľne prechádzať membránou, preto musia využívať transportné mechanizmy. Väčšina metabolitov má na membráne svoje prenášače – pyruvát, citrát alebo malát ľahko prechádzajú membránou. Vzhľadom k tomu, že metabolity bývajú často asociované s veľkými molekulami, bolo by zbytočné transportovať celé molekuly a dochádza tak k prenosu len ich častí. V metabolizme sú významné hlavne 3 transportné systémy: karnitínový transportný systém, malát-aspartátový člunek a glycerolfosfátový člunek. Príkladom prenosu môže byť začiatok glukoneogenézy, ktorý je komplikovaný kompartmentáciou. Enzým pyruvátdehydrogenáza je prítomná iba v mitochondriách. Vzniknutý oxalacetát nemôže prejsť membránou, preto musí byť transformovaný na aspartát alebo redukovaný na malát, ktoré prejdú membránou a v cytozole sú premenné späť. IV. Základy buněčné a molekulární biologie IV/1. Principy, mechanismy a význam mezibuněčné komunikace a intracelulárních signálně- transdukčních kaskád. Funkcia ľudského tela je umožnená vďaka synchronnému riadeniu jeho jednotlivých súčastí. Detekcia signálov, výmena informácii a komunikácia prebiehajú nielen medzi extracelulárnym a intracelulárnym priestorom každej bunky, ale aj medzi jednotlivými bunkami v danej štruktúre a medzi vzdialenými anatomicky nesusediacimi tkanivami a orgánmi. Koordinácia biochemických pochodov jednotlivých buniek organizmu je zaisťovaná systémom extracelulárnej (medzibunkovej) signalizácie. Cieľom extracelulárnej signalizácie je udržanie vnútornej homeostázy v organizme, teda stavu dynamickej rovnováhy, neustále vychyľovanej pôsobením vnútorného prostredia aj vonkajších podmienok. Bunky organizmu navzájom komunikujú rôznymi spôsobmi: 1. Pomocou signálnych molekúl, špecializovaných chemických poslov, ktorých signál je v cieľových bunkách rozpoznávaný a vedie k zmene biochemických reakcii. 2. Pomocou elektrických impulzov generovaných neurónmi, ktoré v cieľových bunkách vyvolávajú zmenu transmembránového potenciálu, v ktorého dôsledku dochádza k premene elektrického signálu na chemický. 3. Pomocou tesných spojení („gap junctions“) medzibunkových kanálikov umožňujúcich priamu výmenu metabolitov a signálnych molekúl. 4. Pomocou povrchových proteínov, lokalizovaných v cytoplazmatickej membráne susedných buniek. Tieto proteíny majú komplementárne, vzájomne interagujúce extracelulárne domény. Prítomnosť alebo neprítomnosť týchto interakcii ovplyvňuje biochemické pochody v cieľových bunkách. Rôzne modality extracelulárnej komunikácie ovplyvňujú v cieľových bunkách biochemické deje, ktoré si môžeme predstaviť ako vzájomne komunikujúci systém biochemických dráh. Kľúčovú regulačnú úlohu v týchto dráhach majú enzýmy. Bunkové pochody vedúce k zmenám v aktivite, syntéze alebo degradácii enzýmov a sprostredkovávajúce tak odpoveď na extracelulárnu signalizáciu, zaisťuje intracelulárna signalizácia. V závislosti na vzdialenosti, na ktorú signálne deje v organizme môžu pôsobiť, hovoríme o medzibunkovej komunikácii systémovej a lokálnej. Systémové riadenie je vykonávané predovšetkým prostredníctvom neurohumorálneho systému, ktorý tvoria 2 vzájomne sa dopĺňajúce systémy – nervový a endokrinný. Zatiaľ čo nervový systém ovplyvňuje cieľové bunky cestou prenosu nervového vzruchu, endokrinný systém používa pre prenos signálu špecifické signálne molekuly – hormóny. Lokálna signalizácia prebieha na úrovni chemickej signalizácie (sprostredkovanej rastovými faktormi, cytokínmi, mediátormi alebo neurotransmitermi), tesných spojov a povrchových proteínov. Prenos signálu zahŕňa množstvo krokov, ktoré začínajú v bunkách vytvárajúcich signálne molekuly. Z nich je signálna molekula uvoľnená na základe nadradenej stimulácia (napr. v prípade hormónov riadených hypotalamo-hypofyziárnou osou) aleno stimuláciou senzorického systému pri zmene koncentrácie určitých molekúl v ECT (napr. glukóza, ióny, prítomnosť antigénov). Jednotlivé signálne molekuly môžu pôsobiť na rôzne vzdialenosti. Endokrinne pôsobiace signálne molekuly (predovšetkým hormóny) sú z produkujúcich buniek uvoľňované do systémovej cirkulácie a môžu pôsobiť a veľmi vzdialené bunkové populácie. Pri parakrinnej signalizácii sa signálne molekuly uvoľňujú do ECT, difundujú do okolia a ovplyvňujú rôzne typy buniek. Ak je cieľom signálnej molekuly vlastný druh buniek (alebo aj vlastná bunka), hovoríme o signalizácii autokrinnej. V cieľových bunkách obsahujú signálne molekuly špecifické receptory iniciujúce prenos signálu v intracelulárnej komunikácii (signálnej transdukcii). Pre špecifické pôsobenie signálnych molekúl je nevyhnutné, aby intracelulárna komunikácia bola indukovaná iba stimuláciu extracelulárne prijatého signálu. Nedielnou súčasťou komunikácie je teda aj degradácia signálnych molekúl, často sprostredkovaná spätnou väzbou. Výsledné pôsobenie signálnych molekúl môže zahŕňať množstvo dejov, od zmien v polarizácii bunkovej membrány alebo ovplyvnenie konkrétnych biochemických ciest cez zmeny v génovej expresii až po komplexné deje, akými sú napr. bunkový cyklus alebo apoptóza. Syntéza a uvoľňovanie signálnych molekúl podliehajú prísnej regulácii a ich výsledný účinok závisí na množstve okolností. V ľudskom organizme sa vytvárajú stovky rôznych látok so schopnosťou prenosu signálu. Podľa chemickej povahy môžeme signálne molekuly klasifikovať na :  lipofilné signálne látky – steroidné hormóny (napr. estradiol, testosteron, kortizol, aldosteron), thyroidné hormóny (thyroxin), deriváty mastných kyselín (napr. eikosanoidy), retinoidy (retinal)  peptidové a proteínové signálne látky (produkty translácie príslušných génov) – peptidové hormóny (napr. liberiny, statiny, inzulín, glukagón, vazopresín), rastové faktory a cytokíny (napr. EGF, IGF, interleukíny, interferony)  nízkomolekulové deriváty aminokyselín, syntetizované špecifickými metabolickými premenami aminokyselín - hormóny (napr. adrenalín, noradrenalín), neurotranmitery (napr. GABA, glutamát), mediátory (napr. histamín)  malé anorganické molekuly a ióny (napr. NO, CO, Ca 2+ ) Hormóny sú väčšinou definované ako chemické signálne molekuly tvorené v endokrinných orgánoch (žľazách s vnútornou sekréciou), ktoré sú distribuované v organizme krvou a na cieľové bunky pôsobia prostredníctvom väzby na špecifické receptory iniciujúce intracelulárnu odpoveď. Okre „pravých“ hormónov produkovaných endokrinnými žľazami (endokrinné hormóny) sú do rovnej skupiny často zaradené aj látky s podobnými signálnymi účinkami alebo mechanizmom pôsobenia. Medzi tieto látky patria mediátory (produkované množstvom buniek, napr. prostaglandíny alebo histamín) s parakrinným účinkom, neurohormóny a neurotransmitery (ovplyvňujúce bunky nervového systému) alebo rastové faktory a cytokíny. Rastové faktory (proteíny a glykoproteíny syntetizované prakticky všetkými bunkami v organizme) spolu s cytokínmi (prioritne secernované imunkopometentnými bunkami) dopĺňajú centrálne riadenie neurohumorálneho systému o parakrinnú reguláciu v lokálnych tkanivách. Hormóny sa vyznačujú výraznými, väčšinou vysoko špecifickými účinkami na cieľové bunky. Hormonálne regulácia ovplyvňuje väčšinu biochemických prejavov organizmu, ako je rast a diferenciácia v prenatálnom a postnatálnom období (steroidné, thyroidné hormóny), trávenie a energetický metabolizmus, napr. lokálne hormóny GIT (gastrín, cholecystokinin), inzulín, katecholamíny alebo regulácia iónovej a minerálnej homeostázy (napr. parathormón, aldosteron). Chemická štuktúra významne ovplyvňuje aj aktivitu transport, metabolizmus aj mechanizmus účinku signálnych molekúl. Silne polárne peptidové signálne molekuly a deriváty aminokyselín sú látky veľmi dobre rozpustné vo vode, ktorých distribúcia krvou a difúzia v extravazálnej tekutine prebieha po koncentračnom gradiente. Koncentrácia aktívnych molekúl týchto hormónov je orvná ich cirkulujúcej koncetrácii. Oproti tomu lipofilné molekuly steroidných a tyrodiných hormónov sú vo vode málo rozpustné a k ich transportu sú nutné transportné proteíny. Koncentrácia aktívnych molekúl lipofilných hormónov nie je v tomto prípade rovná ich absolútnej koncentrácii v krvi, ale koncentrácii voľných molekúl hormónu, ktoré tvoria malý podiel v porovnaní s množstvom cirkulujúcich molekúl na svojich proteínových nosičoch (transportéroch). Tieto bielkoviny často nie sú úplne špecifické a určitý transportný proteín môže prenášať aj viacero hormónov (napr. transkortín prenáša kortizol a progesteron, plazmatický globulín prenáša rôzne pohlavné hormóny). Štruktúra signálnych molekúl je tiež dôležitým faktorom ovplyvňujúcim ich biologický polčas (dobu, za ktorú sa ich koncentrácia v meranom kompártmente zníži na polovicu), spôsob inaktivácie a degradácie, asociaciu s ďalšími molekulami (napr. transportnými proteínmi v prípade steroidných a thyroidných hormónov) a chemickú stabilitu molekúl signálnych látok. Steroidné hormóny sú najprv v pečeni redukované a hydroxylované; následne vznikajú inaktívne zlúčeniny, ktoré musia byť pred tým, než sú močom z organizmu vylúčené, prevedené na hydrofilné komponenty (biotransformáciou). Thyroidné hormóny sú inaktivované dejodázami. Katecholamíny sú inaktivované dvomi enzýmovými cestami: transmetylázami (katechol-O- metyltransferázou, COMT) a monoaminooxidázou (MAO). Proteínové hormóny sú inaktivované cirkulujúcimi aj orgánovými peptidázamu. Pokiaľ štruktúra proteínového hormónu obsahuje aj cukornú zložku, je jeho degradácia podstatne pomalšia (pri porovnaní s hormónom, ktorý ju neobsahuje). Preto môžeme inaktívny hormón často nájsť a stanoviť v moči (napr. gonádotropíny)- V krvi aj v moči nachádzame preto rôzne metabolity hormónov. Ich stanovenie slúži často ako marker produkcie či dostatočnej koncentrácie pri laboratórnej diagnostike endokrinných porúch. Zatiaľ čo biologický polčas lipofilných hormónov odpovedá intervalu hodín až dní, polčas hydrofilných hormónov odpovedá intervalu minút až hodín a biologický polčas signálne aktívnych molekúl eikosanoidov sa pohybuje v sekundách. Rozpustnosť v polárnom, respektíve nepolárnom prostredí významne určuje vlastný metabolizmus účinku signálnych molekúl. Cytoplazmatická membrána je pre vo vode dobre rozpustné signálne molukly peptidovej povahy (oligopeptidy, peptidy, proteíny, glykoproteíny) a deriváty aminokyselín nerozpustná. Z tohto dôvodu je pre ich signalizáciu nevyhnutná prítomnosť špecifických receptorov v cytoplazmatickej membráne cieľových buniek. Naviazaním ligandu na receptor vznikne aktívny komplex zahajujúci signálne transdukčné kaskády intracelulárnej signalizácie. Tieto kaskády zahŕňajú signalizáciu tzv. druhých poslov alebo aktiváciu špecifických kináz. Cestou aktivácie druhých poslov dochádza k ovplyvneniu predovšetkým metabolických ciest v cieľových bunkách (metabotropné účinky). Aktivácia kaskád signálnych kináza slúži k prenosu špecifických signálov ovplyvňujúcich aktivitu transkripčných faktorov v bunkovom jadre a tým k regulácii génovej expresie. Naopak lipofilnej štruktúry steoridných a tyroidných hormónov a ďalších lipofilných molekúl môžu prenikať cez membránu a preto sa ich receptory nachádzajú vo vnútri bunky a lignady sa na nich viažu intracelulárne alebo dokonca až intranukleárne. Typickým výsledkom aktivácie intracelulárne vznikajúcich receptorových komplexov pre thyroidné hormóny. vitamín D. retinoidy a niektoré prostaglandíny (cestou PPAR receptory) je ovplyvnenie špecifických génov na úrovni transkripcie (ovplyvnenie génovej expresie). Receptory týchto látok majú teda funkciu ligandom kontrolovaných transkripčných faktorov. Bez ohľadu na charakter signálnych molekúl zásadný význam v prenose signáli majú ich receptory. Väzba ligandu na receptor je dynamický proces, ktorý určuje afinita ligandu k receptoru, závisiaca na disociačnej konštante (K d ): IV/2. Druhy membránových receptorů, jejich ligandy, biologický význam, příklady. Pre príjem a ďalšie šírenie signálu sú bunky vybavené receptorovými proteínmi. Väčšina z nich sú integrované do plazmatickej membrány, kde prijímajú z okolia signály a predávajú ich do vnútra bunky. Ďalšie receptory sú lokalizované v intracelulárných membránach. Receptory pre lipofilné hormóny sa dokonca nachádzajú v cytoplazme a bunkovom jadre (viac otázky IV/3). V ľudskom genóme kóduje viac než 1500 génov nejaký receptor. Väčšina extracelulárnych signálov sa viaže na receptory bunkového povrchu. Tieto receptory prenášajú signál do vnútra cieľovej bunky. Rozlišujeme tri základné typy membránových receptorov: Iónotropný receptor, Receptor viazaný na G-proteín a Enzýmotropný receptor. Membránové receptory môžeme rozdeliť na úseky s rozdielnymi funkciami. Prijímacia doména na vonkajšej strane bunky obsahuje väzobné miesta komplementárne k ligandom, ktoré ich viažu s vysokou špecifitou a väčšinou aj vysokou afinitou. Ďalšou časťou receptoru je funkčná doména, ktorá sa nachádza na vnútornej strane bunkovej membrány. Keďže je funkčná jednotka na vnútornej strane membrány oddelená od prijímacej domény membránou, musí existovať mechanizmus k prenosu signálu medzi doménami. Predpokladá sa, že rozhodujúcu úlohu pri prenose signálu hrajú konformačné zmeny. Mnohé receptory sú po väzbe lignadu dimerizované, a tak prichádzajú funkčné jednotky do vzájomného kontaktu. Iónotropný receptor je v podstate ligandom riadený iónový kanál. Slúži k rýchlemu prenosu signálu elektricky excitabilných buniek na synapsii nervových a svalových buniek. Ako ligandy pôsobia najmä neurotransmitery (napr. GABA alebo Acetylcholín). Ich otváranie a zatváranie je vlastnou signalizačnou odpoveďou. Po naviazaní nervového mediátoru sa zmení konformácia receptoru a iónový kanál sa uzavrie alebo naopak otvorí pre špecifické ióny, ktoré sa pohybujú po svojom elektrochemickom koncentračnom gradiente a dochádza k zmene membránového potenciálu. Receptor viazaný na G-proteín (GPCR) je veľká skupina receptorov, ktorých účinok sprostredkúvajú G-proteíny (viac otázka IV/5). Riadia nepriamo membránový enzým alebo iónový kanál. Receptory sú tvorené polypeptidovým reťazcom, ktorý prechádza 7-krát membránou (7-helix-receptor). Po aktivácií ligandom receptory viažu a aktivujú na vnútornej strane bunky G-proteíny, ktoré potom vymenia svoj GDP za GTP. Touto cestou sa G-proteíny uvedú do aktívneho stavu a viažu sa na enzýmy alebo iónové kanály, ktoré syntetizujú ďalšie signálne molekuly (druhý poslovia – viac v otázke IV/6). Ukončenie signálu sprevádza hydrolýza GTP späť na GDP. G-proteíny môžu na receptor pôsobiť ako aktivátory alebo inhibítory. Príkladom takéhoto komplexu G- proteínu a receptoru môže byť receptor rodopsínu a G-proteínu transducínu, ktoré sa uplatňujú pri procese videnia (viac otázka III/21). Enzymotropný receptor je tvorený polypeptidom, ktorý prechádza cez membránu iba jeden krát. Skladá sa z extracelulárnej časti receptoru s väzbovým miestom pre signálnu molekulu, transmembránového hélixu a cytoplazmatickej časti, ktorá buď obsahuje vlastnú enzymatickú aktivitu alebo je spojená s enzýmom. Receptor je buď ligandom riadený enzým alebo proteín, ktorý sa spája s enzýmom. Veľa receptorov obsahuje cytoplazmatickú časť, ktorá funguje ako tyrozínová proteínkináza. Po naviazaní signálnej molekuly sa spoja 2 receptorové proteíny a vytvoria dimér. Tým sa aktivujú tyrozínkinázové časti receptoru, ktoré fosforilujú tyrozíny (pomocou fosfátových skupín z ATP) vlastného receptoru. Fosforylované tyrozíny slúžia ako väzbové miesta pre rôzne proteíny, ktoré sa po naviazaní stávajú sami aktívnymi. Dochádza tak napr. k aktivácii signálnej molekuly Ras (G-proteín), ktorý nasledovne aktivuje. Ďalšie proteínkinázy a v konečnom dôsledku dochádza k zmene génovej expresie. Ukončenie signálu je katalyzované proteín-tyrozín-fosfatázou alebo môžu byť aktivované receptory endocytované alebo odbúravané v lyzozómoch. Na receptory s tyrozínkinázovou aktivitou sa viažu napr. rastové hormóny alebo inzulín. IV/3. Jaderné receptory, heat-shock proteiny, interakce jaderných receptorů s DNA. K lipofilným signálnym látkam pôsobiacim v bunkovom jadre radíme steroidné hormóny, kalcitriol, jodotyroníny (T 3 a T 4 ), retinové kyseliny, ale tiež metabolity lipidov. Tieto signálne látky sa viažu na intracelulárne receptory fungujúce ako ligandami riadené transkripčné faktory a s podporou ďalších proteínov kontrolujú génovú expresiu. Prechádzať membránou a vstupovať do bunky môžu len voľné, tzn. Na transportné proteíny neviazané signálne látky. V bunkovom jadre a často už v cytoplazme sa stretávajú so svojimi receptormi. Ide o proteíny, ktoré sú schopné špecificky a s vysokou afinitou viazať lipofilné látky. Touto väzbou dochádza k aktivácii receptorov, ktoré zmenou svojej konformácie získavajú schopnosť viazať sa ako diméry na kontrolné elementy DNA v promotore určitých génov, Odtiaľ potom ovplyvňujú transkripciu príslušných génov, čo znamená, že pôsobia ako transkripčné faktory. Príkladom môže byť mechanizmus účinku kortizolu, ktorý je typický tým, že komplex ligandu s receptorom vzniká už v cytoplazme. Voľný receptor sa tu nachádza ako monomer v komplexe s heat-shock proteínom (chaperonom) hsp90. Väzba kortizolu na tento komplex vyvolá alosterickú konformačnú zmenu receptoru, ktorý sa následne uvoľní od hsp90 a získa schopnosť špecifickej väzby DNA a dimerizácie, V bunkovom jadre sa dimér aktivovaného receptorového komplexu viaže na nukleotidové sekvencie označované ako HRE (hormone response element). Ide o krátke bodovo symetrické segmenty DNA (palindromy), ktorá spravidla ako posilňujúce elementy (enhancer) stimulujú transkripciu. Každý receptor rozpozná iba „svoj“ HRE a preto ovplyvní iba transkripciu týchto génov, ktoré sa nachádzajú v oblasti susediacej s týmto HRE. Vzájomné rozpoznanie receptoru a HRE sa uskutočňuje na princípe premenlivého vplyvu aminokyselinových zvyškov domén viažucich DNA a relevantných bází HRE. Receptor neinteraguje priamo s RNA- polymerázou, ale spolu s ostatnými transkripčnými faktormi s koaktivátor/mediátorovým komplexom, ktorý spracuje všetky signály a predá ich polymerázam. Touto cestou vyvolá hormón v priebehu pár minút až hodín zmenu konformácie mRNA pre kľúčové proteíny bunkových reakcií („bunková odpoveď“). Množstvo rýchlych efektov (pár sekúnd až minút) lipofilných signálov je naopak vyvolaná nie transkripčnou kontrolou, ale prostredníctvom kontroly proteínkináz a ďalších enzýmov prenosu signálu. Receptory lipofilných látok patria do proteínovej nadrodiny transkripčných faktorov. Radia sa k ním tiež receptory pre lipofilné hormóny a lipidové metabolity. Niektoré receptorové proteíny, pre ktoré nie sú známe žiadne špecifické ligandy, sa označujú ako „receptoroví sirotci“. V akútnom stave tvoria receptory diméry samy so sebou (homodiméry) alebo s inými receptormi (heterodiméry). Nukleárne receptory sú zostavené modulárne z domén rôznej dĺžky a funkcie. V smere od N k C-konci to sú transkripciu aktivujúca doména, lokalizačná sekvencia jadra a ligandy viažuca doména. Homológia receptorov je v oblasti DNA-viažucej domény veľmi veľká. Tu obsahujú proteíny na cysteín bohaté sekvencie koordinačne viazané zinkové ióny. Tieto centrá (tzv. zinkové prsty alebo zinkové clustry) domény stabilizujú a podporujú ich dimerizáciu, na väzbe DNA sa však priamo nezúčastnia. Za to zodpovedajú ako u ostatných transkripčných faktorov „rozpoznávajúce helixy“. IV/4. Amplifikace, integrace a vzájemná komunikace („cross-talk“) signálních drah. Intracelulárny prenos signálu je dej ovplyvňovaný na všetkých etážach jeho šírenia v bunke. Je nutné vziať do úvahy špecifické druhové charakteristiky rôznych buniek, odrážajúce charakter a množstvo v nich exprimovaných proteínov (determinované génovou expresiou, ale aj rýchlosťou ich špecifickej ubkvitínom aktivovanej protazomálnej degradácie) alebo aj jednotlivých protínových foriem (vznikajúcich napr. alternatívnym zostrihom). Jednotlivé „poschodia“ intracelulárnej signalizácie umožňujú jeho variabilné šírenie v závislosti na aktuálnej dostupnosti transdukčných komponent v signálnych dráhach. Niektoré signálne cesty majú vysokú linearitu – prenos signálu zahŕňa malý počet prenosných elementov, je veľmi cielený – napr. signálne cesty JAK/STAT. Iné cesty umožňujú konvergenciu rôznych signálov v smere ovplyvnenia veľkého množstva intracelulárnych dejov. Následná divergencia na úrovni adaptorových molekúl a transdukčných proteínov umožňuje v bunky vyvolať bunkovú odpoveď podľa jej aktuálneho stavu, ktorý sa prejavuje konkrétnym proteínovým zložením (alebo aktivitou) transdukčných komponent. Cesty signálnej transdukcie spolu tiež vzájomne komunikujú. Aplikovať by sa to dalo na príklade inzulínovej signalizácie v bunkách periférnych tkanív. inzulín pôsobí na bunky prostredníctvom inzulínového receptora (INSR). Inzulínový receptor je heterotetremér tvorený 2 extracelulárnymi α- podjednotkamy, ktoré sú disulfidickými mostíkmi spojené s 2 transmembránovými β-podjednotkami. β-podjednotky majú tyrozinkinázovú aktivitu, ktorá je aktivovaná interakciou ligandu (inzulínu) s receptorom. Po aktivácií môže dôjsťk prenosu signálu 2 cestami podľa dostupnosti transdukčných modulov:  cesta MAP-kináz – facilitovaná aktiváciou Ras/Raf  cesta PKB/AKT – stimulovaná prenosom signálu cestou signálne transdukčného proteínu IRS1 (insulin receptor substrate) Výsledok aktivácie inzulínového receptoru závisí aj za fyziologických podmienok na type stimulovanej bunky a prítomnosti molekúl ovplyvňujúcich signálnu kaskádu receptoru (signalizácia TNF, množstvo intracelulárnych substrátov – deoxynukleotidtrifosfátov, ATP,...). Priamym metabotropným účinkom inzulínového receptoru je postprandiálny presun glukózy do tkanív s vysokou utilizačnou kapacitou (svaly, adipocyty, hepatocyty) aktiváciou inzulín- dependentných transportérov. Dochádza aj k aktivácií metabolických ciest umožňujúcich tvorbu energetických zásob a zvyšujúcich anabolické deje. V hepatocytoch a svalových bunkách dochádza k aktivácií syntézy glykogénu a glykolýzy a inhibícií glykogenolýzy a glukoneogenézy. V adipocytoch sa aktivuje syntéza mastných kyselín a inhibícia lipolýzy a β- oxidácie. Pôsobením inzulínu sa znižuje koncentrácia cAMP, pričom glukagón a katecholamíny zvyšujú koncentráciu cAMP. Po stimulácií inzulínového receptoru nastáva tiež prorůstová stimulace (závislá na ďalších promitotických rastových faktoroch a stavebných a energetických substrátoch. IV/5. G-proteiny − struktura, aktivace, funkce. Proteíny viažuce GTP fungujú ako molekulárne vypínače. Dajú sa rozdeliť do dvoch skupín: veľké heterotrimérne proteíny viažuce GTP (tzv. G-proteíny), ktoré prenášajú signály z receptorov viazaných na G-proteín (viac otázka IV/2); a malé monomérne GTPázy, ktoré sa podieľajú na prenose signálu z ostatných povrchových bunkových receptorov. K druhej skupine radíme Ras, Ras-podobné GTP-ázy a členov rodiny Rho. Obe formy proteínov viažucich GTP pôsobia tiež ako riadiace elementy bunkového transportu, translácie a bunkového delenia. Ak dôjde k naviazaniu GTP, aktivujú sa G-proteíny a začnú vysielať signály. Keďže G-proteíny vykazujú vnútornú GTPázovú aktivitu, pozvoľna hydrolyzujú naviazaný GTP na GDP, čo ma za následok ich deaktiváciu. Potom prechádzajú G- proteíny vo forme komplexu s GDP do kľudového stavu. GTPázová aktivita môže byť stimulovaná proteínmi aktivujúcimi GTPázu (napr. GAP, alebo RGA pre regulátor G-proteínovej signalizácie). Pre nové zapnutie musia G-proteíny vymeniť svoj GDP za GTP pôvodom z cytoplazmy. Stane sa tak pomocou guaninnukleotidových výmenných faktorov (GEF). Veľké G-proteíny prenášajú signály z receptorov spojených s G-proteínom (GPCR, 7-helix-receptory) na membránové enzýmy alebo iónové kanály. Ide o heterotriméry zložené z troch rôznych podjednotiek (α, β a γ). Podjednotka α je schopná viazať GDP alebo GTP (preto sa označuje ako G-proteín) a chovať sa ako GTPáza. Prenos signálu prebieha v nasledujúcich krokoch: 1. V kľudovom stave nesu G-proteíny GDP. Ako náhle dôjde naviazaním signálnej molekuly k podráždeniu, receptor zmení konformáciu tak, že sa fixuje na vnútornú stranu príslušného G-proteínu. To stimuluje α-podjednotku G-proteínu k výmene naviazaného GDP za GTP. G- proteín sa potom z receptoru uvoľní a rozpadne sa na zložky α a βγ. Pokiaľ viaže receptor svoj ligand, môžu byť aktivované ďalšie G-proteíny. 2. Zložky G-proteínu sa viažu na ďalšie membránové proteíny a menia ich aktivitu: otvárajú a zatvárajú iónové kanály, aktivujú alebo inaktivujú sa enzýmy. Tak napr. aktívna α-podjednotka G-proteínu vyvolá svojou väzbou na adenylátcyklázu pri β-katecholaminového receptoru enzymatickou tvorbu druhého posla – cAMP. Ten stimuluje proteínkinázu A, ktorá následne aktivuje alebo inaktivuje ďalšie proteíny. 3. Vnútorná GTPázová aktivita α-podjednotky hydrolyzuje behom sekúnd až minút viazaný GTP a GDP a ukončí vplyv G- proteínu na adenylátcyklázu. Na tejto reakcií sa zúčastňujú aj pomocné bielkoviny (regulátory G-proteínovej signalizácie, RGS = GAP). 4. Jednotka βγ proteínu G môže stimulovať proteínkinázu (βARK) k fosforilácií receptoru. Tím dôjde k redukcii jeho afinity k hormónu a väzbe blokujúceho proteínu arestínu. 5. Patobiochémia: G-proteíny G S a G I sú terčom bakteriálnych toxínov. Cholerový toxín je enzým, ktorý produkuje patogénna črevná baktéria Vibrio cholerae, ktorý vniká do buniek črevného epitelu. Tu prenáša ADP-ribózu z NAD na α- podjednotku G S , čím blokuje jej GTPázovú aktivitu . Trvalo zvýšená hladina cAMP má za následok veľké straty vod& a iónov Cl - (vzniká tak průjem). Pertussový toxín baktérie Bordetella pertussis, spôsobujúci dáviaci kašeľ, katalyzuje ribozyláciu ADP α-podjednotky G I , čim zabráni interakcii s GPCR. Následkom je strata inhibujúceho vplyvu G I . Podľa účinku môžeme rozlíšiť niekoľko druhov G-proteínov. Najviac rozšírené sú stimulačné G-proteíny (G S ), ktoré aktivujú adenylátcyklázy alebo ovplyvňujú iónové kanály. Inhibičné G-proteíny (G I ) tlmia adenylátcyklázu, G-proteíny patriace do rodiny G q aktivujú fosfolipázu C-β. IV/6. Typy a úloha druhých poslů v přenosu signálu. Druhý posol („second messenger“) je označenie intracelulárnych chemických signálov, ktorých koncentrácia je kontrolovaná extracelulárnymi signálmi ako sú napr. hormóny, neurotransmitery a iné (dajú sa označiť ako prvý poslovia). Vznikajú z ľahko dosiahnuteľných substrátov a majú len krátky biologický polčas. Za najdôležitejšie druhé posli sa považujú cAMP, cGMP, inozitoltrifosfát (InsP 3 ), diacylglycerol (DAG), kalciové ióny (Ca 2+ ) a oxid dusnatý (NO). cAMP je prvý popísaný druhý posol. Bolo zistené, že sa zúčastňuje ako signálna látka metabolizmu glykogénu. Nukleotid cAMP (3 ́,5 ́-cykloadenozínmonofosfát) sa tvorí na vnútornej strane plazmatickej membrány za účasti na nich viazaných adenylátcykláz. Ide o rodinu enzýmov cyklizujúcich ATP po odštiepení difosfátu (PP i ) na cAMP. Štiepenie cAMP na AMP je následkom hydrolýzy a je katalyzované cAMP-špecifickými fosfodieseterázami. Účinok enzýmu sa prejaví v rýchlej inaktivácii cAMP a trvalom znížení jeho hladiny. Metylxantíny, ako napr. kofeín, môžu tento enzým potlačiť. Inzulín naopak aktivuje fosfodiesterázu, a tak znižuje hladinu cAMP. Aktuálna koncentrácia cAMP závisí predovšetkým na aktivite adenylcykláz. Je kontrolovaná G-proteínmi riadenými prostredníctvom receptorov viazaných na G-proteín extracelulárnými signálmi. Tuto reakciu stimuluje G s a inhibuje G i . Niektoré adenylátcyklázy sú tiež aktivované komplexom Ca 2+ s kalmodulínom. Zlúčenina cAMP pôsobí ako alosterický efektor proteínkináz A (PK-A). Ukladá sa na regulačné podjednotky enzymu čím spôsobí konformačnú zmenu, ktoré vedie k uvoľneniu aktívneho enzýmu. Väčšina jeho účinkov je sprostredkovaná práve PK- A. V olfaktorických neurónoch sa cAMP priamo zúčastňuje riadenia iónových kanálov. Príklady účinkov hormónov sprostredkovaných cAMP sú zobrazené v tabuľke vedľa. cGMP pôsobí analogicky ako cAMP, ale u cicavcoch nemá rovnaký význam ako cAMP. cGMP je tvorený z GT proteínom guanylátcyklázou, ktorej aktivita je stimulovaná napr. átriovým natriuretickým peptidom (ANP). cGMP aktivuje proteínkinázu G (cGMP-dependentná proteinkináza), ktorá fosforyluje cieľové proteíny. Signálne účinky cGMP sa využíva napr. v sietnici pri procese videnia (viac otázka III/21) alebo stimuluje bunky hladkej svaloviny kavernóznych telies penisu v procese erekcie. Inozitol-1,4,5-trifosfát (InsP 3 ) a diacylglycerol (DAG) sú druhí poslovia, ktorí nevznikajú z nukleotidov, ale z membránových lipidov. Najprv dochádza prostredníctvom G-proteínu typu G q k aktivácii fosfolipázy C-β (PLC-β) viazané na membráne. Tento enzým vytvorí hydrolýzou dvojnásobne fosforilovaného membránového fosfolipidu fosfatidylinozitolbisfosfátu (PIP 2 alebo PtdInsP 2 ) dva typy druhých poslov, a teda hydrofilný inzitol-1,4,5-trifosfát (InsP 3 ) a hydróbny diacylglycerol (DAG). InsP 3 putuje cytozolom k endoplazmatickému retikulu (ER) a otvorí na ňom InsP 3 -ridené kanály pre Ca 2+ prepúšťajúci Ca 2+ zo zásob v ER do cytoplazmy. Následkom je okamžité zvýšenie intracelulárnej hladiny vápniku. Samostatný vápnik má tiež účinky druhého posla (viz nižšie). Pôsobenie InsP 3 môže byť ukončené nasledujúcimi procesmi: 1. InsP 3 je defosforilovaný špecifickou fosfatázou na InsP 2 2. InsP 3 je fosforilovaný špeciálnou kinázou na InsP 4 3. Hladina Ca 2+ je účinkom púmp opäť znížená Lipofilný DAG zostáva na rozdiel od InsP 3 v membráne a môže sa tu aktivovať proteínkinázy typu C (PK-C), ktoré fosforylujú za prítomnosti Ca 2+ určité proteíny a tým predávajú signál ďalej. Hydrolýzou DAG vzniká tiež kyselina arachidónová, ktorá sa chová sama ako signálna molekula a dáva vznik eikosanoidom. Látky, ktoré produkujú InsP 3 a DAG po aktivácii PLC sú uvedené v tabuľke vedľa. Fosfatidylinozitol-3,4,5-trifosfát (PIP 3 alebo PtdIns(3,4,5)P 3 ) je syntetizovaný fosforiláciou PIP 2 enzýmom foasfatidylinozitol- 3-kinázou (PI3K). Zostáva viazaný na vnútornej strane bunkovej membrány a tu aktivuje fosfatidylinositol-dependentnú kinázu 1 (PDK1), ktorá fosforyluje (a tým aj aktivuje) proteínkinázu B. Proteínkináza B (PKB) fosforyluje ptoteíny regulujúce proliferáciu, bunkový cyklus a apoptózu. Medzi signálne látky patria aj ióny Ca 2+ . Ich koncentrácia v cytoplazme je za normálnych okolností veľmi nízka(10-100 nmol.l -1 ), pretože ju na tejto úrovni udržujú Ca 2+ -pumpy a látky zodpovedné za výmenu Na + /Ca + . Naviac vápnik viaže veľa proteínov a organel cytoplazmy a fungujú tak ako pufry Ca 2+ . Určité signály (napr. akčný potenciál, mechanický ťah alebo druhí poslovia – cAMP alebo InsP 3 ) môžu vyvolať okamžitý vzostup koncentrácie Ca 2+ v cytoplazme až na 500-100 nmol.l -1 , ak otvoria Ca 2+ -kanály v cytoplazmatickej membráne alebo membránach endoplazmatického alebo sarkoplazmatického retikula. Tiež rastlinný alkaloid ryanoid experimentálne ovplyvní určitý druh kanálu v ER. Fyziologickými ligandami ryanoidového receptoru sú kalciové kanály typu L v plazmatickej membráne alebo ióny Ca 2+ zosilňujúce kalciový signál. Otvorením Ca 2+ -kanálov vzrastie hladina Ca 2+ vždy len na krátku dobu (tzv. Ca 2+ -spikes) a vznikajú preto oscilácie Ca 2+ . Zvýšením intenzity externého signálu totiž nevzrastie výška, ale frekvencia kmitov(spikes). Dlhodobé zvýšenie koncentrácie v cytoplazmatickej membráne Ca 2+ pôsobí cytotoxicky. Biochemické účinky Ca 2+ v cytoplazme sú sprostredkované špeciálnymi proteínmi viažucimi Ca 2+ (tzv. kalciové senzory, medzi ktoré patrí kalmodulín, annexíny a svalový tropín C. Z nich najdôležitejší kalmodulín, relatívne malý proteín (17kDa) vyskytujúce sa v živočíšnych bunkách. Naviazaním 4 iónov Ca 2+ sa z neho stane všestranný riadiaci element. Následkom drastickej konformačnej zmeny vstupuje Ca 2+ -kalmodulín do vzájomného vzťahu s inými proteínmi a mení ich vlastnosti. Prostredníctvom tohto mechanizmu riadia ióny Ca 2+ aktivitu enzýmov, iónových púmp a zložiek cytoskeletu. V niektorých prípadoch je kalmodulín trvalou súčasťou regulovanej bielkoviny. Ako druhý posol funguje aj oxid dusnatý (NO), o ktorom je viac napísané samostatne v otázke IV/10. IV/7. Mechanismus a význam reverzibilní fosforylace v signální transdukci. Fosforylácia patri medzi úpravy proteínov (ide o esterifikáciu fosfátovou skupinou) a je často využívaným mechanizmom k riadeniu aktivity, štruktúry a lokalizácie proteínu. Vloženie negatívnych nábojov spolu s fosfátovým zvyškom spôsobuje v mnohých prípadoch konformačnú zmenu. Naviac môže fosforylovaná oblasť vytvoriť nové väzbové miesto pre iné proteíny, napr. molekuly s doménou SH2. Proteíny môžu byť fosforylované na zvyškoch serínu, treonínu a menej často aj tyrozínu. Enzýmy, ktoré môžu tieto zvyšky za pomoci ATP fosforylovať, sa nazývajú proteínkinázy (PK). V ľudskom genóme existuje viac ako 500 génov pre PK, ktoré fosforylujú asi 1/3 všetkých bielkovín. K reverzibilnej regulácii proteínov tiež dôležité odstraňovanie fosfátových skupín. Zaňho zodpovedajú proteínfosfatázy (presnejšie fosfoproteínfosfatázy; PP), pre ktorých obsahuje genóm okolo 200 rôznych génov. Pomocou PK a PP dochádzav bunke k reverzibilnému vypínaniu a zapínaniu proteínov. Aktivita PK a PP je preto prísne kontrolovaná. Proteínkinázy (PK) delíme podľa fosforylovaného zvyšku. Medzi PK predstavujú najväčšiu skupinu serín/treonín-špecifické PK. Podieľajú sa na prenose signálu v cytoplazme a bežne sa označujú podľa svojho aktivátora. Ďaleko menšiu skupinu tvoria tyrozín-špecifické PK. Okrem nich existujú aj tzv. nereceptorové tyrozínkinázy regulované fosforyláciou alebo defosforyláciou. Niektoré PK môžu vedľa Ser/Thr fosforylovať aj Tyr (tzv. PK s dvojitou špecifitou). Analogicky sa rozdeľujú aj PP. Proteíny môžu byť fosforylované na niekoľkých aminokyselinových zvyškoch súčasne. Niektoré PK fosforylujú samy seba(autof osforylácia) asú tak trvalo aktivované. Proteínkináza A (PK-A) sú prvé popísané proteínkinázy, ide o proetínkinázy závislé na cAMP. PK-A sprostredkovávajú účinok druhého posla cAMP. Enzýmy patriace do rodiny PK-A sú v neaktívnom stave k dispozícii ako heterotetraméry (C 2 R 2 ), ktorých katalytické podjednotky (C) sú blokované regulačnými podjednotkami (R) – autoinhibícia. Ak dôjde k väzbe cAMP na regulačné jednotky, jednotky C a R sa navzájom oddelia a enzymaticky sa aktivujú. Úplnej aktivácii PK-A sú potrebné celkom štyri molekuly cAMP. Aktívne PK-A fosforyluje zvyšky serínu a treonínu z viac ako 100 rôznych proteínových substrátov. Týmto spôsobom je riadená aktivita enzýmov , transkripčných faktorov a iónových kanálov. Viacero účinkov cAMP sa prejavuje pri kontrole transkripcie. Gény kontrolované cAMP obsahujú v svojej regulačnej oblasti cAMP-response element (CRE), na ktorý sa môže naviazať proteín viažuci CRE (CREBP), keď je fosforylovaný PK-A a tým aktivovaný jeho transkripčný faktor. Proteínkináza C je závislá na Ca 2+ , preto sa označuje ako PK-C. Je uložená v cytoplazme ako neaktívny enzým a aktivuje ju ako druhý posol InsP 3 spoločne s DAG Vplyvom InsP 3 totiž dôjde k zvýšeniu intraceluluárnej koncentrácie Ca 2+ a DAG v membráne poslúži ako miesto napojenia. K aktivácii PK-C dochádza až na membráne po väzbe na Ca 2+ - fosfolipidové komplexy. Množstvo jej substrátov ja značné. Niektoré PK sú integrálne membránové proteíny, ktoré sú aktivované z vonka extracelulárnymi signálnymi molekulami ako sú napr. inzulín alebo epidermálny rastový faktor (tzv. receptorové tyrozínkinázy). K deregulácii proteínkináz dochádza hlavne pri rakovine a preto sa na ních zameriava medikamentózna liečba nádorov. IV/8. Signalizace stimulovaná růstovými faktory (MAPK, PKB/AKT) a cytokiny (JAK-STAT). Molekuly rastových faktorov sú polypeptidy alebo malé peptidy syntetizované v bunkách mnohých tkanív, medzi nich patrí napr. epidermálny rastový faktor (EGF), inzulínu podobné rastovéfaktory (IGFs) alebo nervový rastový faktor (NGF). Na rozdiel od hormónov je ich signálny dosah väčšinou obmedzený na okrsok tkaniva, kde vznikajú (parakrinné pôsobenie). Rastové faktory neslúžia však iba ako pozitívne signály pre rast buniek, ale ich signalizácia je nevyhnutná aj pre zahájenie bunkového cyklu (mitogény). Prítomnosť a aktivita rastových faktorov je do určitej miery všeobecnou podmienkou „prežívania“ buniek v tkanivách (tzv. survival faktory). Okrem týchto funkcií môžu rastové faktory ovplyvňovať aj bunkový metabolizmu (trofické alebo metabotrofické faktory) či bunkovú diferenciáciu (diferenciačné faktory). Rastové faktory sa s vysokou afinitou viažu na ligand viažucu extracelulárnu doménu receptorov pre rastové faktory. Receptory pre rastové faktory sú transmembránové molekuly. Aj napriek rozdielnej štruktúre jednotlivých receptorov rastových faktorov je ich výstavbový plán podobný: na vonkajšej strane cytoplazmetickej membrány sa nachádza (často bohato glykosylovaná) extracelulárna časť obsahujúca ligand viažucu doménu. Cytoplazmatickou membránou preniká transmembránová doména bohatá na nepolárne aminokyseliny, ktorá pokračuje vo vnútri bunky intracelulárnou doménou. Ligandom aktivovaný receptor vytvorí homo- alebo heterodiméry s ďalším aktivovaným receptorom. Intracelulárna doména receptorov má tyrozínkinázovú aktivitu, ktorá po naviazaní ligandu a tým vyvolanej zmene konformácie proteínovej molekuly spôsobuje autofosforyláciu tyrozínových zvyškov C-koncových domén dimerizovaných receptorov. Za fyziologických okolností sú receptory s naviazaným rastovým faktorom rýchlo inaktivované (napr. sú presunuté endocytózou do vnútra bunky a sú tu degradované). Aktivovaný receptor je schopný interagovať s množstvom cytoplazmatických bielkovín stojacich na počiatku signálno- transdukčných ciest (MAP-kinázy, cAMP a iné). Medzi dôležité proteíny vyskytujúce sa v priamom kontakte s aktivovanými receptormi patria produkty onkogénov z rodiny Ras (p21 Ras ). Členovia rodiny Ras patria medzi malé GTPázy, ktorých mechanizmus účinku je podobný ako v prípade α-podjednotiek G-proteínov. Ras proteíny sú GTP.viažúce bielkoviny asociujúce s aktivovanými receptormi pre rastové faktor. Táto asociácia má za následok zmenu GDP za GTP v molekule Ras. Ras[GTP] – signálne aktívna forma Ras proteínu – umožňuje naviazanie a autofosforylačnú aktiváciu prvej z kaskád kináz, proteínu Raf. Molekula Ras obsahuje GTPázovú doménu, ktorá hydrolyticky štiepi GTP na GDP+P i , tým inaktivuje molekulu Ras proteínu za vzniku signálne neaktívnej Ras[GDP]. Medzitým je však už mitotický signál predávaný v intracelulárnom prostredí a postupnou fosforyláciou ďalších proteinkináz signálnej kaskády amplifikovaný. Ras proteíny sú multifunkčné signálne molekuly, ktoré môžu byť aktivované širokým spektrom signálnych ciest; samé aktivujú množstvo efektorových molekúl. Signálna aktivita rastových faktorov má často stimulačný účinok na bunkový cyklus. Jeho zahájenie je však podmienené výraznými zmenami v génovej expresii a preto signál zo stimulovaných receptorov pre rastové faktory musí prekonať vzdialenosť z perimembránového priestoru až do bunkového jadra. K prenosu signáli na takto veľkú vzdialenosť a jeho amplifikácii slúži signálna kaskáda zložená zo špecifických proteinkináz, v ktorej aktivované molekuly proteinkináz následne aktivujú ďalšie signálne proteinkinázy. Túto signálnu kaskádu tvoria zástupci rozsiahlej rodiny proteinkináz – mitogény aktivovaných proteinkináz (MAPK). Aktivácia Ras proteínov je jednou zo základných ciest aktivácie kaskády MAPK. Signálne kaskáda MAPK väčšinou zhŕňa 3 stupne. Prvým je úvodná autofosforylácia Raf. Raf kináza následne fosforyluje kinázu MEK (MAP a ERK kináza), ktorej susbstrátom je ERK (extracelulárne regulovaná kináza). Koncové kináza MAP-kinázové kaskády (napr. ERK) po fosforylačnej aktivácií dimerizujú a v tejto podobe sú translokované do bunkového jadra, kde fosforylujú transkripčné faktory (napr. Elk-1, Ets-2) a tým ovplyvňujú expresiu množstva génov (často ďalších transkripčných faktorov, napr. Jun, Fos). Podobne ako rastové faktory sú cytokíny (napr. interleukiny, erytropoetín, interferóny) polypeptidové a proteínové signálne molekuly predovšetkým s parakrinným dosahom účinku, produkované v množstve tkanív. Pôvodne boli objavené ako produkty buniek hemtopoetického systému, avšak dnes vieme, že ich syntéza prebieha aj v množstve nehematopoetických tkanív (napr. erytropetín je syntetizovaný v ľadvinách a pečeni). Cytokíny sa viažu na cytokínové receptory bez tyrozínkinázovej aktivity. Väzba cytokínu na cytokínový receptor indukuje jeho konformačnú zmenu a dimerizáciu. V tejto aktívnej podobe s receptorom kolokalizuje molekula nereceptorovej tyrozínkinázy JAK. Bezprostredne po tejto väzbe Jak kinázy fosforylujú cytokínový receptor. Táto fosforylácia umožňuje naviazanie proteínov z rodina STAT (signal transducers and activators of transcription). STAT proteíny sú transkripčné faktory priamo aktivované aktívnym cytokínovým receptorovým komplexom. Po väzbe STAT nafosforylovaný cytokínový receptor sú fosforylované JAK kinázami. Fosforylácia indukuje v STAT proteínoch konformačné zmeny umožňujúce ich disociáciu z komplexu a dimerizáciu. V podobe homo- a heterodimérov sú translokované do bunkového jadra, kde špecificky ovplyvňujú génovú expresiu. DNA-viažuca doména aktivovaných STAT proteínov sa viaže do promotorových oblastí obsahujúcich STAT- responzibilný element. Signálna aktivita STAT proteínov je veľmi pestrá. Podľa typu STAT proteínov a druhu buniek ovplyvňujú proteíny STAT génovú expresiu génov zúčastnených v regulácií imunitnej odpovedi, delení buniek alebo ich diferenciácií. IV/9. Signální dráhy závislé na proteolýze, příklady. Signální úloha HIF v odpovědi na hypoxii. Okrem zmien receptorových molekúl indukovaných ligandami, ako sú kovalentné modifikácie (fosforylácia) alebo iné zmeny konformácie receptorovej molekuly, sa vo viacerých bunkách stretávame s ďalším mechanizmom aktivácie signálnych ciest, ktorý zahŕňa regulovanú intramembránovú proteolýzu. V rámci tejto signalizácie dochádza po stimulácií receptorovej molekuly k proteolytickému štiepeniu receptorového polypeptidu, kedy sa uvoľňuje intracelulárna časť molekuly, ktorá po translokácií do bunkového jadra špecificky ovplyvňuje génovú expresiu. Medzi tieto receptory patrí napr. skupina receptorov z rodiny Notch (regulácia diferenciácie). Ďalším zástupcom tejto skupiny je sterol regulatory binding protein (SREBP). Tento receptor je asociovaný s membránou endoplazmatického retikula a bunkového jadra a jeho proteolýza je aktivovaná nedostatkom cholesterolu v bunke. Po proteolytickom štiepení SREBP dochádza k translokácií odštiepenej časti (majúcej charakter bHLH transkripčných faktorov) do bunkového jadra, kde asociuje so sterol responzibilným elementom (SRE), nachádzajúcim sa v promotoroch génov ovplyvňujúcich steroídny metabolizmus (napr. receptor pre LDL). Intramembránová proteolýza vedie aj k aktivácií adhezívnych molekúl E-kadherínu, regulujúcich predovšetkým embryonálny vývoj a diferenciáciu epitelových buniek. Skupina proteínov Hedgehog (Hh) zahŕňa diferenciačné molekuly podieľajúce sa na riadení embryonálneho vývoja. Tieto malé sekrečné molekuly sa viažu na membránový receptorový komplex, zložený hlavne z proteínov Patched, Smoothead (Smo) a Hh- interacting protein (HhIP). Po naviazaní Hh proteínu na receptorový komplex do cytoplazme, kde tento proteín modifikuje aktivitu transkripčných faktorov z rodiny glioma-associated oncogene (GLI). Aktivované GLI proteíny sa následne translokujú do bunkového jadra, kde regulujú génovú expresiu. Signalizácia pomocou Hedgehog proteínov reprezentuje fylogeneticky starú signálnú dráhu. Jej význam spočíva nielen v embryonálnom vývoji (hlavne nervovej sústavy), ale aj pri vzniku nádorových ochorení. Rodina Wnt (vint) proteínov zahŕňa rozsiahlu skupinu sekréčnych glykoproteínov, ktoré sú podobne ako rastové faktory secernované širokou škálou buniek. Hlavnou úlohou Wnt proteínov je regulácia embryonálneho vývoja a bunkovej diferenciácie. Rôzne Wnt proteíny sa viažu na transmembránový receptor Frizzled, ktorého úlohou je regulácia komplexu proteínov obsahujúcich proteín β-katenín. Za nestimulovaného stavu je β-katenin v komplexe väzobných partnerov zahŕňajúcich GSK3 (glykogen synthase kinase 3) týmto proteínom fosforylovaný a po fosforylácií degradovaný ubikivtínom aktivovanou proteasomálnou degradáciou. Stimulácia Frizzled receptoru Wnt ligandom aktivuje cytoplazmaticky lokalizovaný proteín Dishevelled (Dsh), ktorý inhibuje fosforyláciu β-kateninu a umožňuje jeho uvoľnenie z deštrkčného komplexu a následnou translokáciou do bunkového jadra, kde β-katenin pôsobí ako transkripčný koaktivátor (napr. pre transkripčné faktory z rodiny TCR). Táto signalizácia je porušená pri väčšine kolorektálnych karcinómov. Významný podiel na tom nesie hlavne inaktivácia proteínu APC (adenomatous polyposis coli), ktorý sa vyskytuje v deštrukčnom komplexe β-kateninu a podporuje jeho fosforyláciu a následnú degradáciu. Dedičné mutácie v tumorsupresorovom géne APC sú podstatou hereditárneho nádorového ochorenia familiárnej adenomatóznej polypózy (FAP). Pri zvýšenej spotrebe alebo zníženom dodaní kyslíku sa zásobenie kyslíkom udržuje pomocou mnohých fyziologických a biochemických procesov. Aktuálny nedostatok kyslíku môže byť úplne alebo čiastočne kompenzovaný. Pľúca zvýšia príjem kyslíku zvýšením dychovej frekvencie a dychového objemu. Súčasne sa zvýši tepová frekvencia srdca a zosilní sa kontrakcia, takže sa zvýši objem krvi prečerpávaný za jednotku času. Alosterické efektory hemoglobínu ako 2,3- bisfosfoglycerát zaistia, že erytrocyty zvýšia uvoľňovanie kyslíku do tkanív. Pri dlhotrvajúcej hypoxií sa účinkom hormónov, ako je erytropoetín (Epo) zvyšuje aj počet erytrocytov (hematokrit). Dne sú známe aj mechanizmy, ktoré pri hypoxií zmenia metabolizmus telesných buniek. Hlavnú úlohu pri tom majú transkripčné faktory označované ako hypoxiou indukované faktory (HIF). Najlepšie je preskúmaný HIF-1α. Viaže sa na DNA a prostredníctvom mediátoru CBP/p300 zosilňuje transkripciu génov, ktorých produkty sú potrebné pri hypoxií. Patria k nim viaceré enzýmy glykolýzy a ďalších metabolických dráh, ale tiež hormón Epo, ktorý zvyšuje erytropoézu, a rastové faktory, ktoré dlhodobo zlepšujú cievne zásobenie tkaniva. Mechanizmus, ktorý zaisťuje aktivitu HIF-1α iba pri hypoxií bol už popísaný: pri normálnom zásobení kyslíkom (normoxia) sú prolínové a asparaginové zvyšky HIF-1α hydrxylované prolyl- a asparagylhydroxylázami (1). Na hydroxylovaný proteín sa potom viažu bielkoviny VHL a vzniknutý komplex je odbúravaný v proteazóme. Pri nedostatku kyslíku (hypoxia) sa hydroxylácia zastaví a HIF-1α môže spolu s HIF-1β vytvoriť aktívny transkripčný faktor. IV/10. Signalizace využívající NO, medicínský význam. Oxid dusnatý (NO) je veľmi reaktívna molekula s krátkym polčasom (niekoľko sekúnd). Je produkovaný v bunkách mnohých tkanív skupinou enzýmov, ktoré nazývame NO-syntázy (NOS). Molekuly NOS sú komplexné proteíny obsahujúce viacero kofaktorov a prostetických skupín (FMN, FAD, nehemové Fe, tetrahydrobiopterín, Hem), katalyzujúce produkciu NO z arginínu za prítomnosti NADPH+H + a O 2 . Niektoré z izoforiem NOS sú aktivované Ca 2+ (neuronálna NOS – nNOS/NOS1; endotelová NOS – eNOS/NOS2), ale jedna z izoforiem (inducibílna NOS – nNOS), exprimovaná bunkami imuniteného systému a endotelovými bunkami, je Ca 2+ independentná. Mechanizmus pôsobenia NO je rôznorodý. Intracelulárna produkcia NO môže stimulovať guanylátcyklázu. V dôsledku vzniku cGMP dochádza k aktivácii zvláštnej proteínkinázy (PK-G) a následne napr. k relaxácií hladkej svaloviny steny ciev, čo spôsobuje vazodilatáciu. Podobný účinok na cievnu stenu má aj atriálny natriuretický peptid (ANP), ktorý však spôsobí priamu stimuláciu guanylátcyklázovej aktivity ANP-receptoru. NO ako veľmi reaktívna zlúčenina môže vstupovať do rekcií s aminokyselinami v bielkovinách za vzniku ich nitrozilovaných derivátov. Nitrozilácia proteínov je jeden z mechanizmov ich regulácie (podobne ako fosforylácia ovplyvňuje aktivitu niektorých proteínov v zmysle aktivácie/inaktivácie). Modifikácia proteínov nitroziláciou sa spolupodieľa na množstve účinkov NO (napr. inhibícia apoptózy v množstve buniek vzniká v dôsledku nitrozilácie molekúl kapsáz). V bunkách imunitného systému sú využívané radikálové vlastnosti NO. Jeho produkcia a uvoľňovanie makrofágmi slúži ako cytotoxický nástroj v boji proti patogénom. Liečivo glycerintrinitrát (alebo nitroglycerín), používané pri angíne pectoris uvoľňuje do obehu NO, čím zmenšuje pracovnú záťaž a zlepšuje prekrvenie srdečného svalu. K erekcii behom sexuálnej stimulácie dochádza následkom lokálneho uvoľnenia NO, ktorý zvýši koncentráciu cGMP v penise, čo má za dôsledok svalové uvoľnenie podporujúce prúdenie krvi do penisu. Pri poklese sexuálneho vzruchu dochádza k rýchlemu odbúravaniu cGMP pôsobením cGMP-špecifickej fosfodiesterázy. Viagra a podobné farmaka spomaľujú rozpad cGMP a tak udržujú erekciu. IV/11. Struktura a funkce DNA. Nukleové kyseliny sú potrebné pre uchovávanie a expresiu genetickej informácie. Existujú dva základne typy nukleových kyselín – deoxyribonukleová kyselina (DNA) a ribonukleová kyselina (RNA; viac o štruktúre RNA v otázke IV/12). DNA slúži na uschovanie genetickej informácie, nachádza sa v chromozómoch a tiež v mitochondriách a plastidoch. Prokaryotické bunky, ktoré neobsahujú jadro, majú len jeden chromozóm, no môžu obsahovať aj mimochromozomálnu DNA v podobe plazmidov. Genetická informácia z DNA je kopírovaná a prenášaná do dcérskych buniek pomocou DNA replikácie (viac otázka IV/16). DNA obsiahnutá v zygote kóduje informáciu, ktorá určuje celý vývoj organizmu. Behom vývoja vzniknú miliardy buniek, z ktorých je každá špecializovaná a vykazuje iba tie funkcie, ktoré sú potrebné pre jej úlohu v organizme. Preto DNA sa musí nielen precízne replikovať po každom delení bunky, ale taktiež sa jej informácia musí selektívne exprimovať. Transkripcia je prvým krokom expresie génovej informácie (viac otázka IV/19). Ďalej je kód v podobe nukleotidovej sekvencie v novo vzniknutej mRNA prekladaný, čím sa dokončuje génová expresia – proces translácie (viac otázka IV/24). Prenos inforácie z DNA do RNA a do proteínu sa nazýva centrálna dogma molekulárnej biológie a platí pre takmer všetky živé organizmy s výnimkou RNA vírusov (viac otázka IV/32). Primárnu štruktúru nukleových kyselín predstavuje poradie nukleotidov. Nukleotidy pozostávajú z dusíkatej bázy, pentózy(v závislosti na kyseline ide buď o ribózu v RNA alebo deoxyribózu v DNA) a jednej, dvoch alebo troch fosfátových skupín (v NK je v zastúpená iba jedna fosfátová skupina v každom nukleotide). Dusíkaté bázy rozdeľujeme na dve skupiny v závislosti od čoho sú odvodené - na purínové a pyrimidínové. Medzi purínové bázy patrí adenín (A) a guanín (G), ktoré sa nachádzajú aj v DNA aj v RNA. Medzi pyrimidínové bázy patrí cytozín (C), ktorý sa nachádza v DNA aj RNA, ďalej tymín (T), ktorý sa nachádza iba v DNA a uracil (U), ktorý sa nachádza iba v RNA. T a U sa od seba líšia iba prítomnosťou metylovej skupiny. V určitých typoch NK sa môžu nachádzať aj modifikované bázy, napr. vo vírusovej DNA a tRNA. Bázy môžu byť modifikované metyláciou, glykozyláciou, acetyláciou alebo redukciou. Prítomnosť modifikovaných bázy v nukleotidovej sekvencii môže napomôcť pri rozpoznaní sekvencie špecifickými enzýmami alebo chrániť ju pred degradáciou nukleázami. Pridaním pentózy k bázy vznikajú nukleozidy – z ribózy ribonukleozid a z 2-deoxyribózy deoxyribonukleozid. Ribonukleozidy odvodené od A, G, C, U sa nazývajú adenozín, guanozín, cytidín a uridín. Deoxyribonukleozidy od A, G, C a T majú v názve príponu -deoxy, napr. deoxyadenozín (deoxytymidín sa často označuje iba ako tymidín, kvôli jeho unikátnemu výskytu iba v DNA). Atómy uhlíku a dusíku v cykloch bázy a cukrov sa číslujú samostatne, na odlíšenie čísel sa v cukre atómy označujú 1 ́-5 ́a v cykle sa čísla píšu bez čiarky. Pridaním jedného alebo viacerých fosfátových zvyškov k nukloezidu vzniká nukleotid. Prvá fosfátová skupina sa viaže na 5 ́-OH pentózy pomocou esterovej väzby. Vzniknutá zlúčenina sa nazýva nukleozid-5 ́-fosfát alebo 5 ́-nukleotid. Podľa typu pentózy rozlišujeme 5 ́-ribonukleotid a 5 ́-deoxyribonukleotid. Ak nukleotid obsahuje jednu fosfátovú skupinu naviazanú na 5 ́ uhlík pentózy, nazýva sa nukleozid monofosfát, napr. adenozín monofosfát (AMP alebo adenylát). Ak sú pridané druhá alebo tretia fosfátová skupina, označujeme vzniknuté zlúčeniny ako nukleozid difosfát (adenozín difosfát alebo ADP) a nukleozid trifosfát (adenozín trifosfát alebo ATP). Druhý a tretí fosfát sú k nukleotidu pripojené tzv. makroergickou väzbou (väzbou s vysokou energiou). Fosfátová skupina prináša do nukleotidu negatívny náboj, preto sú DNA a RNA označované ako nukleové kyseliny (nukleové, lebo sú syntetizované v jadre bunky). DNA je biopolymérom deoxyribonuklotidov spojených 3 ́-5 ́fosfodiesterovými väzbami. Až na pár výnimiek, DNA existuje vo forme dvojvláknovej molekuly (dsDNA), kde sa obe vlákna navzájom otáčajú a vytvárajú tak dvojzávitnicu (česky dvojšroubovici) – helix (určité vírusy obsahujú jednovláknovú ssDNA). V eukaryotickej bunke je DNA viazaná na rôzne proteíny (spolu sa nazývajú nukleoproteíny) a nachádza sa v bunkovom jadre, pričom u prokaryotických buniek sa DNA-proteínový komplex sa nachádza v membránou neohraničenej oblasti, nazývanej nukleoid. Fosfodiesterová väzba spája 3 ́-hydroxlovú skupinu deoxypentózy jedného nukleotidu s 5 ́-hydroxylovou skupinou doxypentózy iného nukleotu cez fosfátovú skupinu (obrázok vedľa). Takto vzniká dlhý, nerozvetvený, polárny reťazec s voľným 5 ́-koncom (voľný fosfát) a voľným 3 ́-koncom (voľný hydroxyl), ktoré sa už neviažu na iné nukleotidy. Bázy, ktoré sú pripojené na vzniknutú dexyribózo- fosfátovej kostry sa podľa dohody píšu v poradí od 5 ́-konca k 3 ́- koncu. Fosfodiesterová väzba medzi nukleotidmi môže byť hydrolyticky štiepená pomocou chemikálií alebo skupinou enzýmov, nazývaných nukleázy (deoxyribonukleázy pre DNA a ribonukleázy pre RNA). DNA vytvára štruktúru dvojzávitnice, v ktorej sa dve vlákna navzájom obtáčajú okolo osi súmernosti. Vlákna sú spárované antiparalelne, t.j. 5 ́-koniec jedného vlákna sa páruje s 3 ́-koncom druhého. V dvojzávitnici je hydrofilná kostra na povrchu molekuly, pričom hydrofóbne bázy sú uložené vo vnútri molekuly. Výsledná štruktúra pripomína skrútený rebrík. Vzájomné priestorové usporiadania dvoch vláken vytvárajú v dvoj závitnici veľké a malé žliabky. Tieto žliabky napomáhajú väzbe regulačných proteínov na špecifické sekvencie nukleotidov. Určité onkologické lieky (napr. actinomycín D) vykazujú cytotoxické účinky tým, že sa vkladajú do malých žliabkov dvojzávitnice a tak bránia syntéze DNA a RNA. Bázy jedného vlákna DNA sa komplementárne párujú s bázami druhého vlákna, tak že adenín sa vždy páruje s tymínom a cytozín s guanínom. Pomocou danej sekvencie nukleotidov jedného vlákna si vieme určiť sekvenciu jeho druhého komplementárneho vlákna. Pre špecifické párovanie DNA reťazcov platí Chargaffovo pravidlo, ktoré hovorí, že vo vzorke dsDNA odpovedá množstvo adenínu množstvu tymínu, množstvo cytozínu odpovedá množstvu guanínu a celkové množstvo purínových báz sa rovná množstvu pyrimidínových báz. Bázy sa navzájom spájajú pomocou vodíkových mostíkov, pričom medzi adenínom a tymínom vznikajú dve väzby a medzi guanínom a cytozínom tri. Tieto vodíkové mostíky spolu s hydrofóbnymi interakciami medzi bázami stabilizujú dvojzávitnicovú štruktúru DNA. Dve vlákna dvojzávitnice sa od seba oddelia, ak sa vodíkové mostíky medzi nimi narušia. Narušenie mostíkov v laboratórnych podmienkach docielime pomcou zmeny pH (bázy začnú ionizovať) alebo vysokou teplotou, týmto však nedôjde k rozpadu fosfodiesterových väzieb. Teplota, pri ktorej dôjde k rozpadu polovice dvojzávitnicovej štruktúry sa nazýva teplota topenia (T m , melting teperature). Strata dvojzávitnicovej štruktúry DNA sa nazýva denaturácia a môže byť sledovaná pomocou merania absorbancie DNA pri 260nm. Kvôli tom, že medzi C a G vznikajú tri vodíkové mostíky a medzi A a T iba dva, bude DNA s vyšším obsahom A a T denaturovať pri nižšej teplote ako DNA bohatá na C a G. Za určitých podmienok môžu komplementárne vlákna DNA znova vytvoriť dvojzávitnicu procesom renaturácie. Rozlišujeme tri základne formy dvojzávitnice DNA – B formu (popísanú Watsonom a Crickom), A formu a Z fromu. B forma vykazuje pravotočivú helikálnu štruktúru s 10 nuklotidami v jednej 360° otáčke s bázami usporiadanými priečne voči hlavnej osi. B forma DNA vytvára väčšinu chromozomálnej DNA. A forma vzniká riadenou dehydratáciou B formy. Taktiež ide o pravotočivý helix s 11 nukleotidami v otáčke, pričom bázy sú usporiadané o 20° od priečnej pozície voči hlavne ose. Konformácie DNA-RNA hybridov alebo dvojzávitnicovej RNA sú veľmi podobné A forme DNA. Z forma DNA má ľavotočivú helikálnu štruktúru s 12 nukleotidami v otáčke (štruktúra Z formy je označovaná ako cik-cak (zig-zag po anglicky), z čoho pochádza jej názov). Úseky Z-DNA sa prirodzene vyskytujú v miestach, kde sa často strieda v sekvencii pyrimidín s purínom (napr. poly GC). Prechody medzi B a Z formou môžu mať význam pri regulácií génovej expresie. Každý chromozom v jadre eukaryotickej bunky obsahuje jednu dlhu lineárnu molekulu dsDNA, ktorá sa viaže na komplex proteínov (histónových a nehistónových). V mitochondriach a chloroplastoch eukaryotov sa nachádzajú aj uzavreté kruhové molekuly DNA. Prokaryotické organizmy obsahujú typicky jeden dvojvláknový skrútený kruhový chromozóm, ktorý sa viaže s nehistónovými proteínmi, ktoré kondenzujú DNA za vzniku nukleoidu. Okrem toho, väčšina baktérií obsahuje malé kruhové extrachromozomálne molekuly DNA nazývané plazmidy. Plazmidová DNA obsahuje genetickú informáciu a podlieha replikácií, ktorá môže, ale nemusí byť zhodná s tou chromozomálnou. 12. Struktura a funkce RNA. RNA sa na expresii genetickej informácie zúčastňuje v troch formách – ribozomálnej RNA (rRNA), transferovej (tRNA) a messengerovej alebo mediátorovej RNA (mRNA). Podobne ako DNA, primárna štruktúra týchto typov RNA sa skladá zo sekvencie nukleotidov spojených fosfodiesterovou väzbou. Avšak od DNA sa RNA líši vo viacerých smeroch, napr. jej molekuly sú podstatne menšie ako DNA, obsahujú ribózu ako pentózu , uracil miesto tymín a existujú v jednovláknovej forme, ktorá podlieha skladaniu do komplexných molekúl (existuje výnimka u RNA vírusov, ktoré obsahujú dvojvláknovú RNA). Tri hlavné typy RNA sa od seba tiež líšia veľkosťou, funkciou a štrukturálnymi modifikáciami. U eukaryotov existujú ešte iné typy RNA, malé ncRNA molekuly v jadre (snoRNA) a jadierku (snRNA), ktoré vykonávajú špeciálne funkcie. Ribozomálna RNA sa nachádza v spojení s určitými proteínmi v ribozómoch – komplexných štruktúr, ktoré slúžia ako miesto proteosyntézy. Existujú tri odlišné veľkosti rRNA v prokaryotickej bunke (23S, 16S a 5S) a štyri v eukaryotickej (28S, 18S, 5.8S a 5S), pričom S označujeme ako Svedbergová jednotka, ktorá určuje molekulárnu hmotnosť a tvar zlúčeniny. Spolu rRNA vytvára 80% celkového obsahu RNA v bunke. Niektoré rRNA majú aj katalytickú funkciu, preto ich označujeme ako ribozýmy. Transferová RNA je najmenšou z troch hlavných typov RNA (4S). Existuje aspoň jeden špecifický typ tRNA pre každú z 20 proteinogenných aminokyselín. Spolu tRNA vytvára 15% celkového množstva RNA bunky. Molekuly tRNA obsahujú mnoho modifikovaných nukleotidov (napr. dihydrouracil) a vyznačujú sa rozsiahlym párovaním nukleotidov, čo vytvára ich charakteristické sekundárne a terciárne štruktúry. Každá molekula tRNA slúži ako prenášač, ktorý nesie svoju špecifickú aminokyselinu (kovalentne naviazanú na jej 3 ́-koniec) na miesto syntézy proteínu. Tam rozpoznáva genetický kód na sekvencií mRNA, ktorá určuje pridanie jej aminokyseliny k rastúcemu peptidovému reťazcu. Messengerová (mediatorová) RNA zaberá iba 5% celkovej RNA v bunke a je určite najrôznorodejším typom RNA v zmysel veľkosti a sekvencie nukleotidov. mRNA prenáša genetickú informáciu z DNA v jadre do cytoplazmy, kde je použitá ako templát pre syntézu proteínov. Ak mRNA nesie informáciu z viac ako jedného génu, označujeme ju ako polycistronickú. Polycistronické mRNA sú typické u prokaryotov. Ak mRNA nesie informáciu iba z jedného génu, označujeme ju ako monocistronickú a je typická u eukaryotov. Okrem úsekov, ktoré kódujú proteíny a môžu podliehať translácii, mRNA obsahuje na svojich 3 ́ a 5 ́ koncoch aj úseky, ktoré nepodliehajú translácii. Medzi špeciálne štruktúrne úseky eukaryotickej (ale nie prokaryotickej) mRNA patrí dlhá sekvencia adenínových nukleotidov (poly-A tail) na 3 ́-konci RNA reťazca a „čepička“ na 5 ́-konci, ktorá sa skladá z molekuly 7- metylguanozínu pripojenému k RNA „naopak“ (5 ́→5 ́) pomocou trifosfátového spojenia. IV/13. Organizace prokaryontního, eukaryontního a mitochondriálního genomu. Genóm je súbor celej génovej informácie organizmu, zapísanej v sekvencii DNA alebo RNA (iba RNA vírusy). Genóm zahŕňa kódujúce (génové) aj nekódujúce (mimogénové) sekvencie DNA. Gén je základnou jednotkou genetickej informácie. Ide o úsek DNA kódujúci určitý produkt – proteín alebo určitý typ RNA procesom génovej expresie. Eukaryotický gén obsahuje promotor (určuje oblasť prepisu génu), exóny (kódujúce časti génu) a intróny (prepisované, ale nekódujúce časti génu). Jedna molekula eukaryotickej DNA môže mať dĺžku až okolo 1 m (u človeka). Aby sa takéto veľké množstvo genetického materiálu vošlo do eukaryotického jadra a mohla sa efektívne replikovať a exprimovať , musí vytvárať maximálne špiralizovanú štruktúru, nazývanú chromatín. Chromatín sa skladá z komplexu DNA a veľkého množstva proteínov, z ktorých ma každý určitú úlohu na zbaľovaní DNA. Eukaryotická DNA sa tesne viaže na malé bázické proteíny, nazývané históny, čím vytvárajú základnú jednotku organizovanej DNA – nukleozóm(niekedy sa v prenesenom význame označujú nukleozomy aj ako „korálky“). Existuje päť typov histónov, ktoré označujeme ako H1, H2A, H2B, H3 a H4. Tieto proteíny sú za fyziologického pH nabité kladne, čo je spôsobené veľkým obsahom lyzínu a arginínu. Vďaka svojmu kladnému náboju vytvárajú elektrostické interakcie so záporne nabitou DNA. Históny spolu s niektorými katiónmi (napr. Mg 2+ ) pomáhajú neutralizovať záporný náboj fosfátových skupín v DNA. Jadro každého nukleozómu je tvorené z histónov typu H2A, H2B, H3 a H4, pričom z každého typu sú obsiahnuté v nukleozóme dve molekuly (oktamér). Tento oktamér obtočí DNA priemerne 1,8 krát (približne 150 bp je obtočených okolo jedného oktaméru). N-konce histónov môžu byť acetylované, metlyované alebo fosforilované. Táto reverzibilná kovalentná modifikácia ovplyvňuje to, ako tesne sa bude viazať histón na DNA, čím sa ovplyvňuje expresia určitých génov (viac v otázke IV/38). Nukleozómy sú navzájom pospájané asi 50 bp dlhým úsekom DNA (tzv. linker DNA), na ktorý sa viaže histón H1. Tento typ histónu je najviac tkanivovo špecifickým a druhovo špecifickým typom histónu a može sa vyskytovať vo viacerých druhoch H1. Histón H1 podporujetvorbu špiralovito stočných nadštruktúr o priemer 30 nm, ktoré sa nazývajú solenoidy. Okrem histónov sa v chromatíne nachádzajú aj iné, nehistónové proteíny. Ide o veľmi heterogénnu skupinu, do ktorej sa radiaštrukturálne proteíny bunkového jadra, rôzne enzýmy a transkripčné faktory, ktoré sa špecificky viažú na určité úseky DNA a kontrolujú génovú expresiu a ďalšie procesy. Chromatín sa ďalej kondenzuje do vyšších štruktúr, nazývaných chromozómy. Pri kondenzácií chromatínu do chromozómov vytvárajú solenoidy smyčky s dĺžkou 200 nm, ktoré obsahujú zhruba 80 000 bp. Smyčky sú viazané na proteínový skelet – jadrový skelet, ktorý spojuje asi 2 smyčiek a do tzv. minipásov. Veľké množstvo navrstvených minipásov vytvára konečné chromozómy. Chromozóm obsahuje v sebe zhruba 1/3 DNA, zvyšok sú proteíny. Chromozóm sa skladá z dvoch chromatíd, rozpoznávame na ňom centroméru (miesto spojenia chromatíd), krátke a dlhé ramienko, na ktorých sa nachádzajú teloméry. Podľa umiestnenia centroméry, rozoznávame chromozomy metacentrické, submetacentrické, akrocentrické a telocentrické. Chromozóm sa koncentruje počas mitózy, kedy je viditeľný aj vo svetelnom mikroskope. Počas interfázy je chromozóm takmer rozpustený. Morfologicky na chromozóme môžeme rozlíšiť hustejší geneticky neaktívny heterochromatín a riedši euchromatín, ktorý je miestom aktívnej transkripcie. Ľudský karyotip za fyziologických podmienok obsahuje 46 chromozómov, ktoré sa delia na 22 párov autozómov a jeden pár gonozómov, ktoré podmieňujú pohlavie jedinca. V eukaryotickej bunke je DNA uložená aj mimo jadra v určitých organelách – mitochondriách (v rastlinnej aj živočíšnej bunke) a plastidoch (iba v rastlinných bunkách). Mitochondriálny genóm je organizovaný do niekoľko tisíc kópii cirkulárnch molekúl mtDNA, ktoré obsahujú približne 16 600 bp a kódujú 37 génov. Tretina týchto génov kóduje proteíny, ktoré sa uplatňujú v respiračnom reťazci, zvyšok kóduje 22 tRNA a 2 rRNA. Pre mitochondriálny genóm je typická absencia histónov, absencia intrónov a diskrétne počiatky replikácie. Pre mitochondrie je tiež typický rozdiel v genetickom kóde – UGA nie je terminačný kodón, ale kóduje tryptofán; AGA a AGG nekódujú arginín, ale majú úlohu stop kodónov a AUA kóduje miesto izoleucíniu metionín. Frekvencia mutácií je v mitochondriálnom genóme a 10-20x vyššia, kvôli pôsobeniu voľných radikálov dýchacieho reťazca. Prokaryotické organizmy majú DNA organizovanú do jedného hlavného cirkulárneho chromozómu. DNA v tomto chromozóme má dĺžku cca 1-2 mm, pričom veľkosť genómu je druhovo špecifická a niektoré druhý baktérií môžu v genóme obsahovať až niekoľko tisíc génov. Bakteriálne gény neobsahujú žiadne intróny a sú často regulované a prepisované skupinovo. Operon je úsek DNA, v ktorom sú zoradené funkčne blízke gény za spoločným promotorom, po prepísaní operonu vzniká súčasne viac molekúl mRNA. Štruktúra hlavného chromozómu je niekoľko krát špiralizovaná (superhelikálna špiralizácia) s výskytom zvinutých domén alebo smyčiek. Na zvinutých domenách sa podieľajú proteíny podobné histónom, tzv. HLP (histon like proteins), množstvo Ďalších proteínov je nekonštantné a a závisia na intenzite proteosyntézy. Jadro prokaryotických buniek nie je ohraničené, preto sa chromozóm baktérií nachádza v oblasti nazývanej nukeloid (jadrový ekvivalent). Chromzóm prokaryot je vždy pripojený na určité miesto plazmatickej membrány (OriC) – toto miesto je začiatkom replikácie. Okrem hlavného chromozómu majú v cytoplazme prokaryota jeden alebo viac kruhových chromozómov, nazývaných plazmidy. Plazmidy nesú genetickú informáciu, ktorá pre bunku nie je úplne nevyhnutná, ale predstavuje určitú selekčnú výhodu pre baktériu (napr. odolnosť voči antibiotikám, schopnosť konjugácie alebo tvorby baktericídov, čím usmrcujú okolité baktérie). Veľkosť DNA plazmidov je variabilná (1,5-250 kb), čo odpovedá počtu kódovaných polypeptidov (2-300). Plazmidy sú pre svoju replikačnú schopnosť využívané ako vektory v genetickom inžinierstve. Organizácia genómu archeií sa líši od prokaryotov. Vytvárajú štruktúry podobné eukaryotickým chromozómom. Organizácia génom vírusov je popísaná v otázke IV/32. IV/14. Techniky sekvenování DNA (Sanger, NGS, sekvenování lidského genomu). Nukleotidovú sekvenciu môžeme určiť pomocou sekvenovania DNA. Samotnému sekvenovaniu predchádza odštiepenie sekvenovaného fragmentu z DNA pomocou vhodných endonukleáz a jeho namnoženie vo vhodnom vektore (klonovanie) alebo amplifikácia in vitro pomocou PCR. Medzi základné metódy sekvenovania DNA patrí napr. Sangerova metóda, automatické sekvenovanie, NGS a ďalšie. Metóda zastavenia reťazca alebo tiež nazývaná Sangerova enzýmová metóda je jednou zo základných sekvenovacích techník. Pri tzv. jednoreťazcovom sekvenovaní je fragment DNA klonovaný vo vhodnom vektore (napr. bakteriofág M13), z ktorého sa dá bez problémov izolovať jednotlivý kódujúci reťazec. Ten sa hybriduje s primerom, krátkym syntetickým fragmentom DNA, ktorý sa viaže na 3 ́-konci vloženého úseku DNA. Na podklade tohto hybridu môžeme doplniť chýbajúci druhý reťazec skúmavke s pomocou pridanej DNA-polymerázy a dostatočného množstva štyroch druhov deoxyribonukleozidtrifosfátov (dNTP). Ďalej sa do procesu pridáva malé množstvo dideoxyribonukleozidtrifosfátu (ddNTP). Začlenenie tohto ddNTP vyvoláva zastavenie syntézy druhého reťazca. To sa môže stať v prípade, že by musel byť zabudovaný odpovedajúci dNTP. Na obrázku vedľa je to ukázane na príklade ddGTP. V tomto prípade získame fragmenty obsahujúce vždy primer spolu s 3, 6, 8, 13 alebo 14 ďalšími nukleotidmi. Uskutočnia sa štyri samostatné reakcie vždy s jedným ddNTP, produkty sa nanesú samostatne na nosič a fragmenty sa oddelia gélovou elektroforézou, v ktorej putujú fragmenty podľa dĺžky. Po vizualizácií sa čítajú iba poradia jednotlivých fragmentov v jednotlivých dráhach smerom zdola nahor a priamo obdržíme nukleotidovú sekvenciu. V súčasnosti sa využíva automatická metóda pri ktorej sa štyri ddNTP kovalentne označia fluorescenčným farbivom, ktoré po osvietení laserom vykazuje odlišnú farbu pre každé ddNTP. Fragmenty vzniknuté Sangerovou reakciou sa v tomto prípade rozdeľujú kapilárnou elektroforézou, ktorá je na určitom mieste ožarovaná laserom. Týmto spôsobom je možné kontinuálne zaznamenať a ihneď digitálne ukladať poradie objavujúcich sa jednotlivých fragmentov na dolnom konci gélu. Poradie jednotlivých nukleotidov sa zaznamenáva v podobe rôzne farebných vrcholov na grafe. So zvyšujúcimi nárokmi na rýchlosť, presnosť, nižšiu cenu a možnosť sekvenovania väčších fragmentov sa vyvinuli nové metódy sekvenovania, súhrne označovaných ako Next Generation Sequencing alebo NGS. Presný postup sekvenovania sa líši v každej jednotlivej technike, ale všeobecný postup zahŕňa fragmentáciu DNA, následnú PCR amplifikáciu (využívajú sa aj špeciálne metódy PCR ako emulzná PCR alebo bridge PCR), označenie fragmentov sondami a následné paralelné sekvenovanie (spôsob záleží na konkrétnej technike). Počas NGS prebieha paralelne veľké množstvo sekvenovacích procesov, čím je možné získať veľké množstvo informácií. Býva však problém ich správne vyhodnotiť a výsledky vyhodnocuje a interpretuje bioinformatik. NGS technologie sa využívajú na celogenómové sekvenovanie, ale aj cielené sekvenovanie konkrétneho úseku DNA, tiež sekvenovanie jednotlivých chromozómov alebo RNA sekvenovanie. Medzi NGS techniky patrí napr. pyrosekvenovanie, SOLiD phase, ion torrent a iné. Pyrosekvenovanie využíva vznik svetla v roztoku (roztok zabliká), ktorá nastane enzymatickou reakciou, vyvolanou po naviazaní správneho nukleotidu na fragment DNA, vzniknuté svetlo zachytíme počítačom. Počas jedného cyklu naväzovania nukleotidov na fragment sa pridáva do roztoku vždy iba jeden druh dNTP (napr. ATP), po skončení reakcie sa zvyšné nukleotidy z roztoku odstránia a pridá sa iný druh dNTP (napr. GTP). Ion torrent využíva zmenu pH počas naviazania nukleotidu na fragment, počas naviazania sa uvoľňuje H + a teda vzniká výkyv pH, ktorý registruje počítač. SOLiD phase sekvenovanie je založené na princípe ligácie, na sekvenciu DNA sa viažu fragmenty, koniec fragmentu sa rozžiari a odštiepi, následne sa môže naviazať ďalší fragment a cyklus sa opakuje - ide o veľmi presnú techniku. Projekt mapovania ľudského genómu začal v laboratóriu Los Alamos a laboratóriu Lawrence Livermora už v roku 1983, kedy sa začali vytvárať knižnice jednotlivých DNA klonov. Základom výskumu sekvenovania náhodných častí genómovu dobrovoľníkov. Jednalo sa o etnicky rôznorodé skupiny. Jednotlivé získané sekvencie boli nasledovne namnožené vo vhodných vektoroch do niekoľkých miliónov kópií – vznikali tak tzv. bakteriálne umelé chromozómy. Získala sa tak vzorka sekvencií, ktoré na seba však nenadväzovali v zodpovedajúcom poradí. Toto poradie bolo určované následne pomocou algoritmov za využitia veľmi výkonných počítačov. Tie spracovali mnoho miliónov dát a pomocou porovnávania jednotlivých častí ľudských genómov určili poradie jednotlivých báz. Tie odpovedali konečnému počtu 23 párov chromozómov. Prvými sekvenovanými ľudskými chromozómami boli 16. a 19. chromozóm, stalo sa tak v roku 1995. O 2 roky neskôr (1997) došlo k sekvenovaniu kompletného genómu E.coli. Vďaka medzinárodnej spolupráci jednotlivých výskumných tímov došlo k relatívne „rýchlemu“ zmapovaniu ľudského genómu. V roku 2000 bolo oznámené dokončenie pracovnej verzie kompletného ľudského genómu – výskum teda trval 17 rokov. V projekte bolo popísaných 80 000 ľudských génov. Behom skladania a sekvenovania genómu bolo použité viac ako 300 sekvencerov. Technická náročnosť na počítačové vybavenie je dnes braná ako jedna z najnáročnejších elektrických prác vôbec. Aj dnes sa jedná o projekt, ktorý vzbudzuje mnoho pochybností v oblasti etickej a morálnej. Najčastejšie obavy sú spojené so zneužívaním informácií o genóme jednotlivých ľudí. V nich sú totiž zakódované mnohé ochorenia a postihnutí nositelia (problém poisťovní, zamestnávateľov,...). Väčšina obáv súvisí s možnosťou využitia projektu. Do budúcna sa počíta s uplatnením v oblasti skorej diagnostiky mnohých genetických ochorení a predpokladov k nim. V rámci rozvoja framakogenomiky by sa jednotlivé lieky mohli pripravovať individuálne pre jednotlivých pacientov tak, aby nepoškodili pacienta. Zlepší sa odhaľovanie zdravotných rizík mutagénnych alebo kancerogénnych látok, čo môže viesť k zníženiu rizík postihnutia. Lepšia identifikácia v súdnom lekárstve pomocou DNA. IV/15. Klasifikace lidské genomové DNA podle repetitivnosti a podle funkce, pseudogeny, transpozony. Ľudský jadrový genóm v haploidnom stave obsahuje približne 3,2 miliardy bp a kóduje približne 20 až 25 tisíc génov. Ľudská genómová DNA sa skladá z nerepetitívnych (jedinečných) sekvencií a repetitívnych sekvencií. Jedinečné sekvencie tvoria hlavne kódujúce časti DNA – exóny. Repetitívne sekvencie majú svoj význam pri génovej expresii a jej regulácii, ale aj pri architektonike a stabilite chromozómov a bunkového jadierka. Okrem toho prispievajú repetitívne sekvencie k jedinečnosti genómu každého jedinca (polymorfizmy DNA). Podľa funkcie môžeme DNA sekvencie rozdeliť na kódujúce – exóny (asi iba 5% celkovej DNA) a nekódujúce – intróny (sú prepisované do mRNA, ale po transkripcii sú vystihnuté, takže sa neprekladajú) a mimogénová DNA. Pseudogény (génové fragmenty) sú nekódujúce časti DNA, ktoré sa vznikli z iných génov (duplikáciou), ale evolučne už stratili svoju funkciu. Okrem celých kópii génov sa medzi pseudogénmi vyskytujú aj skrátené kópie, ktorým chýba 5 ́alebo 3 ́koniec, alebo iba fragmenty génov. Počas vývoja sa v nich nahromadili mnohé tiché mutácie (nepôsobila proti ním selekcia). Pre svoju podobnosť s funkčnými génmi môžu spôsobovať problémy pri genetických vyšetreniach. Príkladom pseudogénu môžu byť pseudogény v skupine globulínových génov. Repetitívne sekvencie sú úseky DNA rôznej dĺžky, ktoré sa vyskytujú v mnohých kópiách. V genóme sa môžu vyskytovať ako rozptýlené alebo tandemové repetície. Rozptýlené repetitívne sekvencie sú lokalizované na mnohých miestach genómu a nezoskupujú sa. Veľkú časť týchto repetícii tvoria mobilné sekvencie – transpozóny, ktoré majú schopnosť pohybovať sa v genóme procesom transpozície a začleňovať sa tak do iných oblastí DNA. Transpozóny môžu byť zdrojom mutácii a štruktúrnych prestavieb chromozómov. Podľa spôsobu transpozície ich rozdeľujeme na retrotranspozóny a DNA transpozóny. Retrotranspozóny bývajú premiestňované pomocou procesu transkripcie a následnej reverznej transkripcie, preto mnoho týchto transpozónov obsahujú aj gény pre reverznú transkriptázu. Podľa dĺžky ich rozdeľujeme na krátke repetície (SINE; Short Interspersed Nuclear Elements) a na dlhé repetície (LINE; Long Interspersed Nuclear Elements). Sekvencie LINE obsahujú repetitívne jednotky s dĺžkou 5-7 kb. Sú autonómne , lebo môžu kódovať produkty potrebné pre retrotranspozíciu vrátane reverznej transkriptázy. V genóme sú zastúpene až v 50 000 a viac kópiách. U človeka sa nachádzajú tri príbuzne rodiny LINE1, LINE2 a LINE3, z čoho najdôležitejšia je LINE1 so sekvenciou dlhou asi 6,1 kb. LINE1 kóduje proteín viažuci sa na RNA a proteín s endonukleázovou aktivitou, ktorý zároveň funguje ako reverzná transkriptáza. Kópia sekvencie sa integruje často do oblastí bohatých na adenín a tymín. Sekvencie SINE sú kratšie, obsahujú 100- 400 bp, nekódujú žiadne proteíny a môžu byť mobilizované pomocou susedných sekvencií LINE. Najznámejšou sekvenciou SINE sú Alu sekvencia, ktorá má dĺžku 250 bp a existuje v mnohých kópiách (skoro 1 milión) rozptýlených na rôznych miestach genómu vrátane intrónov niektorých génov. Tieto repetície obsahujú sekvencie, ktoré môžu byť rozštiepené restrikčným enzýmom Alu – odtiaľ pochádza ich názov. Sú lokalizované v oblastiach DNA bohatých na guanín a cytozín. Druhou skupinou transpozónov sú DNA tronspozóny, ktoré sa pohybujú pomocou vystrihnutia a opätovného začlenenia úseku na iné miesto genómu (konzervatívna transpozícia). Tandemovo repetitívne sekvencie majú svoje kópie v genóme usporiadané veľmi tesne vedľa seba. Delíme ich podľa dĺžky opakujúcej sekvencie na satelitné, minisatelitné, mikrosatelitné a repetície jednoho nukleotidu. Satelitná DNA obsahuje rôzne dlhú opakujúcu sa jednotku (až 200 bp) a tvoria úseky dlhé 100 – 5 000 kb, vyskytujú sa často v heterochromatíne, najmä v oblasti centromér. Minisatelitná DNA má opakujúcu sa jednotku približne 15 – 100 bp, ktorá tvorí úseky dlhé až 20 kb, vyskytujú sa napr. v oblati telomér (u človeka tvorí teloméry opakujúca sa hexanukleotidová repetícia TTAGGG, ktorá zaujíma 3-20 kb). Mikrosatelitná DNA je najčastejšou formou repetitívnej DNA, väčšinou ju tvoria jednotky dlhé menej než 10 bp (najčastejšie 2- 5bp), ktoré sa opakujú v dĺžke 150 bp. Nachádzajú sa na rôznych miestach genómu, môžu sa nachádzať aj v intrónoch génov a môžu byť aj v kódujúcich oblastiach (v týchto miestach môžu nastávať dynamické mutácie – viac v odstavci patobiochémia). Z dinukleotidových repetícii sú častejšie repetície obsahujúce adenín a tymín (AT) a menej časté obsahujú cytozín a guanín (CG). Najčastejšie dinukleotidové repetície sú CA, ktoré tvoria až 0,5% genómu a počet repetícií je veľmi polymorfný. Repetície jedného nukleotidu predstavuje hlavne sekvencia adenínov a tvorí polyA signál. Patobiochémia Zmnožením repetitívnych sekvencií (hlavne trinukleotidových) vo vnútri exónu, v promotore alebo na hranici intrónu a exónu, ktoré vznikajú napr. chybou pri replikácii, môžu vznikať dynamické mutácie, ktoré spôsobujú genetické ochorenia. Medzi najčastejšie ochorenia spojené s dynamickými mutáciami sú Huntigtonová chorea, Syndróm fragilného X, Friedreichova ataxia alebo myotonická dystrofia. Závažnosť a nástup ochorenia závisí na počte zmnožených repetícií. Huntingtonova chorea je autozomálne dominantne dedené neurodegenereatívne ochorenie s neskorým nástupom, spôsobené zmnožením sekvencie CAG v géne kódujúcom proteín huntingtín. Normálny počet repetícii CAG je 10-25, jedinci s 27-35 CAG sú stále zdravý, ale s veľkou pravdepodobnosťou sa ochorenie prejaví u ich potomkov (premutácia) a jedinci so 40 a viac repetíciami sú postihnutý (plná mutácia). U chorých vzniká defektný proteín, ktorý sa ukladá v neurónoch, ktoré následne odumierajú. Choroba je neliečiteľná, nastupuje v strednom veku a prejavuje sa zmenou osobnosti, poruchami pohybu, demenciou až nakoniec končí smrťou. Syndróm fragilného X je X-viazaná dedičná choroba so špecifickým spôsobom dedičnosti. Ide o jednu z najčastejších dedičnej foriem mentálnej retardácie. Syndróm je spôsobený amplifikáciou trinukleotidov CCG alebo CGG v oblasti promotoru génu FMR1,toto miesto sa na X chromozóme farbí menej a bolo preto pokladané za zlom. Zdravý jedinec má 6-50 týchto repetícii, jedinci s premutáciou 50 – 200 a postihnuté osoby viac ako 200repetícii. Syndróm sa prejavuje mentálnou retardáciou a charakteristickým vzhľadom – veľké uši, pozdĺžna tvár, hrubé rysy a zväčšené testes u chlapcov (makroorchizmus). Friedreichova ataxia je nevyliečiteľné autozomálne recesívne neurodegenratívne ochorenie spojené s amplifikáciou trinukleotidu GAA v intróne génu pre mitochondrialny proteín frataxín (mutácia nastáva pri viac ako sto repetíciách). Ochorenie sa prejavuje už v predškolskom veku poruchami koordinácie pohybov, chôdze, udržania rovnováhy, ďalej poruchami zmyslov (zraku a sluchu) a reči. Intelekt nie je postihnutý a pomerne často sa objavuje cukrovka a deformácia kostí osového skeletu a končatín. Myotonická dystrofia je autosomálne dominantné ochorenie postihujúce svalstvo, prejavuje sa stupňujúcim sa oslabením svalstva, svaly sa sťahujú, ale nie sú schopné následného uvoľnenia. Ochorenie je spôsobené amplifikáciou trinukleotidu CTG v géne pre jeden typ proteín-kinázy, mutácia nastáva pri viac ako 50repetíciách. IV/16. Replikace eukaryontní DNA, replikační aparát a jeho regulace Replikácia DNA dáva vznik dvoma novým dvojzávitniciam, ktoré pochádzajú z materského helixu a obe sú, až na veľmi vzácne chyby, jeho presnou kópiou. Oba reťazce obsahujú navzájom komplementárne sekvencie nukleotidov, preto môžu obe slúžiť ako templát (matrica, predloha) pre syntézu nového komplementárneho reťazca. Inak povedané, ak si jeden reťazec označíme ako S a druhý ako S ́, môže S slúžiť ako templát pre syntézu nového S ́ vlákna a S ́ ako templát nového S vlákna. Každá dcérska dvojzávitnica tak obsahuje jedno nové vlákno a jedno vlákno pôvodné. Schopnosť oboch vláken fungovať ako templát pre syntézu komplementárneho vlákna umožňuje bunke kopírovať (replikovať) svoje gény pred rozdelením bunky na dve dcérske bunky. Replikácia prebieha veľmi rýchlo a presne, živočíšna bunka dokáže behom 8 hodín skopírovať celý svoj genóm priemerne s jednou alebo dvoma chybami. Tento proces uskutočňuje súbor proteínov, ktorý dokopy vytvára replikačný aparát. Dvojzávitnica DNA je za normálnych podmienok veľmi stabilná a má oba reťazce pevne spojené vodíkovými mostíkmi medzi bázami. K ich oddeleniu dochádza až pri teplote cca 100°C, vďaka dodaniu vysokej tepelnej energie. DNA sa však musí rozdeliť, aby mohla slúžiť ako templát. Proces replikácie začínajú iniciačné proteíny, ktoré sa naviažu na DNA a rozdelia dvojzávitnicu prerušením vodíkových mostíkov. Napriek tomu, že vodíkové mostíky dávajú dvojzávitnici stabilitu, energia jedného mostíku je veľmi malá, preto separácia malého úseku DNA nevyžaduje veľký prísun energie a môže k nej teda dochádzať pomocou iniciačných proteínov aj za normálnej teploty. Miestam, kde je štruktúra dvojzávitnice najskôr narušená, sa hovorí replikačné začiatky a sú určené špeciálnou nukleotidovou sekvenciou. V jednoduchých bunkách (napr. baktérie a kvasinky) sú tieto replikačné začiatky určené asi 100 pármi nukleotidov. Tieto miesta sú tvorené špecifickými sekvenciami nukleotidov, ktoré sú jednak rozpoznateľné iniciačnými proteínmi a tiež sa ľahko dajú od seba oddeliť. Typicky sa tu budú vyskytovať vyššie sekvencie adenínu a tymínu, ktoré sa dajú ľahko rozdeliť (na rozdiel od C a G sa A a T párujú iba dvoma mostíkmi). Bakteriálny genóm, ktorý je väčšinou tvorený jednou kruhovou molekulou o dĺžke niekoľko miliónov nukleotidov, má len jeden replikačný začiatok. Na rozdiel od baktérií môžeme v o veľa väčšom ľudskom genóme nájsť až 10 000 týchto začiatkov. Takto veľký počet začiatkov dovoľuje ľudskej bunke zreplikovať celú svoju DNA behom relatívne krátkej doby. Hneď ako sú iniciačné proteíny naviazané na DNA a otvoria jej štruktúru, viaže sa na replikačný začiatok skupina proteínov, ktoré spolupracujú pri syntéze nového vlákna DNA. Na molekule DNA v elektrónovom mikroskope môžeme v mieste začiatkov replikácie pozorovať útvary v tvare Y, ktoré sa nazývajú replikačné vidličky. V týchto vidličkách sú naviazané proteíny replikačného aparátu, ktoré sa pohybujú v smere replikácie a rozvíjajú dvojzávitovú štruktúru za súčasnej syntézy nového reťazca. V jednom replikačnom začiatku sa vytvoria dve vidličky, ktoré sa pohybujú smerom od seba a preto je replikácia bakteriálneho aj eukaryotického chromozómu nazývaná aj ako obojsmerná. Vidličky sa pohybujú veľmi rýchlo (zhruba 100 nukleotidov za sekundu u človeka, 1000/s u baktérie). Najdôležitejším enzýmom replikačného aparátu je DNA- polymeráza, ktorá syntetizuje nové vlákno DNA podľa pôvodného reťazca. Tento enzým katalyzuje pripojovanie nukleotidov na 3 ́-koniec syntetizovaného vlákna vytváraním fosfodiesterovej väzby medzi OH skupinou spomínaného 3 ́-konca a fosfátovou skupinou pridávaného nukleotidu (obrázok vedľa). Nukleotidy vstupujú do reakcie ako energeticky bohaté nukleozidtrifosfáty a dodávajú energiu polymerizačnej reakcií. Energia uvoľnená hydrolýzou jednej fosfodiesterovej väzby v nukleozidtrifosfáte je dostatočná pre kondenzačnú reakciu, pri ktorej sa viaže nukleotidový monomér do novo syntetizovaného reťazca za súčasného uvoľnenia difosfátu, ktorý je ďalej hydrolyzovaný na anorganické fosfáty (čím sa zaručuje nevratnosť reakcie). DNA-polymeráza sa neoddeľuje od DNA po každom pridaní nukleotidov, ale zostáva naviazaná pomocou špeciálneho proteínu na DNA a behom polymerizácie sa pozdĺž nej pohybuje. Keďže je DNA replikovaná iba v smere 5 ́→3 ́, nastáva na replikačnej vidličke určitý problém. Cukor-fosfátová kostra dáva obom reťazcom v dvojzávitnici polaritu, obe vlákna sú však navzájom v opačnej orientácií. Dôsledkom toho je replikačná vidlička asymetrická, tj. jeden nový reťazec v replikačnej vidličke je syntetizovaný podľa templátu v smere 3 ́→5 ́ a druhý podľa templátu v smere 5 ́→3 ́. Obe reťazce však zdanlivo rastú smerom, ktorým sa pohybuje replikačná vidlička a tak sa zdá, že prvé vlákno je syntetizované v smere 5 ́→3 ́ a druhé 3 ́→5 ́. DNA-polymeráza však môže katalyzovať rast reťazca DNA iba v jednom smere – pridáva nové podjednotky iba na jeho 3 ́-koniec. Tým však nastáva problém s replikáciou podľa 5 ́→3 ́ templátu, pretože neexistuje DNA-polymeráza, ktorá by dokázala predlžovať 5 ́-koniec DNA. Týmto smerom smerom rastie DNA diskontinuálne, čo znamená, že sú v smere 5 ́→3 ́ syntetizované krátke úseky DNA, ktoré sú následne spojované v kontinuálny reťazec. Výsledkom je potom dojem skokového rastu vlákna v smere 3 ́→5 ́, napriek tomu, že je aj toto vlákno syntetizované v smere 5 ́→3 ́. Reťazec DNA, ktorý je tvorený kontinuálne (v smere 5 ́→3 ́) sa nazýva vedúci reťazec, druhé vlákno, ktoré je syntetizované diskontinuálne, sa nazýva opožďující se alebo viaznuci reťazec. DNA-polymeráza je veľmi presne pracujúci enzým, ktorý spraví priemerne jednu chybu na 10 7 zreplikovaných párov nukleotidov. Tento počet chýb je veľmi nízky oproti očakávaniu založenom na prostom párovaní nukleotidov – typicky sa párujú A-T a G-C, ale môžu sa párovať napríklad aj G-T a A-C, avšak tieto interakcie sú o veľa menej stabilné. K atypickému párovaniu dochádza relatívne často a keby nebolo opravované, hromadili by sa v bunke mutácie, ktoré by mohli viesť ak smrti bunky. Hromadnej fixácií mutácií v genóme je zabránené opravnou funkciou samotnej DNA-polymerázy. DNA-polymeráza katalyzuje teda nielen syntézu DNA, ale má aj opravnú funkciu, nazývanú korektúra (proofreading). Pred pridaním nového nukleotidu do DNA-polymeráza skontroluje, či sa predchádzajúci nukleotid správne páruje s s nukleotidom v templáte. Ak áno, pridá ďalší nukleotid, ak nie, DNA-polymeráza sama odstráni nepárujúci nukleotid rozpustením fosfodiesterovej väzby a pridá iný nukleotid. DNA.polymeráza má teda dve funkcie: 5 ́→3 ́ polymeračnú a 3 ́→5 ́nukleázovvú aktivitu (štiepiacu nukleové kyseliny). Korektorská funkcia DNA-polymerázy vysvetľuje, preč môže byť DNA syntetizovaná iba v smere 5 ́→3 ́. Ak by DNA polymeráza vedela syntetizovať DNA v smere 3 ́→5 ́, nemohla by mať opravnú funkciu – ak by odstránila nesprávne spárovaný nukleotid, vznikol by 5 ́- koniec, ktorý ďalej nemôžeme nastavovať. Ak má DNA-polymeráza fungovať ako samoopravujúci eným, ktorý odstraňuje chyby urobené počas pohybu po DNA, môže mať len 5 ́→3 ́polymerázovú aktivitu. Presnosť replikácie závisí na DNA-polymeráze, ktorá pridáva ďalší nukleotid až po kontrole správneho párovania predchádzajúcich bázy. Pretože DNA-polymeráza môže pripojiť nový nukleotid iba k spárovaným nukleotidom v dvojzávitnici, nedokáže začať syntetizovať nové vlákno. Musí teda existovať iný enzým, ktorý by dokázal spojiť dva voľné nukleotidy a začal tak syntetizovať úplne nové vlákno podľa jednoreťazcovej DNA. Tento enzým však netvorí DNA, ale krátky úsek RNA. Tieto úseky dlhé približne 10 nukleotidov sa párujú s templátovým reťazcom a poskytujú svoj 3 ́-koniec ako začiatok pre DNA-polymerázu. Slúžia teda ako primér pre syntézu DNA a enzým, ktorý ho tvorí sa nazýva primáza. Pri syntéze vedúceho reťazca je potrebný iba jeden RNA-primér, hneď ako v replikačnom začiatku vznikne, DNA- polymeráza je schopná ho kontinuálne predlžovať. Syntéza viaznuceho reťazca je však diskontinuálna vyžaduje neustálu tvorbu RNA-primérov. Hneď ako sa replikačná vidlička posunie a uvoľní sa nový úsek nespárovaných nukleotidov, je na ňom vytvorený nový RNA-primér. DNA-polymeráza potom pridá nukleotidy na 3 ́-koniec RNA-priméru a predlžuje reťazec DNA, pokiaľ nenarazí na ďalší primer. Pre vytvorenie súvislého vlákna DNA z viaznuceho reťazca, tvoreného mnohými oddelenými úsekmi (ktoré sa podľa svojho objaviteľa nazývajú Okazakiho fragmenty) sú nutné tri enzýmy. Je potrebné odstrániť RNA-priméry nukleázou, nahradiť ich DNA, čo sprostredkuje opravná DNA-polymeráza a nakoniec je nutné všetky spojiť všetky úseky dokopy DNA-ligázou. DNA-ligáza dokáže spojiť 5 ́- fosfátový koniec prvého úseku s 3 ́-hydroxylovým koncom ďalšieho úseku. Pretože primáza nemá schopnosť robiť opravy, môže síce začať syntetizovať nový reťazec, ale v priméroch vzniká mnoho chýb. Pretože sú však priméry tvorené RNA a nie DNA, sú určené k degradácií a chyby v nich nehrajú žiadnu úlohu pre presné zachovanie genetickej informácie. RNA je nahradená DNA v procese katalyzovanom opravnou DNA-polymerázou , ktorá má taktiež ako replikačná DNA-polymeráza korektorskú schopnosť. Replikačný aparát je teda schopný nielen začať syntézu nového vlákna, ale aj zaistiť presnosť kopírovania templátu. Jednou zo základných zložiek replikačného aparátu je helikáza, ktorá využíva energiu z hydrolýzy ATP k pohybu pozdĺž DNA a súčasnému rozvíjaniu dvojzávitnicovej štruktúry. Dvojzávitnica DNA musí byť rozvinutá nielen na začiatku replikácie, ale jej rigídna štruktúra musí byť aj naďalej rozpletaná, aby DNA mohla slúžiť ako jednoreťazcový templát pre DNA-polymerázu. Ďalšími bielkovinami nutnými pre replikáciu sú proteíny viažuce sa na jednovláknovú DNA, tzv. SSB-proteíny (ang. Single-strand binding preoteins), ktoré ochraňujú jednovláknovú DNA uvoľnenou helikázou pred znovuspárovaním. Zvierajúci proteín (ang. Sliding clamp) je ďalšou súčasťou replikačného aparátu, pevne viaže DNA-polymerázu na templát, na iaznúcom reťazcu ju naviac uvoľňuje po ukončení syntézy každého Okazakiho fragmentu. Zvierajúci proteín má tvar prstenca, ktorý objíma DNA a pohybuje sa pozdĺž nej aj s naviazanou DNA-polymerázou v smere replikácie. Predpokladá sa, že väčšina proteínov, ktoré spolupracujú na syntéze DNA, tvoria jeden veľký multimérny komplex, ktorý sa ako celok pohybuje pozdĺž DNA a umožňuje syntézu DNA na oboch reťazcoch súčasne. Energiu celému procesu dodáva hydrolýza nukleozidtrifosfátov. Detailná štruktúra replikačného aparátu doposiaľ nie je známa a jej predpokladaná podoba je zobrazená na obrázku vedľa. IV/17. Reparace DNA − BER, NER, MMR, přímá reparace modifikovaných bazí. Aj napriek prepracovanému korekčnému systému zapojeného do syntézy DNA, môžu nastať určité chyby – napríklad nesprávne spárovanie nukleotidov alebo inzercia jedného alebo viacerých extra nukleotidov. K tom je však DNA sústavne vystavovaná nepriaznivým vplyvom prostredia, ktoré spôsobujú zámenu alebo odstránenie nukleotidov. Poškodzujúce faktory môžu byť buď chemické (napr. HNO 3 ) alebo ide o žiarenie (napr. UV žiarenie môže spojiť dokopy dva susedské pyrimdíny v DNA; obrázok vedľa, alebo ionizujúce žiarenie s vysokou energiou môže spôsobiť zlomy v dvojzávitnici). V každej bunke sa denne tisíce nukleotidov sa v DNA samovoľne zamieňajú alebo strácajú. AK sa poškodenie neopraví a vznikne permanentná zámena (mutácia), ktorá môže vyvolať vážne komplikácie, ako napr. strata kontroly nad proliferáciou mutovanej bunke, čo môže vyvolať rakovinu. Našťastie sú bunky veľmi pohotové pri opravách poškodení ich DNA. Väčšina opravných systémov najprv rozpozná poškodený úsek DNA, potom ho odstránia (odstrihnú) a nasyntetizujú nový komplementárny reťazec na prázdnom mieste po odstránení poškodenia. Takto bunka vystihne a opraví naraz jeden až desať nukleotidov. Reparácia DNA zníži počet chýb z jednej z milióna na jednu z miliardy chyb. Občas sa stane, že chyba vzniknutá replikáciou nie je ihneď opravená kontrolným systémom počas syntézy novej DNA, čím vzniká zlé párovanie nukleotidov. U baktérie E. Coli je zlé párovanie korigované skupinou proteínov, nazývaných Mut proteíny, ich homológické proteíny sa vyskytujú aj u človeka. Ak vznikne zlé párovaninezhoda nukleotidov, Mut proteíny, ktoré identifikujú nezhodujúci sa nukleotid, musia byť schopné rozlíšiť zdravé vlákno od vlákna s mutáciou. Toto rozlišovanie sa uskutočňuje na základe stupňa metylácie. Sekvencia GATC, ktorá sa objavuje približne raz za tisíc nukleotidov je metylovaná na adeníne. Táto metylácia nevzniká hneď po syntéz, takže nové vlákno DNA je hemimetylované (t.j., že parentálne vlákno je metylované, ale nové nie je). Metylované parentálne vlákno je považované za správane a novo vzniknuté vlákno je potrebné opraviť. Detailný mechanizmus identifikácie nového vlákna je zatiaľ neznámy. Keď je mutované vlákno identifikované, enzým endonukleáza nastrihne vlákno a nevhodný nukleotid je odstránený exonukleázou. Taktiež sú odstránené dodatočné nukleotidy na 5 ́- a 3 ́- koncoch mutácie. Vzniknutá medzera je zaplnená podľa sesterského vlákna DNA polymerázou. 3 ́- hydroxlová skupina novo syntetizovanej DNA je pripojená k 5 ́- fosfátovej skupine starého úseku DNA pomocou DNA-ligázy. Vystavenie bunky UV žiareniu môže spôsobiť kovalentné spojenie dvoch susedných nukleotidov (najčastejšie tymínov) za vzniku diméru. Tieto tymíny zabraňujú DNA-polymeráze replikovať úsek vlákna za týmto dimérom. Tymínové diméry sú odstraňované u baktérií pomocou UvrABC proteínov, analogicky u človeka pôsobia XP proteíny. Najprv UV-citlivá endonukleáza (nazývaná uvrABC excinukleáza) rozpozná dimér a štiepi poškodené vlákno na oboch koncoch diméru. Krátky oligonukleotidový úsek obsahujúci dimér je odstránený, čím vzniká medzera vo vlákne DNA. Táto medzera je nasledovne vyplnená analogicky novo nasysntetizovaným vláknom. V kožných bunkách vystavených slnečnému žiareniu po dlhú dobu, môžu vzniknúť pyrimidínové diméry. Pri vzácnej genetickej chorobe xeroderma pigmentózum (XP) nie sú bunky schopné opravy poškodenej DNA, čo vedie k veľkej akumulácií mutácií a následne k vzniku rýchlych a početných rakovinových procesov. XP môže byť spôsobená defektmi niektorého z génov kódujúcich proteíny potrebné pre nukleotidové opravy poškodení spôsobených UV žiarením. K zámene nukleotidov môže dôjsť buď spontánne (napr. cytosín môže pomaly podliehať samovoľnej deaminácií za vzniku uracilu) alebo pôsobením deaminačných alebo alkylačných činidiel (napr. kyselina dusitá, ktorá v bunke vzniká z prekurzorov, napr. nitrozamíny, nitridy a nitráty, môže spôsobiť deamináciu cytozínu, adenozínu (za vzniku hypoxantínu), alebo guanínu (za vzniku xantínu)). Nukleotidy taktiež môžu byť samovoľne odstránené (deletované) z DNA (približne 10 000 purínových nukleotidov môže byť deletovaných z bunky každý deň). Zámeny alebo odstránenia nukleotidov v DNA môžu byť opravené nasledovným spôsobom. Abnormálne nuklotidy v DNA, ako napr. uracil, môžu vznikať buď deamináciou cytoznu alebo nesprávnym použitím dUTP namiesto dTTP počas syntézy DNA. Tieto nukleotidy sú rozpoznanéšpecifickými glykosylázami, ktoré ich hydrolyticky štiepia od deoxyribźo- fosfátoveho reťazca vlákna DNA. Takto vzniká miesto bez bázy (AP miesto, apyrimidické alebo apurinické). Špecifická AP-endonukleázy rozpoznajú miesto s chýbajúcou bázou a začnú proces opravy vystrihnutím (odstrihne sa len 5 ́-koniec AP miesta) a zaplnením prázdneho miesta. Deoxiribózovo-fosfátová lyáza odstráni jeden cukor-fosfátový zvyšok bez bázy. DNA-polymeráza a DNA-lygáza dokončia proces opravy sntézou správneho nukleotidu. IV/18. Reparace DNA − HR, NHEJ. Žiarenie s vysokou energiou alebo voľné radikály môžu spôsobiť zlomy v dvojzávitnici DNA, ktoré sú pre bunku potenciálne letálne. Tieto zlomy môžu tiež nastať fyziologicky počas génových rekombinácií. Zlomy v dsDNA nemôžu byť opravené predošlými spôsobmi, naopak sa využíva jeden z dvoch špeciálnych systémov. Prvý je nehomologické spájanie koncov (NHEJ), kedy sú konce dvoch fragmentov DNA priložené k sebe špeciálnymi proteínmi, ktoré spôsobia ich opätovné spojenie. Avšak určité množstvo DNA je pri tomto procese stratené, čo môže spôsobiť chyby a mutácie počas tohto procesu. Poruchy opravného systému sú spojené s predispozíciou na rakovinu alebo poškodeniami imunity. Druhý systém, systém opravy pomocou homologickej reparácie (HR), využívajú enzýmy, ktoré bežne sprostredkovávajú geneticku rekombináciu medzi homologickými chromozómami počas meiózy. Tento systém je oveľa menej náchylný na chyby, než prvý systém, lebo stratená DNA je nahradená pomocou homologickej DNA, ktorá slúži ako templát. IV/19. Transkripce prokaryontní a eukaryontní genomové DNA. Transkripční faktory, vazba DNA- protein. Transkripcia a translácia sú prostriedky, ktorými bunka dokáže čítať alebo lepšie povedané exprimovať svoju genetickú informáciu uloženú v génoch. Veľké množstvo rovnakých kópii RNA môže vzniknúť z jedného génu a každá molekula RNA môže riadiť syntézu veľkého množstva rovnakých proteínových molekúl. Pretože každá bunka obsahuje iba jednu až dve kópie určitého génu, toto postupné zväčšovanie umožňuje bunke rýchlo syntetizovať veľké množstvá proteínov, ak je to nevyhnutné. Zároveň však každý gén môže podliehať transkripcii a translácii s rôznou účinnosťou, čím umožňuje bunke produkovať kvantá jedného proteínu a veľmi malé množstvá iného. Okrem toho vie bunka regulovať expresiu každého génu v závislosti na momentálnych potrebách. V prvom kroku bunka vyberie jeden z tisícov génov, ktorý bude exprimovať tým, že skopíruje jeho sekvenciu nukleotidov do RNA. Tento proces sa nazýva transkripcia, lebo aj keď je genetická informácia skopírovaná do inej chemickej zlúčeniny, stále je tá informácia zapísaná v jej pôvodnom jazyku, v sekvencií nukleotidov. Podobne ako DNA aj RNA je lineárnym biopolymérom nukleotidov, no od DNA sa líši vo viacerých smeroch (viac o štruktúrach DNA a RNA a rozdieloch medzi nimi je napísané v otázke IV/9). Každá molekuly DNA v bunke vzniká transkripciou, ktorá je podobná replikácií DNA. Transkripcia začína otvorením a rozpletením krátkeho úseku DNA-dvojzávitnice, čím sa odhalia nukleotidy na každom vlákne. Následne jedno z vláken slúži ako templát pre syntézu RNA. Ribonukleotidy sú postupne pridávané po jednom k rastúcemu reťazcu RNA podobne ako počas replikácie DNA. Poradie nukleotidov v RNA reťazci je podmienené komplementaritou nukleotidov s DNA templátom. Ak sa nukleotid spáruje správne, je kovalentne pripojený k rastúcemu RNA reťazcu enzymatickou reakciou. Reťazec RNA, ktorý vznikol transkripciou (nazývame ho transkript) je preto predlžovaný postupným pridávaním jedného nukleotidu a obsahuje sekvenciu nukleotidov, ktorá je presne komplementárna k templátovému vláknu DNA. Transkripcia sa však od replikácie RNA líši vo viacerých vlastnostiach. Na rozdiel od novo vzniknutého vlákna DNA, vlákno RNA neostáva viazané vodíkovou väzbou k DNA templátu. Naopak, hneď za pridaným nukleotidom sa reťazec RNA odpája a DNA sa naspäť skrúca do dvojzávitnice. Z tohto dôvodu, a kvôli tomu, že sa prepisuje iba jedno vlákno DNA, sú molekuly RNA jednovláknové. Okrem toho, RNA prepisuje iba určitý úsek DNA a tak je jej molekula oveľa menšia (molekula ľudskej DNA môže obsahovať až 250 miliónov báz, pričom RNA obsahuje maximálne iba niekoľko tisíc báz). Enzýmy, ktoré sa zúčastňujú transkripcie sa nazývajú RNA- polymerázy. Podobne ako DNA-polymerázy, ktoré sa zúčastňujú replikácie DNA, RNA-polymerázy katalyzujú vznik fosfodiesterovej väzby, ktorá spája dokopy nukleotidy a vytvára tak základnú kostru molekuly RNA, RNA-polymeráza sa posúva postupne pozdĺž DNA, rozplietava dvojzávitnicu DNA a odhaľuje nový úsek templátového vlákna pre komplementárne párovanie nukleotidov. Takýmto spôsobom sa reťazec RNA predlžuje postupne po jednom nukleotide v smere od 5 ́-konca k 3 ́-koncu. Enzým využíva trifosfáty ribonukleotidov (ATP, CTP, GTP, UTP), ktorých makroergické väzby podávajú reakcii energiu. Takmer okamžité uvoľnenie novo vzniknutého reťazca RNA z DNA umožňuje vzniku veľkého množstva kópií RNA za relatívne krátky čas, syntéza nového reťazca RNA väčšinou začína ešte počas syntézy prvého reťazca RNA. Priemerne veľký gén (povedzme 1500 párov nukleotidov) sa prepíše RNA-polymerázou za cca 50 sekúnd. Na jednom úseku DNA môže naraz pracovať až 15 polymeráz, čím umožňujú vznik viac ako 1000 transkriptov za jednu hodinu, avšak u väčšiny génov sa vytvára o veľa menej transkriptov. Aj napriek tomu, že RNA-polymeráza a DNA-polymeráza katalyzujú v podstate rovnakú chemickú reakciu, existuje medzi nimi niekoľko rozdielov. Prvým je, že RNA polymeráza samozrejme spája ribonukleotidy a nie deoxyribonukleotidy. Za druhé, na rozdiel od DNA-polymerázy, RNA-polymeráza nepotrebuje na začiatok spájania ribonukleotidov prítomnosť priméru. Tento rozdieľ môže byť spôsobený faktom, že transkripcia nie je tak presná ako replikácia DNA. Na rozdiel od DNA, RNA nefunguje ako archív genetickej informácie pre bunku, preto majú chyby v transkriptoch RNA relatívne menší dôsledok. RNA-polymeráza môže praviť chybu s pravdepodobnosťou raz za 10 4 nukleotidov, pričom DNA-polymeráza s pravdepodobnosťou raz za 10 7 nukleotidov. Veľká väčšina génov bunkovej DNA obsahuje informáciu o sekvencií aminokyselín v určitom polypeptide. RNA molekuly, ktoré vznikajú prepisom tohto kódu (a podmieňujú tak proteosyntézu) sa spolu nazývajú messengerová RNA (mRNA). V eukaryotickej bunke každá mRNA typicky nesie informáciu prepísanú z jedného génu a kóduje iba jeden proteín, avšak prokaryotická mRNA väčšinou kóduje viacero rôznych proteínov. Konečným produktom expresie určitých génov môže však byť iný typ RNA. Tieto molekuly RNA sa správajú ako proteíny a teda majú regulačnú, štruktúrnu a enzymatickú funkciu pre bunku a hrajú kľúčové úlohy pre reguláciu eukaryotickej génovej expresie (viac v otázkach IV/16 a IV/19). Ribozomálna RNA (rRNA) vytvára hlavnú štruktúru ribozómov, na ktorých prebieha translácia mRNA, transferová RNA (tRNA) predstavuje prenášač konkrétnej aminokyseliny do ribozómov, kde napomáha ich zaradeniu do proteínu (viac o štrukture a vlastnostiach RNA j v otázke IV/9) Okrem toho existujú aj ďalšie malé molekuly RNA, nazývane microRNA (miRNA), ktoré majú regulačnú funkciu pri určitom procese regulácie génovej expresie (RNA interferencia, otázka IV/15) V najširšom zmysle môžeme génovú expresiu definovať ako proces, pri ktorom je informácia zapísaná v sekvencii nukleotidov DNA preložená do produktu, ktorý má určitý efekt na bunku alebo organizmus. Ak je finálnym produktom proteín, génová expresia zahŕňa aj transkripciu aj transláciu. Ak je produktom molekula RNA, génová expresia nezhŕňa transláciu. Začiatok transkripcie je veľmi dôležitý proces, lebo je to hlavný bod, v ktorom bunka môže rozhodnúť ktoré proteíny alebo molekuly RNA vzniknú a v akom množstve. Aby mohla transkripcia začať, RNA-polymeráza musí byť schopná rozpoznať začiatok génu a naviazať sa pevne na toto miesto DNA. Spôsob rozpoznania začiatku transkripcie RNA- polymerázou sa líši u proakryotov a eukaryotov. Keď sa prokaryotická RNA-polymeráza zrazí s náhodným miestom na DNA, slabo sa naviaže na dvojzávitnicu a začne sa po nej rýchlo kĺzať. Enzým sa tesne uzavrie až potom, čo narazí na úsek nazývaný promotor, ktorý obsahuje špecifickú sekvenciu nukleotidov, ktorá indukuje začiatok syntézy RNA. Hneď ako RNA-polymeráza dosiahne promotoru a naviaže sa pevne na DNA, otvorí sa tým dvojzávitnica a odhalí sekvenciu nukleotidov na oboch vláknach DNA v tomto krátkom úseku. Následne sa jedno z vláken začne chovať ako templát pre naviazanie komplementárnych ribonukleotidov, ktoré sú potom spojené dokopy RNA- polymerázou a vytvoria začiatok reťazca RNA. Predlžovanie (elongácia) RNA pokračuje až kým polymeráza nenarazí na druhý signálny úsek DNA, ktorý sa nazýva terminátor, kde sa polymeráza zastaví a uvoľní templát DNA a novo syntetizovaný RNA reťazec. Podjednotka eukaryotickej RNA-polymerázy, ktorá sa nazýva sigma faktor (σ-faktor) , slúži primárne na rozpoznanie promotoru na DNA. Hneď ako sa polymeráza pevne pripojí na DNA a nasyntetizuje asi 10 nukleotidov RNA, sigma faktor sa uvoľní, čím umožňuje polymeráze sa posúvať ďalej a pokračovať v transkripcii bez neho. Potom, čo je polymeráza uvoľnená z DNA, naviaže si znova sigma faktor a pokračuje v hľadaní nového promotora, kde začne transkripciu znova. Polymeráza vie rozpoznať promotor, aj keď je DNA vo forme dvojzávitnice tým, že rozpozná špecifickú sekvenciu nukleotidov na povrchu dvojzávitnice. Sekvencie nukleotidov typické pre promotor a terminátor sú uvedené na obrázku vedľa. Pretože je DNA dvojvláknová, promotor môže v podstate viesť syntézu dvoch rôznych RNA transkriptov, jedného prepisovaného zľava doprava a druhého sprava doľava. Avšak, promotor je asymetrický a viaže polymerázu iba v jednom smere, takže keď je raz polymeráza naviazaná na promotor, môže prepisovať iba správy reťazec DNA v smere 5 ́→3 ́. Avšak, smer transkripcie sa líši u každého génu na DNA. Pretože na začatie transkripcie je potrebná pevná väzba RNA- polymerázy na vlákno DNA, konkrétny úsek DNA bude prepísaný iba, ak nasleduje za promotorovou sekvenciou, čo zabezpečuje, že budú prepísané iba tie časti DNA, ktoré obsahujú gén. Väčšina princípov prokaryotickej transkripcie sa uplatňuje aj pri eukaryotickej transkripcii. Avšak, začiatok eukaryotickej transkripcie sa od tej prokaryotickej v určitých bodoch líši. Prvý rozdiel je v samotnej RNA-polymeráze, kým prokaryoty obsahujú jeden typ polymerázy, eukaryoty obsahujú tri – RNA-polymeráza I, RNA-polymeráza II, RNA-polymeráza III. Tieto polymerázy sú zodpovedné za transkripciu rôznych typov génov. RNA-polymerázy I a III prepisujú kódy pre tRNA, rRNA a malé molekuly RNA so špeciálnymi funkciami pre bunku. RNA-polymeráza II prepisuje veľkú väčšinu eukaryotických génov, ktoré kódujú bielkoviny. Druhý rozdiel je v tom, že prokaryotická polymeráza (za prítomnosti sigma faktoru) je schopná začať transkripciu sama, avšak eurkaryotická polymeráza vyžaduje prítomnosť viacerých prídavných proteínov. Zásadne sú všeobecné transkripčné faktory, ktoré sa musia spojiť s promotorom predtým ako ním prejde polymeráza a mohla tak začať transkripciu. Tretí rozdiel je, že proces kontroly začiatku transkripcie je ďaleko viac prepracovaný ako u prokaryótov. V prokaryotickej DNA sú gény väčšinou usporiadané veľmi tesne vedľa seba s veľmi krátkymi úsekmi neprepisovanej DNA medzi sebou, pričom u eukaryotov môže byť úsek medzi jednotlivými génmi dlhý až 100 000 nukleotidov. Toto postavenie umožňuje každému génu byť kontrolovaný takmer nekonečným množstvom regulačných sekvencií roztrúsených po dĺžke DNA. Toto dovoľuje eukaryotickej DNA zapájať sa do komplexnejších regulačných mechanizmov. Posledným rozdielom je, že polymeráza musí pri začiatku transkripcie brať v úvahu zbalenie eukaryotickej DNA do nukleozómov a vytváranie komplexnejších chromatínových štruktúr. Zistenie, že eukaryotická polymeráza II nevie sama o sebe začať proces transkripcie, viedlo k objaveniu a popísaniu všeobecných transkripčných faktorov. Tieto prídavne proteíny sa pripájajú na promotor, kde umiestnia RNA-polymerázu, rozpletú dvojzávitnicu a odštartujú polymerázu. Na obrázku vedľa je ukázané ako tieto faktory pripájajú na promotor pomocou RNA-polymerázy. Proces pripájania typicky začína naviazaním faktoru TFIID na krátku dvojzávitnicovú sekvenciu, ktorá primárne pozostáva z T a A nukleotidov, preto sa nazýva aj TATA box. Potom ako sa naviaže na DNA, TFIID spôsobí dramatickú lokálnu deformáciu DNA, ktorá slúži ako označenie miesta nasledovnej väzby ďalších proteínov na promotor. TATA box je hlavnou zložkou väčšiny promotorov, ktoré číta RNA-polymeráza II a je typicky uložený 25 nukleotidov pred začiatkom transkripcie. Potom, čo sa na tento úsek DNA naviaže prvý faktor, je umožnené naviazanie ďalších faktorov spolu s RNA-polymerázou II za vzniku kompletného transkripčného iniciačného komplexu. Potom, čo bola polymeráza naviazaná na promotor v transkripčnom iniciačnom komplexe, musí byť uvoľnená z komplexu transkripčných faktorov, aby mohla začať prepisovať DNA. Kľúčovým procesom pri jej uvoľnení je naviazanie fosfátov na „chvost“ (tail) RNA-polymerázy. Tento proces je sprostredkovaný faktorom TFIIH, ktorý obsahuje enzým proteín kinázu ako jednu zo svojich podjednotiek. S najväčšou pravdepodobnosťou táto fosforilácia pomáha polymeráze sa uvoľniť zo zhluku transkripčných faktorov, čím umožňuje začať transkripciu. Keď transkripcia začne, tak sú transkripčné faktory uvoľnené z DNA a je tak možné ich znova použiť na začiatok ďalšej transkripcie s novou polymerázou. Keď RNA-polymeráza dokončí transkripciu a je uvoľnená z DNA, fosfátové skupiny sú uvoľnené z chvosta pomocou enzýmov fosfatáz a sú ďalej použité pri ďalšej transkripcií. Iba defosforilovná forma RNA-polymerázy dokáže začať ďalšiu transkripciu. Aj keď transkripcia DNA do RNA prebieha rovnako u takmer všetkých organizmov, spôsob akým sú RNA transkripty upravované predtým, ako sú použité v bunke sa veľmi líši medzi eukaryotickou a prokayotickou bunkou. Prokaryotická DNA leží voľne v cytoplazme v blízkosti ribozómov, kde prebieha proteosyntéza. Hneď ako vznikne prokaryotická mRNA, je prichytená svojim voľným 5 ́-koncom na ribozómy a proteosyntéza začína okamžite. Eukaryotické bunky však majú DNA uzavretú v jadre. Transkripcia prebieha v jadre, ale proteosyntéza však prebieha na ribozómoch v cytoplazme. Predtým, ako môže byť mRNA prekladaná, musí byť transportovaná z jadra pomocou malých pórov v jadrovom obale. Predtým ako opustí jadro, musí mRNA podliehať určitým úpravám. Tieto reakcie prebiehajú počas transkripcie RNA Potrebné enzýmy sú naviazané na chvost RNA-polymerázy a počas transkripcie sú uvoľňované z RNA- polymerázy. V závislosti do typu vznikajúcej RNA, transkripty sú upravované rôznym spôsobom, než sú uvoľnené z jadra. Dve základné úpravy, ktorým podlieha iba budúca mRNA sú pridanie čepičky (cupping) a polyadenilácia. Pridanie čepičky je modifikácia 5 ́-konca primárneho transkriptu (koniec, ktorý je syntetizovaný ako prvý), pri ktorej dôjde k naviazaniu atypického nukleotidu (guanínový nukleotid s naviazanou metylovou skupinou). K tomuto procesu dochádza zvyčajne ešte predtým, ako je dokončená transkripcia. K polyadenilácií dochádza u väčšiny novo transkribovanej mRNA na jej 3 ́-konci. U väčšiny eukaryotickej mRNA je 3 ́- koniec najskôr naštiepený na špeciálnom mieste nukleázou a potom je druhým enzýmom pridaná sekvencia zložená iba z adenínov (polyA-koniec), ktorý je väčšinou niekoľko stoviek nukleotidov dlhý. Tieto modifikácie pravdepodobne stabilizujú molekulu RNA a pomáhajú pri jej transporte z jadra do cytoplazmy. Neskôr sú tiež využívané proteosyntetickým aparátom ako signál, že mRNA má obe konce a že obsahuje komplementárnu informáciu. Okrem týchto úprav podlieha väčšina RNA ďalšej úprave, ktorá je však radikálnejšia ako už spomenuté úpravy. Ide o dôsledok špecifického usporiadania eukaryotických génov, ktoré sú od seba oddelené dlhými nekódujúcimi sekvenciamim ktoré sa nazývajú intróny. Kódované sekvencie, nazývané exóny sú často kratšie ako intróny a preto je kódujúca sekvencia iba malou časťou celkovej dĺžky génu. Intróny môžu dosahovať dĺžok od jedného po 10 000 nukleotidov. Na vznik mRNA je potrebný prepis celkovej dĺžky génu, intrónov aj exónov, do transkripu RNA. Po základných úpravách RNA nastáva proces zostrihu RNA (RNA splicing), pri ktorom sú všetky intróny z vystrihnuté a exóny spojene dokopy za vzniku o veľa kratšej molekuly RNA s neprerušovanou kódujúcou sekvenciou. Po tomto kroku je mRNA transportovaná do cytoplazmy a následne prekladaná na proteíny. Na rozdiel od kódujúcej sekvencie je väčšina sekvencie intrónov nevyužiteľná. Aj keď je medzi rôznymi intrónmi určitá podobnosť v sekvencií, iba niekoľko málo nukleotidov určuje, že práve túto konkrétnu časť je potrebné z RNA odstrániť. Tieto rozhodujúce nukleotidy sa nachádzajú na koncoch intrónov alebo v jeho blízkosti a sú veľmi pdobné pre všetky intróny. Intróny sú odstraňované pomocou enzýmov, ktoré na rozdiel od ostatných sú zložené z proteínov a RNA. Tieto malé zostrihové enzýmy sa nazývajú malé jadrové ribonukleoproteinové častice (snRNP). Pri každom intróne sa vytvorí komplex zložený z niekoľkých druhov týchto snRNP a umožní vystrihnutie intrónu a spojenie dvoch susedných exonových úsekov. Intrón je zostrihom uvoľnený vo forme „lasovitej štruktúry“. Jednou z úloh RNA v snRNP je na základe komplementarity rozpoznať začiatok intrónu a miesto uzatvorenia lasovitej štruktúry. Po naviazaní na tieto miesta sa snRNP spojí do jedného komplexu a priblížia sa tým obe konce intrónu k sebe. Aj keď snRNP hraje pri odstrihnutí hlavnú úlohu, pre odstrihnutie sú nevyhnutné aj niektoré ďalšie proteíny. Intrón-exónové usporiadanie génov sa na prvý pohľad môže zdať ako zbytočné plytvanie, ale koniec koncov má pozitívne dôsledky. Za prvé, transkripty mnohých génov môžu byť zostrihnuté rôznym spôsobom, čím môžu produkovať rozdielne bielkoviny. Tieto alternatívne zostrihy tak umožňujú rôznym proteínom vzniknúť z jedného génu, čím sa zvyšuje kódovací potenciál génomu. Zostrih RNA má ďalšiu výhody pre bunku. Toto usporiadane génov bolo zrejme dôležité v ranných štádiách evolúcie, pretože mohlo urýchliť vznik nových užitočných proteínov. Prítomnosť intrónov v DNA umožňuje väčšiu pravdepodobnosť rekombinácie medzi exónmi, čo znamená, že gény pre nové proteíny mohli vznikať rýchlejšie použitím častí už existujúcich génov (podobne ako môžeme postaviť nový stroj z funkčných súčiastok starého stroja). Veľa proteínov dnešných buniek pripomína zlepenec zložený zo sady niekoľkých rovnakých kúskov nazývaných proteínové domény. Transport mRNA z jadra do cytoplazmy je veľmi selektívny a iba správne upravené molekuly RNA môžu prejsť cez nukleárny pórový komplex, ktorý rozpoznáva a exportuje iba kompletné mRNA (slúži ako vráta a kontroluje, ktoré makromolekuly stúpia alebo vystúpia z jadra). Aby bola mRNA pripravená na export, musí byť naviazaná na správny komplex proteínov, ktoré označujú hotovú mRNA. RNA, ktorá neprejde, ostáva v jadre a je degradovaná a jej nukleotidy sú znovu použité na transkripciu. Pretože jedna molekula mRNA môže byť prekladaná viac krát, dĺžka jej „života“ v bunke ovplyvňuje množstvo bielkovín, ktoré vyprodukuje. Molekula mRNA je potom degradovaná na nukleotidy pomocou RNAázami. Polčasy jednotlivých mRNA sa líšia v závislosti od sekvencie nukleotidov a od typu bunky, v ktorej je produkovaná. Väčšina prokaryotickej RNA má krátky polčas, okolo 3 minút. Eukaryotické RNA väčšinou žijú dlhšie – určité transkripty majú polčas okolo 10 hodín (napr. tie, čo kódujú β-globín) a iné majú polčas priemerne okolo 30 minút. Tieto polčasy sú signalizované v samotnej sekvencií nukleotidov, väčšinou v časti nazývanej 3 ́-neprekladaná oblasť, ktorá sa nachádza medzi 3 ́-kódujúcou sekvenciou a polyA-koncom. Odlišná dĺžka existencie rôznych RNA pomáha bunke regulovať množstvo jednotlivých vznikajúcich proteínov. Všeobecne, proteíny syntetizované vo veľkých množstvách (napr. β-globín) sú prekladané z RNA s dlhým polčasom, zatiaľ čo proteíny potrebné iba v malom množstve alebo proteíny, ktorých množstvo je treba rýchlo regulovať podľa rôznych signálov, majú RNAs krátkou dobou života. IV/20. Struktura mRNA, posttranskripční úpravy (cap, poly A, splicing). Messengerová (mediatorová) RNA zaberá iba 5% celkovej RNA v bunke a je určite najrôznorodejším typom RNA v zmysel veľkosti a sekvencie nukleotidov. mRNA prenáša genetickú informáciu z DNA v jadre do cytoplazmy, kde je použitá ako templát pre syntézu proteínov. Ak mRNA nesie informáciu z viac ako jedného génu, označujeme ju ako polycistronickú. Polycistronické mRNA sú typické u prokaryotov. Ak mRNA nesie informáciu iba z jedného génu, označujeme ju ako monocistronickú a je typická u eukaryotov. Okrem úsekov, ktoré kódujú proteíny a môžu podliehať translácii, mRNA obsahuje na svojich 3 ́ a 5 ́ koncoch aj úseky, ktoré nepodliehajú translácii. Medzi špeciálne štruktúrne úseky eukaryotickej (ale nie prokaryotickej) mRNA patrí dlhá sekvencia adenínových nukleotidov (poly-A tail) na 3 ́-konci RNA reťazca a „čepička“ na 5 ́-konci, ktorá sa skladá z molekuly 7-metylguanozínu pripojenému k RNA „naopak“ (5 ́→5 ́) pomocou trifosfátového spojenia. Okrem týchto úprav podlieha väčšina RNA ďalšej úprave, ktorá je však radikálnejšia ako už spomenuté úpravy. Ide o dôsledok špecifického usporiadania eukaryotických génov, ktoré sú od seba oddelené dlhými nekódujúcimi sekvenciamim ktoré sa nazývajú intróny. Kódované sekvencie, nazývané exóny sú často kratšie ako intróny a preto je kódujúca sekvencia iba malou časťou celkovej dĺžky génu. Intróny môžu dosahovať dĺžok od jedného po 10 000 nukleotidov. Na vznik mRNA je potrebný prepis celkovej dĺžky génu, intrónov aj exónov, do transkripu RNA. Po základných úpravách RNA nastáva proces zostrihu RNA (RNA splicing), pri ktorom sú všetky intróny z vystrihnuté a exóny spojene dokopy za vzniku o veľa kratšej molekuly RNA s neprerušovanou kódujúcou sekvenciou. Po tomto kroku je mRNA transportovaná do cytoplazmy a následne prekladaná na proteíny. Na rozdiel od kódujúcej sekvencie je väčšina sekvencie intrónov nevyužiteľná. Aj keď je medzi rôznymi intrónmi určitá podobnosť v sekvencií, iba niekoľko málo nukleotidov určuje, že práve túto konkrétnu časť je potrebné z RNA odstrániť. Tieto rozhodujúce nukleotidy sa nachádzajú na koncoch intrónov alebo v jeho blízkosti a sú veľmi pdobné pre všetky intróny. Intróny sú odstraňované pomocou enzýmov, ktoré na rozdiel od ostatných sú zložené z proteínov a RNA. Tieto malé zostrihové enzýmy sa nazývajú malé jadrové ribonukleoproteinové častice (snRNP). Pri každom intróne sa vytvorí komplex zložený z niekoľkých druhov týchto snRNP a umožní vystrihnutie intrónu a spojenie dvoch susedných exonových úsekov. Intrón je zostrihom uvoľnený vo forme „lasovitej štruktúry“. Jednou z úloh RNA v snRNP je na základe komplementarity rozpoznať začiatok intrónu a miesto uzatvorenia lasovitej štruktúry. Po naviazaní na tieto miesta sa snRNP spojí do jedného komplexu a priblížia sa tým obe konce intrónu k sebe. Aj keď snRNP hraje pri odstrihnutí hlavnú úlohu, pre odstrihnutie sú nevyhnutné aj niektoré ďalšie proteíny. Intrón-exónové usporiadanie génov sa na prvý pohľad môže zdať ako zbytočné plytvanie, ale koniec koncov má pozitívne dôsledky. Za prvé, transkripty mnohých génov môžu byť zostrihnuté rôznym spôsobom, čím môžu produkovať rozdielne bielkoviny. Tieto alternatívne zostrihy tak umožňujú rôznym proteínom vzniknúť z jedného génu, čím sa zvyšuje kódovací potenciál génomu. Zostrih RNA má ďalšiu výhody pre bunku. Toto usporiadane génov bolo zrejme dôležité v ranných štádiách evolúcie, pretože mohlo urýchliť vznik nových užitočných proteínov. Prítomnosť intrónov v DNA umožňuje väčšiu pravdepodobnosť rekombinácie medzi exónmi, čo znamená, že gény pre nové proteíny mohli vznikať rýchlejšie použitím častí už existujúcich génov (podobne ako môžeme postaviť nový stroj z funkčných súčiastok starého stroja). Veľa proteínov dnešných buniek pripomína zlepenec zložený zo sady niekoľkých rovnakých kúskov nazývaných proteínové domény. Transport mRNA z jadra do cytoplazmy je veľmi selektívny a iba správne upravené molekuly RNA môžu prejsť cez nukleárny pórový komplex, ktorý rozpoznáva a exportuje iba kompletné mRNA (slúži ako vráta a kontroluje, ktoré makromolekuly stúpia alebo vystúpia z jadra). Aby bola mRNA pripravená na export, musí byť naviazaná na správny komplex proteínov, ktoré označujú hotovú mRNA. RNA, ktorá neprejde, ostáva v jadre a je degradovaná a jej nukleotidy sú znovu použité na transkripciu. Pretože jedna molekula mRNA môže byť prekladaná viac krát, dĺžka jej „života“ v bunke ovplyvňuje množstvo bielkovín, ktoré vyprodukuje. Molekula mRNA je potom degradovaná na nukleotidy pomocou RNAázami. Polčasy jednotlivých mRNA sa líšia v závislosti od sekvencie nukleotidov a od typu bunky, v ktorej je produkovaná. Väčšina prokaryotickej RNA má krátky polčas, okolo 3 minút. Eukaryotické RNA väčšinou žijú dlhšie – určité transkripty majú polčas okolo 10 hodín (napr. tie, čo kódujú β-globín) a iné majú polčas priemerne okolo 30 minút. Tieto polčasy sú signalizované v samotnej sekvencií nukleotidov, väčšinou v časti nazývanej 3 ́- neprekladaná oblasť, ktorá sa nachádza medzi 3 ́-kódujúcou sekvenciou a polyA-koncom. Odlišná dĺžka existencie rôznych RNA pomáha bunke regulovať množstvo jednotlivých vznikajúcich proteínov. Všeobecne, proteíny syntetizované vo veľkých množstvách (napr. β-globín) sú prekladané z RNA s dlhým polčasom, zatiaľ čo proteíny potrebné iba v malom množstve alebo proteíny, ktorých množstvo je treba rýchlo regulovať podľa rôznych signálov, majú RNAs krátkou dobou života. Aj keď transkripcia DNA do RNA prebieha rovnako u takmer všetkých organizmov, spôsob akým sú RNA transkripty upravované predtým, ako sú použité v bunke sa veľmi líši medzi eukaryotickou a prokayotickou bunkou. Prokaryotická DNA leží voľne v cytoplazme v blízkosti ribozómov, kde prebieha proteosyntéza. Hneď ako vznikne prokaryotická mRNA, je prichytená svojim voľným 5 ́-koncom na ribozómy a proteosyntéza začína okamžite. Eukaryotické bunky však majú DNA uzavretú v jadre. Transkripcia prebieha v jadre, ale proteosyntéza však prebieha na ribozómoch v cytoplazme. Predtým, ako môže byť mRNA prekladaná, musí byť transportovaná z jadra pomocou malých pórov v jadrovom obale. Predtým ako opustí jadro, musí mRNA podliehať určitým úpravám. Tieto reakcie prebiehajú počas transkripcie RNA Potrebné enzýmy sú naviazané na chvost RNA- polymerázy a počas transkripcie sú uvoľňované z RNA-polymerázy. V závislosti do typu vznikajúcej RNA, transkripty sú upravované rôznym spôsobom, než sú uvoľnené z jadra. Dve základné úpravy, ktorým podlieha iba budúca mRNA sú pridanie čepičky (cupping) a polyadenilácia. Pridanie čepičky je modifikácia 5 ́-konca primárneho transkriptu (koniec, ktorý je syntetizovaný ako prvý), pri ktorej dôjde k naviazaniu atypického nukleotidu (guanínový nukleotid s naviazanou metylovou skupinou). K tomuto procesu dochádza zvyčajne ešte predtým, ako je dokončená transkripcia. K polyadenilácií dochádza u väčšiny novo transkribovanej mRNA na jej 3 ́-konci. U väčšiny eukaryotickej mRNA je 3 ́-koniec najskôr naštiepený na špeciálnom mieste nukleázou a potom je druhým enzýmom pridaná sekvencia zložená iba z adenínov (polyA-koniec), ktorý je väčšinou niekoľko stoviek nukleotidov dlhý. Tieto modifikácie pravdepodobne stabilizujú molekulu RNA a pomáhajú pri jej transporte z jadra do cytoplazmy. Neskôr sú tiež využívané proteosyntetickým aparátom ako signál, že mRNA má obe konce a že obsahuje komplementárnu informáciu IV/21. RNA interference, druhy a funkce nekódujících RNA. RNA interferencia (RNAi) je mechanizmus génovej represie pomocou zníženej expresie mRNA, buď spomalením translácie alebo zrýchlením jej degradácie. RNA interferencia zrejme hraje kľúčovú úlohu pri zásadných procesoch ako je bunková proliferácia, diferenciácia alebo apoptóza. RNAi je sprostredkovaná krátkymi (cca 22 bp), nekódujúcimi molekulami RNA, nazývanými microRNA (miRNA), ktoré vznikajú z oveľa dlhších, geneticky kódovaných transkriptov, primárnej miRNA (pri-miRNA) ktoré sú čiastočne rozdelené v jadre na pre- miRNA endonukleázou (Drosha) a potom transportované do cytoplazmy. V cytoplazme endonukleáza (Dicer) dokončí delenie a vytvorí krátke dvojvláknové (ds) miRNA. Jedno vlákno (vedúce vlákno) ds miRNA sa spája s cytoplazmatickým proteínovým komplexom nazývaným RNA-indukujúci tlmivý komplex (RISC). Hybridy komplexného vlákna s komplementárnou sekvenciou v celej dĺžke „zaútočia“ na mRNA, čím sa naviaže RISC na mRNA. Tento proces spôsobí represu translácie na mRNA alebo jej degradáciu endonukleázou (Argonaute/Ago/Slicer) RISC. Zdá sa, že podmieňujúcim faktorom je zväčšená komplementarita. RNAi môže byť tiež spustená pomocou krátkych ds interferúcimi molekulami RNA (siRNA), ktoré sa dostanú do bunky z vonkajších zdrojov (u chordát je ich funkcia však nejasná). Modulácia génovej expresie pomocou RNAi, využívajúcej siRNA má obrovský terapeutický potenciál. Prvé využitie liečebnej RNAi bolo pri liečbe pacientov s neovaskulárnou formou stareckej makulárnej degradácie (AMD), hlavnej príčiny slepoty u dospelých. Neovaskulárna AMD je spustená nadbytočnou produkciou vaskulárneho endotelového rastového faktora (VEGF), čo spôsobuje rast nadbytočných ciev za sietnicou. Nadbytočné cievy spôsobujú rozptyl, zahmlievanie až úplnú stratu zraku (preto sa neovaskulárna AMD nazýva aj „vlhká“ makulárna degradácia). Využitie siRNA vyrobenej na napadnutie mRNA VEGF a následnú jeho degradáciu našlo klinické uplatnenie. I keď bolo vynaložené úsilie a prostriedky na výrobu RNAi liečiv (hlavne v liečbe rakoviny), zatiaľ žiadne produkty nie sú dostupné. Rozvoj bol spomalený problémami s presnosťou napádania a stabilitou. Využitie nano-vektorov (napr. lipozómov) môže odstrániť tieto problémy. Výskum využitia RNAi však napreduje. Nekódujúce RNA (v zmysle proteín-nekódujúce) sú všetky funkčné molekuly RNA, ktoré nie sú prekladané do sekvencie aminokyselín procesom translácie. Všeobecne ich rozdeľujeme podľa veľkosti na RNA kratšie ako 200 nukleotidov alebo dlhšie ako 200 nukleotidov. Medzi RNA kratšie ako 200 nukleotidov patria tRNA (transferová RNA, viac otázka IV/12), rRNA (ribozomálna RNA, viac otázka IV/12), snRNA (malá jaderná RNA – small nuclear RNA; podieľa sa napr. na zostrihu mRNA), snoRNA (malé jadérkové RNA – small nucleolar RNA; má dôležitú úlohu pri syntéze a maturácii rRNA, snRNA, tRNA) a skupina regulačných RNA – napr. mikroRNA (podieľa sa na regulácii génovej expresie – sú komplementárne k určitým úsekom mRNA, viažu sa na nich a tým regulujú ich transláciu), siRNA (malé interferujúce RNA – small interfering RNA; podieľa sa na RNA interferencii), piRNA (piwi-interacting RNA; interaguje s proteínmi z rodiny PIWI). RNA dlhšie ako 200 nukleotidov sa tiež označujú ako lncRNA (dlhé nekódujúce RNA – long non-coding RNA), ktorých najznámejším zástupcom je transkript génu XIST (X Inactivation Specific Transcript), ktorý sa zúčasťnuje procesu inaktivácie chromozómu X (viac otázka IV/38). IV/22. Regulace genové exprese na úrovni transkripce. Významným kontrolným bodom expresie génov je iniciácia transkripcie. Transkripčne inaktívna DNA je súčasťou vysoko kondenzovanej chromatínovej štruktúry v chromozóme. Štruktúra chromozómu musí byť pred transkripciou reverzibilne upravená do konformácie umožňujúcej naviazanie RNA-polymerázy na DNA, ktoré je pre zahájenie transkripcie nevyhnutné. Zmena konformácie chromatínu je umožnená modifikáciou histónov a remodeláciou chromatínu. Históny sú súčasťou nukleozomov. Ich modifikácia spočíva v acetylácii a deacetylácii. Enzýmy acetyltransferázy katalyzujú pridanie acetylových skupín k aminoskupinám bočných reťazcov lyzínových zvyškov histónových oktamérov. V dôsledku toho je zredukovaná afinita medzi histónmi a DNA a oblasť promotoru génu sa stáva prístupnejšou pre klomplex transkripčných faktorov a RNA-polymerázy. Deacetylácia histónov vyvolá opačný efekt (pôsobením deacetyláz) – spôsobuje potlačenie transkripcie. K aktivácii alebo represii transkripcie prispieva aj metylácie histónov pôsobením enzýmov metylotransferáz. Metylácia arginínových zvyškov histónov má za následok aktiváciu transkripcie, metylácie lyzínu transkripciu potlačuje. Tieto modifikácie prispievajú k remodelácii chromatínu spolu s účasťou ďalších proteínov a dočasne menia štruktúru nukleozomu. Regulácia transkripcie sa uskutočňuje predovšetkým interakciou špecifických sekvencii promotoru génu viažucich sa na DNA – transkripčných faktorov (TF). Regulačné sekvencie sú umiestnené v rôznej vzdialenosti od začiatku transkripcie, ale na rovnakej molekule DNA alebo RNA, tzn., že pracujú v pozícii cis (odtiaľ pochádza názov cis elementy). Transkripčné faktory sa syntetizujú v cytoplazme, pôsobia však v jadre a musia preto migrovať do miesta určenia. Základné transkripčné faktory sa viažu na DNA promotoru v mieste sekvencie TATA. Tvoria komplex, ktorého úlohou je lokalizovať RNA-polymerázu do správnej pozície a iniciovať tak transkripciu. Účinnosť transkripcie závisí na ďalších špecifických transkripčných faktoroch, ktoré sa môžzu viazať na ďalšie signálne sekvencie v promotore a môžu interagovať s transkripčným iniciačným komplexom a posilniť jeho stabilitu. Medzi špecifické transkripčné faktory patria napr. tkanivovo špecifické sekvencie nazývané enhancery (zosilňovače), ktoré veľmi účinne stimulujú transkripciu. Sú väčšinou umiestnené mimo promotor génu, často vo veľkej vzdialenosti po prúde od začiatku transkripcie. Silencery sú sekvencie, ktoré transkripciu naopak inhibujú. Transkripčné faktory (TF) tvoria veľkú rodinu proteínov, ktoré môžu pozitívne alebo negatívne ovplyvňovať transkripciu. Väčšinou fungujú ako homodiméry, menej často vytvárajú heterodiméry odlišných transkripčných faktorov. Obsahujú niekoľko funkčne dôležitých domén. Medzi základné funkčné domény transkripčných faktorov patrí doména pre väzbu s DNA, dimerizačná domény a aktivačná doména. Aktivačná doména aktivuje vznik transkripčného komplexu potom, čo sa TF viaže na signálnu sekvenciu génu. Doména pre väzbu DNA obsahuje niekoľko charakteristických konzervovaných štruktúr, tzv. motívov. Všetky používajú α-helixy, ktoré zapadajú do veľkého žliabku DNA. TF sú klasifikované podľa typu domény pre väzbu s DNA a podľa génov, ktorých expresiu ovplyvňujú. Motívy v doméne pre väzbu DNA:  Motív helix-turn- helix (špiírala-otočka-špirála). Je tvorený dvomi α-helixami, oddelenými β otáčkou a vytvárajú diméry. Jeden z helixov sa viaže na DNA v oblasti veľkého žliabku. Príkladom proteínu s týmto motívom sú transkripčné faktory, ktoré obsahujú homodomény, ktoré sú kódované vysoko konzervovanými génmi (homeobox gény). Podieľajú sa na regulácii diferenciácie a hrajú preto významnú úlohu v embryonálnom vývoji.  Motív zinkových prstov. Motív je tvorený smičkou aminokyselín pripevnených na bázu dvomi cysteínmi a dvomi histidínmi, ktoré sú viazané prostredníctvom atómu zinku – odtiaľ je názov motívu. Zinkové prsty vytvárajú homodiméry aj zložitejšie štruktúry. Úsek aminokyselín interaguje s DNA prostredníctvom veľkého žliabku. Podobný motív tvorený 4 cysteínmi spojenými atómom zinku sa uplatňuje napr. v transkripčných faktoroch regulujúcich receptor steroidných hormónov.  Motív leucínového zipu. Leucínové zipy sú bohaté na zvyšky leucínu, každá siedma aminokyselina je lucín. Na DNA sa viažu ako diméry. Dimerizácia nastáva interakciou medzi hydrofóbnymi povrchmi dvoch leucínových zipov. Príležitostne môžu tvoriť heterodiméry, čo môže podstatne zvýšiť variabilitu regulácie transkripcie.  Motív helix-loop-helix (špirála-smyčka-špirála). Dimerizačná doména obsahuje 2 α-helixy spojené smyčkou. Dimerizácia nastáva interakciou medzi hydrofóbnymi aminokyselinami prítomnými na jednej strane karboxylového konca helixu. Môžu tvoriť homodiméry aj heterodiméry a viazať sa na DNA. Aktivačné domény nie sú charakterizované konkrétnymi motívmi. Bolo zistené, že sú tu prítomne oblasti bohaté na určité aminokyseliny (napr. glutamín alebo prolín). Pomerne vysoké percento génov transkribovaných RNA-polymerázou II vykazuje tkanivovo špecifickú expresiu pôsobením tkanivovo špecifických transkripčných faktorov, enhencerov a silencerov. Enhancer sa v dôsledku vytvorenia kľučky DNA priblíži promotoru a naviaže sa na neho prostredníctvom špeciálnych proteínov. Táto väzba bráni napojeniu RNA-polymerázy II na promotor. Následne sa v dôsledku pôsobenia signálnych molekúl alebo ďalších špecifických proteínov zmení konformácia celého komplexu, promotor je uvoľnený pre RNA-polymerázu II a transkripcia sa zahajuje. Iniciácia transkripcie rRNA génov je regulovaná väzbou 2 transkripčných faktorov na promotorové sekvencie, a to na sekvenciu v mieste začiatku transkripcie a sekvenciu vzdialenú 100 nukleotidov proti prúdu od štartovacej pozície. Transkripcia tRNA je umožnená väzbou TF na promotorové sekvencie a väzbou ďalších faktorov na koniec RNA-polymerázy III. Vývoj a prežitie mnohobunkových organizmov závislí na dokonalej koordinácii všetkých jej buniek. Koordinácia je zaistená signálnymi molekulami, ktoré sa k bunkám dostávajú rôznymi cestami. Bunky endokrinných žliaz secernujú svoje produkty (hormóny) do krvného obehu a môžu tak ovplyvňovať aj bunky vo vzdialených častiach organizmu. Parakrinné bunky secernujú látky difundujú len do blízkeho okolia (napr. bunky v GIT). Produkty autokrinných buniek ovplyvňujú spätne činnosť tej istej bunky, ktorá ich syntetizuje. Pre reguláciu sprostredkovanú signálnymi molekulami platí niekoľko spoločných zásad:  Signálne molekuly ovplyvňujú len cieľové bunky, vybavené špecifickými membránovými alebo cytoplazmatickými receptormi, kaskádou pre prenos signálu v cytoplazme a špecifickými transkripčnými faktormi v jadre. Mutácia génu pre akúkoľvek zo zúčastnených proteínov (receptory, enzýmy, TF) môže prerušiť prenos informácie a prejaviť sa vo fenotype ako stratová mutácia. Alebo naopak môže mutácia spôsobiť trvalú expresiu génu, ako je známe napr. v procese kancerogenézy.  Rôzne cieľové bunky môžu reagovať špecificky na rovnakú signálnu molekulu. Reakcia bunky závisí na prenose signálu systémom bunky.  Niektoré signálny molekuly sú prítomné v obehu trvalo, iné len nárazovo. Množstvo signálnych molekúl (napr. hormónov) je spravidla riadené spätnou väzbou. Signálne molekuly naviazané na receptory sú rýchlo odbúravané, čo zaisťuje pružnosť reakcie Tu sa zoznámime s mechanizmami prenosu signálov pre reguláciu funkcie génu hormónmi. Hormóny ovplyvňujú charakteristiky a funkcie cieľových buniek aktiváciou transkripcie špecifických génov. Sú to malé molekuly steroidné (estrogény, glukokortikoidy) alebo peptidovej povahy (napr. inzulín). Hormóny je možné rozlíšiť do troch základných skupín:  hydrofóbne (vo vode nerozpustné, rozpustné v tukoch) – napr. steroidy – testosteron, kortikoidy, etc.  hydrofilné (vo vode rozpustné) – napr. peptidové hormóny – napr. oxytocín, inzulín,...  amíny – napr. adrenalín 1. Mechanizmus účinku hydrofóbných hormónov. Hormóny rozpustné v tukoch (steroidy) majú relatívne malé hydrofóbne molekuly vzniknuté metabolizovaním cholesterolu. Telovými tekutinami môžu byť transportované len vo väzbe na špecifické hydrofilné bielkovinové transportéry. Bunkovou membránou prechádzajú ľahko po odpojení z transportéra. V bunke sa viažu na intracelulárne receptory v cytoplazme alebo jadre. Komplex hormón-receptor prechádza pórmi jadrového obalu, receptory sa však väčšinou vracajú do cytoplazmy. V jadre sú prítomné hormonálne jadrové receptory, ktoré vytvárajú superrodinu receptorov a fungujú ako inducibilné transkripčné faktory. Po naviazaní hormónu sa receptorový proteín pripája k špecifickej sekvencii DNA v promotorovej oblasti cieľových génov a aktivuje ich transkripciu. Syntéza proteínov potom buď priamo ovplyvňuje aktivitu bunky alebo je proteín secerovnovaný a pôsobí na cieľové bunky. Nezmenená molekula receptoru bez naviazania hormónuexpresiu génu neovplyvní. V cytozole je prítomný inhibičný proteín, ktorý sa v neprítomnosti hormónu viaže na doménu pre receptor hormónu a vytvorí komplex, ktorý nepreniká do jadra. 2. Mechanizmus pôsobenia hydrofilných hormónov. Hydrofilné hormóny (peptidové hormóny) môžu byť transportované telovými tekutinami bez transportérov. Nemôžu samostatne prechádzať bunkovou membránou, viažu sa na špecifické receptory na povrchu buniek. Receptor podstupuje konformačnú zmenu, aktivuje sa prenáša signál prostredníctvom ďalších molekúl v bunke. Množstvo receptorov má vlastnú proteinkinázovú aktivitu alebo aktivuje intracelulárne proteinkinázy. Prenos signálu do jadra bunky je sprostredkovaný fosforylačnou kaskádou proteínov a sekundárnymi intracelulárnymi molekulami (druhí poslovia). Aktivované proteinkinázy fosforylujú cieľové transkripčné faktory, ktoré v jadre umožňujú transkripciu cieľových faktorov. Okrem mechanizmov, ktoré umožňujú reguláciu aktivity génov (aktivácia alebo represia) existujú aj kontrolné mechanizmy, ktoré umožňujú vyberať medzi špecifickými alternatívnymi transkriptmi a tým aj produktmi (izoformy) jedného génu. Jednou z možností je využitie alternatívnych promotorov, ktoré sa vyskytujú v niektorých cicavčích génov. Ich využitie vedie k tvorbe izoforiem s rôznymi vlastosťami. Alternatívne promotorymôžu byť lokalizované v prvom exóne, ktorý je potom vystrihnutý, ale aj vo väčších vzdialenostiach smerom po prúde. Produkty génovej expresie potom môžu mať vlastnosti špecifické pre určité tkanivá. Pri úpravách génovej sekvencie mRNA sa môžu vyskytovať variácie, ktoré vedú ku vzniku rôznych mRNA a tým aj rôznych foriem proteínov (izoformy). Patria sem alternatívny zostrih, kedý sú využité aj iné zostrihové miesta, čo môže viesť k rôznym kombináciam exónov (intronizácia exónov, exonizácia intrónov) jedného génu a tým aj ku vzniku rôznych izoforiem proteínu. Odhaduje sa, že asi 50% ľudských génov má možnosť alternatívneho zostrihu. Alternatívny zostrih môže byť tkanivovo špecifický alebo sa môže vyskytnúť v rôznych vývojových štádiách bunky. Ďalšou variáciou je alternatívna polyadenylácia, kedy sú využité polyadenylačné signály napr. v oblasti 3 ́UTR. Taktiež alternatívne polyadenylované transkripty môžu byť tkanivovo špecifické. Jednou zo vzácnych posttranskripčných úprav je aj tzv. RNA editácia, kedy dochádza k inzercii, delécii alebo substitúcii nukleotidov na úrovni RNA. V prípade cicavcov bola v obmedzenom počte génov pozorovaná substitučná editácia, hlavne deaminácia vybraných cytozínových (C → U) a adenínových (A→ I, inozín, ktorý sa správa ako guanín) zvyškov. Význam RNA editácie nie je úplne jasný, môže predstavovať spôsob regulácie génovej expresie a ďalšiu cestu vedúcu k diverzite proteínov. Niektoré experimentálne štúdie naznačujú, že je nevyhnutná k prežitiu organizmu. IV/23. Genetický kód a jeho vlastnosti Genetický kód predstavuje „slovník“, ktorý určuje zhodu medzi sekvenciou nukleotidových bázy a sekvenciou DNA. Každé „slovo“ v genetickom kóde pozostáva troch nuklotidov. Tieto „slová“ nazývame kodóny. Kodóny sú v jazyku mRNA zapísané pomocou nukleotidov adenínu (A), guanínu (G), cytozínu (C) a uracilu (U), ktorých poradie v kodóne sa píše v smere od 5 ́-konca k 3 ́-konci. Pomocou týchto štyroch nukleotidov vzniká 64 rôznych troj- nukloetidových kombinácií. Tabuľka genetického kódu môže byť použitá na preklad akéhokoľvek kodónu a tým podmieňuje aké aminokyseliny budú kódované určitou sekvenciou mRNA. Napr. 5 ́-AUG-3 ́kodón kóduje metionín, AUG kodón tiež slúži ako iniciačný (štart) kodón na začiatku translácie. 61 zo 64 kodónov kódujú 20 proteinogénnych aminokyselín- Tri kodóny (UAG, UGA, UAA), však nekódujú aminokyseliny, ale ukončujú syntézu polypeptidového reťazca, nazývame ich stop-kodóny alebo nonsence kodóny. Kodón UGA je za určitých podmienok (zvýšená koncentrácia selénu v bunke, potreba špeciálneho enzýmu,...) schopný syntetizovať aminokyselinu selenocysteín. Genetický kód sa požíva zhodne u všetkých živých organizmov. Genetický kód má určité základné vlastnosti. Genetický kód je špecifický, čo znamená, že určitý kodón vždy kóduje jednu konkrétnu aminokyselinu. Genetický kód je v podstate univerzálny, čo znamená, že bol určený v ranných obdobiach evolúcie a až na malé rozdiely platí rovnako doteraz a je zhodný pre všetky živé organizmy (výnimkou je genetický kód mitochondrií, v ktorom má pár kodónov iný význam – napr. UGA kóduje tryptofán). Genetický kód je tiež degenerovaný. To znamená, že aj keď jeden kodón kóduje jednu aminokyselinu, konkrétna aminokyselina môže byť kódovaná viac ako jedným kodónom (napr. arginín kóduje šesť rôznych kodónov). Iba metionín a tryptofán kóduje iba jeden kodón. Genetický kód je čítaný od fixného začiatočného bodu, ako kontinuálne poradie nukleotidov, po troch bázach naraz (tzv. čtecí rámec). Napr. AGCUGGAUACAU sa bude čítať ako AGC/UGG/AUA/CAU bez nejakej „interpunkcie“ medzi kodónami. Zámenou čo i len jedného nukleotidu v reťazci mRNA môže viesť v mutáciám (viac otázka IV/31). IV/24. Eukaryontní, prokaryontní translace. Regulace translace. Biosyntéza proteínov (translácia) prebieha v cytoplazme. Je katalyzovaná komplexnými nukleoproteínovými časticami – ribozómami – a ku krytiu svojej energetickej potreby spotrebováva prevažne GTP. Ribozómy sa skladajú z dvoch rôzne veľkých podjednotiek tvorených ribozomálnou RNA (rRNA) a väčším počtom relatívne malých ribozomálnych proteínov. Je bežné, že sa namiesto hmotnosti ribozómov a ich súčastí udávajú odpovedajúce sedimentačné koeficienty, ktoré je možné vypočítať z ich chovania pri centrifugácii. Kompletný eukaryotický ribozóm tak vykazuje sedimantačný koeficient približne 80 Svedbergov (80 S), hodnoty pre podjednotky sú asi 40 S a 60 S (hodnoty S sa nesčítavajú). Ribozómy prokaryot majú podobnú štruktúru, ale sú o niečo menšie než u eukaryot (70 S pre kompletný ribozóm, 30 S a 50 S pre podjednotky). Ribozomy mitochondrii a rastlinných chloroplastov sú porovnateľné s prokaryotickými ribozómami. Malá podjednotka 40S eukaryot je tvorená jednou molekulou 18 S-RNA a 33 proteínmi. Väčšia podjednotka 60 S obsahuje tri druhy rRNA so sedimentačnými koeficientmi 5 S, 5,8 S a 28 S spolu s 49 proteínmi. V prítomnosti mRNA a ďalších faktorov sa podjednotky spoja na plnohodnotný ribozóm, ktorého hmotnosť je s približne 4200 kDa asi 650-krát väčšia než hmotnosť hemoglobínovej molekuly. Doteraz sa podarilo objasniť zoskupenie jednotlivých komponent niektorých bakteriálnych ribozómov. Je známe. že sa vláknitá mRNA prevliekne štrbinou ležiacou medzi podjednotkami v blízkosti charakteristického „výbežku“ na menšej podjednotke. V okolí tohto miesta sa viaže tiež tRNA. V bunkách s intenzívnou proteolýzou sa ribozómy často zoskupujú ako perly na náhrdelníku a vytvárajú polyzómy. Príčinou tohto usporiadania je súčasná translácia jednej molekuly mRNA na viac ribozómoch. Ribozómy sa najprv viažu na 5 ́-konci mRNA a behom translácie putujú smerom k 3 ́-konci tak dlho, dokým nenarazia na stop- kodón a od mRNA odpadnú. Pre každú z 20 rôznych aminokyselín existuje jeden typ aminokyselina- tRNA-ligázy, ktorá v cytoplazme reaguje s príslušnou transferovou RNA spoločne s odpovedajúcou aminokyselinou. Táto reakcia nazývaná aktivácia aminokyseliny je endergonickým procesom a je preto po 2 kroky viazaná na rozštiepenie ATP. Následne je aminokyselina viazaná na enzým a reaguje tu s ATP na difosfát a „energeticky bohatý“ zmiešaný kyselinový anhydrid (aminoacyladenlát). V druhom kroku katalyzovanom rovnakým enzýmom sa skupina 3 ́-OH terminálneho ribozómového zvyšku tRNA (u iných ligáz je to skupina 2 ́-OH) viaže zmiešanou anhydridovou väzbou aminoacyladenylátu. Behom tejto nukleofilnej substitúcie vzniká nabitá aminoacyl-tRNA a AMP. V aminoacyl-tRNA je karboxylová skupina aminokyseliny esterifikovaná ribozómovým zvyškom terminálneho adenozínu sekvencie CCA-3 ́. Presnosť translácie závisí v prvom rade na substrátovej špecifickosti aminokyselina-tRNA-ligáz. Zle zaradené aminokyselinové zvyšky ribozóm totiž nerozpozná. „Korekčný mechanizmus“ sa stará ešte v aktívnom centre ligázy, aby boli zle zabudované aminoacylové zvyšky okamžite opäť odštiepené. Priemerne sa chyba stane len v každom 1300 aminoacylovom zvyšku, čo je prekvapivo nízka frekvencia, ak uvažujeme, ako sú si aminokyseliny podobné, napr. leucín a izolucín. Translácia začína iniciačnou fázou. U eukaryot vedie v niekoľkých krokoch k 80 S-iniciačnému komplexu, v ktorom je na štartovnom kodóne viazaná starter-tRNA (Met-tRNA Met ) obsahujúci methionin. Iniciácia je podporovaná mnohými proteínmi, z ktorých sú najdôležitejšie iniciačné faktory eIF-1 až eIF-4. Iniciačné faktory eIF-1 a eIF-3 sa najprv pripoja na malú podjednotku 40S. Ďalší faktor (eIF-2) sa spolu s GTP komplexne naviaže na už metionínom obsadenú Met- tRNA, ktorá sa následne spoja so 40 S-podjednotkou do štartovacieho komplexu. Súčasne je pomocou faktoru eIF-4 aktivovaná z bunkového jadra exprimovaná mRNA, ktorá bola až do tejto chvíle pred štiepením chránená naviazanými proteínmi. Tento faktor sa viaže na „čepičku“ chrániacu 5 ́-koniec mRNA. Následne asociuje aktivovaná mRNA so štartovným komplexom, avšak iniciátorova mRNA so štartovacím komplexom, avšak inciatorova mRNA zatiaľ nemôže kontaktovať štartovancí kodón, Behom ďalšieho kroku putuje celý komplex tvorený podjednotkou 40 S, Met-tRNA Met a naviazanými faktormi pozdĺž mRNA v smere 3 ́, až RNA dosiahne na štartovný kodón AUG. Tento dej závislý na ATP sa označuje ako „scanning“. Nakoniec sa na komplex naviaže podjednotka 60 S. Pritom dôjde opäť k odštiepeniu iniciačných faktorov, potom čo GTP naviazaný na IF-2 hydrolyzuje na GDP a P i . V iniciačnom komplexe 80 S sa Met-tRNA viaže na mieste označovanom ako peptidylový bod (P). Ďalšie väzobné miesto – akceptorový bod – nie je v tejto fázy translácie ešte obsadené. Po iniciácii translácie sa peptidový reťazec predlžuje o ďalšie aminokyselinvé zvyšky (elongácia)do chvíle, kedy ribozóm dosiahne na mRNA stop-kodónu a proces ukončí (terminácie). Priebeh elongácie sa dá rozdeliť na následujúce fázy: 1. Naviazanie aminoacyl-tRNA. Na začiatku elongačného cyklu obsadí peptidylové miesto (P) ribozómu tRNA, nesúci na svojom 3 ́-konci celý doposiaľ vytvorený peptidový reťazec. Teraz sa naviaže ďalšia tRNA obsadená následujúcou aminokyselinou (napr. Val-tRNA Val ) prostredníctvom svojho komplementárneho antikodónu na mRNA kodón (napr. GUG) prítomný na akceptorovom mieste (A). Ďalej sa tRNA komplexne viaže na proteín obsahujúci GTP – elongačný faktor eEF-1α. Hneď ako dôjde k disociácii na faktor viazaného GTP na GDP a fosfát, eEF- 1α sa opäť oddelí. Na pôvodne voľnú väzbu tRNA na mRNA pôsobí hydrolýza GTP ako spomaľujúci faktor dovoľujúci skontrolovať, či bola naviazaná správna tRNA. Ďalší proteín, elongačný faktor eEF-1βγ, neskôr katalyzuje výmenu GDP za GTP a regeneruje tak komplex eEF- 1α/GTP. Faktor eEF-1α je príbuzný s G-proteínmi prenesú signál. 2. Behom ďalšieho kroku dochádza k syntéze peptidovej väzby. Ribozomálna peptidyl-transferáza katalyzuje (bez spotreby ATP či GTP) prenos peptidového reťazca z tRNA v mieste P na skupinu NH 2 aminokyselinového zvyšku tRNA v mieste A. Peptidyltransferázová aktivita ribozómov nie je lokalizovaná v jednom z ribozomálnych proteínov, ale v 28 S-rRNA. Katalyticky aktívna RNA tohto typu sa označuje ako ribozym. Predpokladá sa, že týchto niekoľko mlo ešte zachovaných ribozymov predstavuje relikt „sveta RNA“, skorej fázy evolúcie, v ktorej proteíny nemali ešte svoju dnešnú dôležitosť. 3. Po prenesení rastúceho peptidu do miesta A dedisociuje voľné tRNA v mieste P a na ribozóm sa viaže ďalší elongačný faktor s obsahom GTP (eEF-2/GTP). Hydrolýza GTP v tomto faktore poskytuje energiu pre translokáciu. V jej priebehu sa celý ribozóm posunuje na mRNA o tri bázy v smere 3 ́-konca. Peptidový reťazec nesúci tRNA je v porovnaní s mRNA stacionárna a dostáva sa behom translokácie na ribozomálne miesto P, zatiaľ čo v mieste A sa objavuje ďalší kodón mRNA (napr. GUG). Teraz disociuje náboja zbavená Val-TRNA z miesta E a ribozom je pripravený na ďalší elongačný cyklus. Ak sa v mieste A objaví miesto aminokyselinového kodónu niektorý z troch stop-kodónov (UAA, UAG alebo UGA), znamená to začiatok terminácie. 4. Pre stop-kodón neexistujú komplementárne tRNA. Miesto nich sa na ribozóm viaže tzv. realising faktor (eRF) katalyzujúci hydrolytické štiepenie esterovej väzby medzi tRNA a C-koncom peptidového reťazca, čo vyvolá uvoľnenie peptidu. 5. Hydrolýza GTP účinkom faktoru eRF poskytuje energiu pre disociáciu celého komplexu zlúčenín, ktoré sa následne môžu opäť zúčastniť iniciácie. Syntéza bielkovín je energeticky veľmi náročná. Na jeden aminokyselinový zvyšok je nutné hydrolyzovať 4 energeticky bohaté väzby anhydridu kyseliny fosforečnej. Aktivácia aminokyseliny spotrebuje na jednu aminkyselinu dve energeticky bohaté väzba (ATP → AMP + PP i ), pričom elongácia si vyžaduje dve GTP pre cyklus. Naviac potrebuje iniciácia a terminácia na jeden reťazec ešte jeden GTP. V prokarytických bunkách prebieha elongácia a terminácia translácie podobne ako u eukaryto, naopak iniciácia sa líši. Ribzon sa viaže na zvláštne väzobné mieste mRNA. Štartovacia tRNA neobsahuje u prokaryot metionín, ale N-formyl-metionín (fMet), „sekvenovanie“ odpadá. Množstvo krokov bakteriálnej translácie je využívaná ako cieľové miesto pôsobenia antibiotík. IV/25. Třídění, transport a posttranslační úpravy proteinů. Každá eukaryotická bunka obsahuje asi 10 10 proteínových molekúl patriacich k asi 10 0000 – 20 000 druhov proteínov špecificky rozdelených do jednotlivých oblastí bunky ako sú cytoplazma, membrány a organely, kde plnia svoje funkcie. Transport bielkovín z miesta ich syntézy na ribozóme na miesto ich funkcie prebieha pomocou pórov (jadro), transportných komplexov (mitochondrie) alebo vačkov (endoplazmatické retikulum, Golgiho aparát, lyzozómy, endozómy, exozómy, plazmatická membrána, extracelulárny priestor). Pre vyhľadanie svojej cesty obsahujú proteíny signály (sorting signals), ktoré sú rozpoznávané transportnými mechanizmami. Proteíny bez signálu zostávajú po ukončení syntézy v cytozole. Biosyntéza všetkých proteínov (okrem niektorých, čo vznikajú v mitochondriách) začína na voľných ribozómoch v cytoplazme. Hneď po syntéze sa však ich cesty rozdelia a každý proteín smeruje k svojmu cieľu. Proteíny s vlastným signálnym peptidom pre endoplazmatické retikulum (1) sa uberajú sekretorickou dráhou, pričom proteíny bez signálu sa pohybujú cytoplazmatickou dráhou. Sekretorická dráhy – bielkoviny nesúce signálny peptid pre endoplazmatické retikulum sú dopravenécez membránu do vnútra endoplazmatického retikula . O ich ďalšej ceste rozhoduje prítomnosť (alebo chýbanie) dodatočných signálnych sekvencii a signálnych oblastí. Proteíny so stop-transfer-sekvenciami (4) zostávajú v endoplazmatickom retikule a stávajú sa integrálnou súčasťou jeho membránových proteínov a vďaka vezikulárnemu transportu sa dostávajú aj do ďalších membrán. Z drsného endoplazmatického retikula pokračuje ich cesta do Golgiho aparátu a ďalej až o plazmatickej membrány. Proteíny, ktoré majú zostať v drsnom endoplazmatickom retikule, napr. enzýmy, sa s pomocou retenčného signálu (2) vracajú do Golgiho aparátua odtiaľ späť do drsného enedoplazmtického retikula. Iné proteíny smerujú z Golgiho aparátu do lyzozómov (3), bunkovej membrány (integrálne membránové proteíny alebo konštitutívna exocytóza) alebo sú transportované sekrečnými vačkami (8) mimo bunku (9, signálne riadená exocytóza). Cytoplazmatická dráha – proteíny bez signálneho peptidu pre endoplazmatické retikulum sa syntetizujú v endoplazmatickom retikule na voľných ribozómoch a zostávajú v tomto kompártmente. Zvláštne translokačné signály sprostredkúvajú ďalší transport do mitochondrií (5), bunkového jadra (6) alebo do peroxizómov (7). Signálne peptidy sú krátke úseky na N- alebo C-konci alebo vo nútripeptidového reťazca. Ako signálne oblasti sa označujú miesta na povrchu bielkovín tvorené rôznymi úsekmi peptidového reťazca alebo rôznymi reťazcami. Signálne peptidy a oblasti sú štrukturálne signály, ktoré sú väčšinou prijímané organelovými receptormi. Prepravujú bielkoviny s pomocou ďalších proteínov do organel (selektívny transfer proteínov). Štrukturálne signály tiež aktivujú enzýmy modifikujúce proteíny, a tým určujú ich ďalší osud. Príkladom sú lyzozomálne proteíny a membránové proteíny s lipidovou kotvou. Signálne peptidy na N-konci sú po použití odštiepené špecifickými hydrolázami. U proteínov s viac po sebe následujúcimi signálnymi sekvenciami tak môže dôjsť k obmedzeniu následných signálov . Naopak sa neodštiepujú signály, ktoré sa čítajú opakovane. Transport bielkovín je umožnený súhrou transportérov, translokátorov, G-proteínov a enzýmov. Proteíny dopravené do mitochondrií sú udržované v rozbalenej forme pomocou chaperonov z rodiny hsp70. Spolu s biosyntézou, zraním a triedením bielkovín prichádza aj kvalitatívna kontrola. Zle zvinuté sa označia ubikvitínom a odbúrajú sa v proteazómoch. Viacero polypeptidových reťazcov je kovalentne modifikovaných a to buď ešte keď sú naviazané na ribozómy (kotranslačne) alebo až keď je ich syntéza dokončená (posttranslačne). Tieto modifikácie môžu zahŕňať odstránenie časti vzniknutej sekvencie alebo pridanie jednej alebo viacerých funkčných skupín, potrebných pre biologickú aktivitu bielkoviny. Väčšina proteínov, ktoré sú určené na sekréciu z bunky, vznikajú ako veľké prekurzorové molekuly, ktoré nie sú biologicky aktívne. Určitá časť prekurzorovej molekuly musí byť odstránená špeciálnou endoproteázou, čím vzniká biologicky aktívna molekula. Proteíny môžu byť štiepené na rôznych miestach v bunke. Niektoré sa štiepia v endoplazmatickom retikule alebo v Golgiho aparáte, iné až v sekrečných vezikuloch (napr. inzulín) a ďalšie až mimo bunky po sekrécií (napr. kolagén). Zymogény sú neaktiívne prekurzory sekrečných enzýmov (patria tu aj proteázy potrebné pre trávenie). Zymogény sa stávajú aktívnymi (pomocou štiepenia) až, keď sa dostanú na svoje miesto určenia (napr. pankreatický zymogén, trypsinogén sa aktivuje na tripsín až v tenkom čreve). Syntéza proteáz ako zymogénov chráni bunku pred tým, aby bola natrávená svojimi vlastnými produktami. Proteíny sa môžu tiež aktivovať pridaním rôznych funkčných skupín. Fosforylácia sa odohráva na hydroxylových skupinách serínu, treonínu a menej často aj tyrozínu v proteíne. Tieto fosforylácie sú katalyzované skupinou proteinových kináz a vratnú reakciu katalyzujú proteínové fosfatázy. Fosforylácia proteínu môže zvýšiť alebo aj znížiť jeho biologickú aktivitu. Viaceré proteíny, ktoré sú určené k tvorbe plazmatických membrán alebo sú určené k sekrécií, majú na svojej molekule naviazaný sacharidový reťazec. U asparagínu je naviazaný na dusík amidovej skupiny (N-viazaný), serín, treonín alebo hydroxylizín majú sacharidový reťazec naviazaný na hydroxylovej skupine (O-viazaný). N-glykozylácia sa odohráva v endoplazmatickom retikule, pričom O-glykozylácia prebieha v Golgiho komplexe. Glykozylácia je tiež významná pri označovaní proteínov v lyzozómoch. Lyzozomálne kyslé hydrolázy sú modifikované fosforyláciou manózového zvyšku na uhlíku č. 6. Prolín a lyzín na α-reťazcoch kolagénu sú často hydroxylované pomocou vitamín C-dependentných hydroláz v endoplazmatickom retikule. Medzi ďalšie posttranslačné modfikiácie môže patriť napr. pridanie ďalších karboxylových skupín na glutamát pomocou vitamín K-dependentnej karboxylácie. Vzniká tak γ-karboxyglutamát, ktorý je významný pre aktivitu viacerých hemokoagulačných faktorov. Biotín sa kovalentne viaže na ε-aminoskupiny lyzínu v biotín-dependentných enzýmoch, ktoré katalyzujú karboxylácie (napr. pyruvát karboxyláza). Naviazanie lipidov, ako napr. farnezylovej skupiny, pomáha ukotveniu proteínov v membránach. Históny môžu byť reverzibilne acetylované. Spojením thiolových skupín dvoch cysteínov vznikajú disulfidové mostíky. U tyrozínových zvyškov je potrebná jodizácia, aby sa premenili na biologicky aktívny tyroxín. Bielkoviny musia byť zložené, aby dosiahli funkčného stavu. Skladanie môže nastať spontánne alebo pomocou špeciálnych proteínov, známych ako chaperóny. Chaperóny sú tiež známe ako heat-shock proteíny a interagujú s proteínmi v rôznom štádiu skladania proteínov. Určité champeróny spájajú hydrofóbne regióny bielkovín a udržujú tak proteín nezbalený, kým sa nedokončí jeho syntéza. Iné vytvárajú štruktúru podobnú klietke, pozostávajúcej z dvoch stlačených kruhov. Čiastočne zložený proteín vstupuje do klietky, kde sa naviaže na centrálnu dutinu pomocou hydrofóbnych interakcií, zloží sa a je uvoľnený. Chaperóny teda sprostredkúvajú skladanie proteínov tým, že sa na ne naviažu a stabilizujú odhalené hydrofóbne regióny vznikajúcich polypeptidov, čím ich chránia pred predčasným skladaním. Poškodené proteíny (zle zložené alebo určené k rýchlej premene) sú označené k degradácií ubiquitináciou – pripojením reťazcov malých, premenlivých proteínov, ktoré sa nazývajú ubquitín. Takto označené proteíny sú rapídne degradované pomocou bunkových komponentov, známych proteázy, ktoré sú makromolekulové, ATP-dependentné proteolytické systémy lokalizované v cytozole (viac otázka IV/36). IV/26. Biosyntéza glykoproteinů a jejich význam. Glykoproteíny sú proteíny, ku ktorým sú kovalentne naviazané oligosacharidy. Od proteoglykánov sa líšia v dĺžke sacharidovom reťazci, ktorý je v prípade glykoproteínov relatívne krátky (zvyčajne 2-10 sacharidových zvyškov, avšak môže ich byť aj viac) a v prípade glykosaminoglykánov veľmi dlhý. Okrem toho obsahujú molekuly glykosaminoglykánov repetitívne diglukosylové jednotky, pričom u glykoproteínov sa sacharidové jednotky sériovo neopakujú. Sacharidové reťazce glykoproteínov sú často rozvetvené a môžu alebo nemusia niesť záporný náboj. Glykoproteíny obsahujú rôzne množstvo sacharidov. Napríklad imunoglobulín IgG obsahuje menej ako 4% sacharidov, naopak ľudský žalúdočný glykoproteín (mucín) obsahuje viac ako 80% sacharidov. Membránové glykoproteíny sa zúčastňujú na mnohých bunkových dejoch. Ide napr. o rozpoznanie bunky (inými bunkami, signálnymi molekulami alebo vírusmi), antigénne vlastnosti bunkového povrchu (napr. antigény krvnoskupinových systémov), môžu byť súčasťou extracelulárnej matrix alebo mucínov v gastrointestinálnych a urogenitálnych traktoch, kde majú úlohu obranných biologických lubrikantov. Okrem toho väčšina globulárnych plazmatických bielkovín ľudskej plazmy sú glykoproteíny. Proteíny funkčne určené pre cytoplazmu sa syntetizujú na voľných cytoplazmatických ribozómoch. Avšak, proteíny určené pre bunkové membrány, lyzozómy alebo na export z bunky (okrem iného ide aj o mnoho glykoproteínov) sú syntetizované na ribozómoch drsného endoplazmatického retikula (rough endoplasmatic reticulum alebo RER). Tieto proteíny obsahujú špecifické signálne sekvencie, ktoré majú funkciu molekulárnych „adresných lístkov“, ktoré odosielajú proteíny na miesto určenia. N- koniec hydrofóbnej sekvencie posiela na začiatku tieto proteíny do RER, čím umožňuje rastúcemu proteínu pretlačiť sa do lumen. Proteíny sú potom transportované pomocou sekrečných vezikúl do Golgiho aparátu, ktoré má úlohu triediaceho centra. V Golgiho aparáte sa glykoproteíny určené pre lyzozómy alebo na export zbaľujú do vezikúl, ktoré budú fúzovať s bunkovou alebo lyzozomálnou membránou a vypustia tak svoj obsah. Tie, ktoré sú určené stať sa súčasťou bunkovej membrány sú integrované do membrány Golgiho aparátu, ktorá zaškrtí a vytvorí vezikulu, ktorá pripojí membránové glykoproteíny na bunkovú membránu. Membránové glykoproteíny sú preto vždy orientované sacharidovou časťou von z bunky. Prekurzory sacharidových jednotiek glykoproteínov sú nukleotidové sacharidy, medzi ktoré patrí UDP-glukóza, UDP-galaktóza, UDP-N-acetlyglukosamín a UDP-N-acetylgalaktosamín. Okrem toho GDP-manóza, GDP-L-fukóza (ktorá sa syntetizuje z GDP- manózy) a CMP-N-acetylneuraminová kyselina môžu dodať sacharidové jednotky pre rastúce reťazce. Oligosacaharidy sú kovalentne naviazané na určitú aminokyselinu v mieste jej bočného reťazca, pričom priestorová štruktúra proteínu určuje či bude konkrétna aminokyselina glykosilovaná alebo nie. Syntéza O-viazaných glykozidov glykoproteínov je podobná tej u glykosaminoglykánov alebo je podobná syntéze glykogénu. V prvom kroku je proteín, na ktorý majú byť oligosacharidy pripojené, syntetizovaný na RER a pretlačený do jeho lumen. Glykosilácia začína prenosom N-acetylgalaktosamínu(z UDP-N-acetylgalaktosamínu) na bočný reťazec serínu alebo treonínu Glykosyltransferázy, zodpovedné za postupnú syntézu olygosacharidov, sú naviazané na membrány Golgiho apáratu. Fungujú v špecifickom poradí bez použitia templátu, na rozdiel od syntézy DNA, RNA alebo proteínov, ale využívajú rozpoznanie aktuálnej štruktúry rastúceho oligosacharidu ako vhodného substrátu. Syntéza N-viazaných glykosidov sa odohráva v lumen endoplazmatického retikula a vyžaduje prítomnosť fosforylovanej formy dolicholu, membránového lipidu membrány endoplazmatického retikula (dolichol pyrofosfát). Počiatočný produkt je spracovaný v endoplazmatickom retikule a Golgiho aparáte. V prvom kroku, podobne ako u O-viazaných glykozidoch, sú proteíny syntetizované na RER a vstupujú do jeho lumen, Avšak, proteín sa neglykolysuje samostatnými sacharidmi, ale najprv sa skonštruuje oligosacharid naviazaný na lipid. Táto molekula obsahuje dolichol (membránový lipid endoplazmatického retikula dlhý 80-100 uhlíkov), na ktorý je pyrofosfátovou väzbou naviazaný oligosacharid obsahujúci N-acetylglukosamín, manózu a glukózu. Sacharidy sa pridávajú sekvenčne na dolichol pomocou membránových glykosyltransferáz, začínajúc N-acetylglukozamínom, ďalej nasleduje manóza a glukóza. Celý oligosacharid obsahuje 14 sacharidových jednotiek a je potom presunutý z dolicholu na amidový dusík asparagínu glykosilovaného proteínu pomocou proteín-oligosacharid transferázou prítomnou v endoplazmatickom retikule. Po naviazaní na proteín je N-viazaný oligosacharid ďalej spracovaný odstránením určitých manosylových a glysylových zvyškov počas posunu glykoproteínu cez RER. Nakoniec je oligosacharidový reťazec dokončený v Golgiho aparáte pridaním rôznych ďalších sacharidov (napr. N-acetylglukosamín, N-acetylgalaktosamín, ďalej manózy, fukózy alebo NANA ako konečných skupín), čím vzniká komplexný glykoproteín alebo nie je ďalej spracovaný a zostávajú na ňom rozvetvené reťazce obsahujúce manózu v na manózu bohatom glykoproteíne. Konečný osud N-viazaných glykoproteínov je rovnaký ako O-viazaných a teda, že môžu byť uvoľnené z bunky alebo sa môžu stáť súčasťou bunkovej membrány. Okrem toho sa môžu N-viazané glykoproteíny stať súčasťou lyzozómov. N-viazané glykoproteíny spracované v Golgiho aparáte môžu byť fosforylované na jednom alebo viacerých manosylových zvyškoch. Manóza-6.fosfátové receptory, obsiahnuté v Golgiho aparáte, viažu manóza-6-fosfátové zvyšky glykoproteínov označených ako lyzozomálne enzýmy, ktoré sú následne zbalené do vezikúl a odoslané do lyzozómov. Patobiochémia I-cell disease (alebo mukolipidóza II. typu) je vzácne ochorenie, spôsobené absenciou enzýmov lyzozomálnej kyslej hydrolázy, čo má za dôsledok akumuláciu substrátov, ktoré sú za normálnych okolností degradované týmito enzýmami. Okrem toho sa v pacientovej plazme nachádza veľké množstvo lyzozomalných enzýmov, z čoho sa usudzuje, že ide o poškodenie procesu značenia a transportu enzýmov do lyzozómov. Jedinci s I-cell disease majú poškodenú schopnosť enzymatickej fosforylácie manózových zvyškov potenciálnych lyzozomálnych enzýmov, čím vzniká ich nesprávne nasmerovanie do extracelulárneho priestoru, namiesto lyzozomálnych vakuol. I-cell disease sa prejavuje skeletálnymi abnormalitami, obmedzenou pohyblivosťou kĺbov, hrubými črtami tváre a ťažkými psychomotorickými poškodeniami. Smrť nastáva väčšinou okolo 8. roku života. IV/27. Vezikulární transport. Endocytóza a exocytóza. Vezikulárny transport cez membrány súvisí so skutočnosťou, že membrány úplne obklopujú molekuly, častice alebo celú bunku. Takto vytvorené vačky (vezikuly) transportujú svoj obsahu a môžu ho po fúzii s inou membránou opäť uvoľniť. O endocytóze hovoríme, ak je obsah vačku transportovaný do vnútra bunky a naopak pri exocytóze je bunkový obsah uvoľňovaný. Aby sa celková plocha membrán v bunke nemenila, sú endocytóza a exocytóza navzájom prepojené. Bunky môžu prijímať extracelulárne uložené látky pomocou endocytózy. Transportované sú hlavne živiny, receptory a ich ligandy, imunologické signálne látky, patogény a toxíny. Pomocou fagocytózy sú prijímané veľké a solídne objekty, ako napr. bunky usmrtené apoptózou , baktérie, vírusy alebo cudzie telesá. Plazmatická membrána obklopí objekt a uzavrie ho do veľkej vakuolyoznačovanej ako fagozóm. Konečný rozklad obsahu prebieha potom v lyzozómoch. Pri pinocytóze je prijímaná extracelulárna tekutina a v nej rozpustené látky (napr. bielkoviny). Najprv sa vytvorí vyduť plazmatickej membrány. Tento tekutinou napĺnený útvar sa zaškrtí do tvaru vačku, vstúpi do cytozolu a splynie s endozómami alebo lyzozómami. Prostredníctvom endocytózy sprostredkovanej receptormi získava proces príjmu molekúl zvláštnu špecifickosť. Plzmatická membrána sa pri tomto deji zanorí dovnútra (vzniká tzv. coated pit – obalená jamka), zaškrtí sa a vytvorí sa cytoplazmatický obalený vačok (coated vesicle). Tohto deja sa zúčastňujú obalové proteíny (coat proteins), z ktorých je najlepšie preštudovaný klatrín. Klatrín je proteín s tromi ramenami (tzv. triskelion). Svojimi výbežkami sa klatríny spájajú a vytvárajú mriežkovitú štruktúru obklopujúcu membránu s jej obsahom. Okrem klatrínu môže zaškrtenie membrány vyvolať aj kalveolín, ktorý pôsobí tvorbou lahvovitých mechúrikov nazývaných kalveoly. S ich pomocou je do buniek prijímaná napr. kyselina folová. Lipoproteín LDL, transferín a rôzne proteohormóny (EGF) vstupujú do bunky endocytózou sprostredkovanou receptormi. Tvorba prohlubní v plazmatickej membráne je vyvolaná prostredníctvom adaptorového proteínu AP2, ktorý vykazuje špecifickou afinitou k fosfolipidom a membránovým proteínom so zvláštnymi signálnymi sekvenciami. Klaterínové molekuly sa fixujú na AP2 a tým podporujú zanorenie membrány, čím vzniká obalená jamka. G-proteín dynamín následne vyvolá zaškrtenie vačku a jeho oddelenie od plazmatickej membrány – tak vzniká obalený vačok. Tento vačok splynie s endozómami a uvoľní sa klatrín, AP2 adynamín. Pomcou exocytózy vylučujú bunky vezikulárny obsah do extracelulárnej oblasti. Týmto spôsobom napr. hepatocyty secernujú rôzne plazmatické proteíny do krvi, plazmatické bunky protilátky, žľazové bunky hormóny alebo nervové bunky neurotransmitery do synaptickej štrbiny. Na exocytóze sa podieľajú SNARE-proteíny, ktoré sprostredkúvajú adsorpciu vačkov na membránu a následnú membránovú fúziu. Pre sekréciu neurotransmiterov z nervových buniek do synaptickej štrbiny viaže v-SNARE-proteín (vezikulárny) synaptobrevín zo synaptických vačkov na t-SNARE-proteíny (target), syntaxín a SNAP-25 na cieľovej membráne. Exocytózy sa tiež zúčastňujú G-proteín Rab 3 a synaptotagmín viažuci Ca 2+ . Pritom prechádza synaptotagmín následkom naviazania Ca 2+ konformačnou zmenou, ktorá vyvolá tvorbu fúzovacieho komplexu SNARE. Patobiochémia Toxíny baktérie Clastridium tetani a C. botulinum, ktoré sa objavujú pri ranných infekciách a potravinových otravách, spôsobujú tetanus a botulizmus. Špecificky potláčajú uvoľnenie neurotransmiterov na synapsiách. Ich účinok vyvolajú zinkové proteázy štiepiace SNARE proteíny. Rekombinantný botulotoxín sa využíva napr. pri vyhladzovaní vrások. IV/28. Restrikční enzymy a další nástroje genového inženýrství, konstrukce rekombinantních molekul DNA a proteinů. Klonování DNA. Jednou z hlavných prekážok molekulárnej analýze genómovej DNA je priveľká veľkosť skúmaných molekúl. Objav špeciálnej skupiny bakteriálnych enzýmov, nazývaných restrikčné endonukleázy (restrikčné enzýmy), ktoré štiepia dvojvláknovú DNA na menšie, praktickejšie fragmenty, otvoril dvere DNA analýze. Pretože každý enzým štiepi DNA na určitej špecifickej nukleotidovej sekvencii, restrikčné enzýmy sú používané experimentálne na získanie precízne definovaných segmentov DNA, nazývaných restrikčné fragmenty. Restrikčné endonukleázy rozpoznávajú krátke úseky DNA (o veľkosti asi 4-8 bp), ktoré obsahujú konkrétne nukleotidové sekvencie. Tieto sekvencie, ktoré sa líšia u každého restrikčného enzýmu, sú palindrómy, teda vykazujú protichodnú symetriu (obrázok). Znamená to, že na krátkom úseku dvojzávitnice je sekvencia nukleotidov na oboch vláknach rovnaká, ak sa číta v smere od 5 ́→3 ́. V baktériach sa restrikčné endonukleázy využívajú na „restirkciu“ expresie nebakteriálnej DNA pomocou jej štiepenia, pričom je bakteriálna DNA chránená pomocou metylácie báz v mieste restrikcie. Restrikčné endonukleázy sa nazývajú podľa organizmu, z ktorého boli izolované. Prvé písmeno názvu označuje rod danej baktérie. Ďalšie 2 písmená pochádzajú z názvu druhu baktérie. Ďalšie písmeno označuje kmeň baktérie a posledné písmeno je prídavok, ktorý označuje poradie, v ktorom bol v danom organizme objavený enzým. Napr. HaeIII je tretia restrikčná endonukleáza izolovaná z baktérie Haemophilus aegyptius. Restrikčné enzýmy štiepia dsDNA za vzniku 3 ́-hydroxylovej skupiny na jednom konci a 5 ́-fosfátovej skupiny na druhom. Niektoré endonuklázy, ako napr. TaqI, tvoria nerovnomerné strihy, ktoré dávajú vznik „lepivým“ koncom – v ktorých má fragment DNA má jednovláknovú časť, ktorá je komplementárna k inej. Iné endonukleázy, ako napr. HaeIII, produkujú fragmenty, ktoré majú „tupé konce“ – celý fragment je dvojvláknový a nevytvára vodíkové mostíky s iným fragmentom. Použitím enzýmu DNA-ligázy sa lepivé konce fragmentov DNA môžu spojiť kovalentne s druhým DNA fragmentom s lepivým koncom, vzniknutým štiepením rovnakou restrikčnou endonukleázou. Iná ligáza, napr. kódovaná bakteriofágom T4, môže kovalentne spojiť tupé konce dvoch fragmentov. Sekvencia DNA, ktorá je rozpoznaná a rozstrihnutá restrikčným enzýmom sa nazýva restrikčné miesto. Restrikčná endonukleáza štiepi dsDNA na fragmenty o rôznych veľkostiach. Napr. enzým, ktorý rozpoznáva štvorbázové sekvencie, rozstrihne DNA na viacerých miestach, každých 4 4 bp. Naopak, enzým vyžadujúci sekvenciu 6 bazí rozstrihá DNA na menej dlhších kusov. Stovky rôznych restrikčných enzýmov majú rôzne vlastnosti (buď v nukleotidovej sekvencii restrikčného miesta alebo v dĺžke restrikčného miesta) sú komerčne dostupné ako analytické reagencie. Zavedenie cudzej DNA do deliacej sa bunky umožňuje klonovanie alebo amplifikáciu (kopírovanie, množenie,..) tej konkrétnej DNA. V niektorých prípadoch jeden fragment DNA môže byť izolovaný a purifikovaný pred klonovaním. Vo väčšine prípadov, aby sme mohli naklonovať danú sekvenciu nukleotidov, musíme najprv celú bunkovú DNA najprv rozštiepiť endonukleázami, čím vzniknú desaťtisíce fragmentov. Každý vzniknutý fragment je zapojený do vektorovej DNA molekuly (kolonvací vektor) za vzniku hybridu alebo rekombinantnej molekuly. Každá rekombinantná DNA molekula prenáša svoj vložený fragment DNA do hosťovskej bunky, napr. baktérie, kde sa replikuje. Pritom, ako sa hostiteľská bunka delí, vytvára klon, v ktorom každá baktéria obsahuje kópie rovnakého vloženého fragmentu DNA (odtiaľ pochádza názov „klonovanie“). Klonovaný DNA fragment sa potom uvoľňuje z vektora pomocou štiepenia (restrikčnou endonukleázou) a je izolovaný. Týmto mechanizmom vzniká veľa rovnakých kópií DNA. Vektor je molekula DNA, do ktorej sa vkladá fragment DNA určený na klonovanie. Základne vlastnosti vektora sú: 1) schopnosť samostatnej replikácie v hostiteľskej bunke; 2) musí obsahovať aspoň jedno špecifickú nukleotidovú sekvenciu rozpoznávanú restrikčnou endonukleázou; 3)musí obsahovať aspoň jeden gén, ktorý umožňuje rozlíšiť daný vektor, ako napr. gén pre antibiotickú rezistenciu. Najčastejšie využívanými vektormi sú plazmidy a vírusy. Prokarytické organizmy obsahujú jeden veľký cirkulárny chromozón. Okrem toho väčšina baktérií obsahuje aj malé cikulárne extrachromozomálne molekuly DNA nazývané plazmidy. Plazmidová DNA podstupuje replikáciu ktorá môže alebo nemusí prebiehať súčasne s delením bunky. Plazmidy môžu obsahovať gény pre rezistenciu hostiteľskej baktérie proti antibiotikám a môže umožňovať prenos genetickej informácie z jednej baktérie na druhú. Plazmidy môžu byť izolované z baktérie, ich cirkulárna dna rozštiepená vhodnou endonukleázou na špecifickom mieste a vložený do nej fragment cudzej DNA o veľkosti do 10 kb. Rekombinantný plazmid môže byť vložený do baktérie, kde môže vznikať veľké množstvo kópií. Takéto baktérie sú pestované v prítomnosti antibiotík, čim sa vyselektujú iba bunky s hybridnými plazmidmi, ktoré dodávajú baktérii rezistenciu. Vývoj vylepšených vektorov, ktoré môžu efektívne poňať väčšie fragmenty DNA alebo exprimovať cudzorodý gén v iných typoch buniek, pomohol výskumu na poli molekulárnej genetiky. Okrem prokaryotických plazmidov, sa dnes často využívajú ako vektory pre klonovanie aj vírusy infikujúce baktérie (bakteriofág λ) alebo vyššie živočíchy (retroviry) a tiež umelo vytvorené vektory ako napr. kozmidy a bacterial alebo yeast artificial chromosomes (BACs alebo YACs, môžu uskladniť 100-500 kb). DNA knižnica je súbor klonovaných restrikčných fragmentov DNA určitého organizmu. Využívajú sa 2 druhy DNA knižníc: génomová knižnica a knižnica komplementárnych DNA (cDNA). Genómové knižnice ideálne obsahujú kópiu každej DNA DNA nukleotidovej sekvencie v genóme. Naopak, cDNA knižnice obsahuje iba tie sekvencie, ktoré sú prepísané do mRNA molekúl a líšia sa navzájom medzi jednotlivými bunkami. cDNA neobsahuje intróny a kontrolné elementy génov, ktoré sa nachádzajú v genómovej DNA. Genómová DNA knižnica vzniká rozštiepením všetkej DNA organizmu pomocou restrikčných endonukleáz a následným vložením do vhodného vektora. Takto vzniknuté rekombinantné molekuly DNA sa replikujú v hostiteľských baktériách. Amplifikované fragmenty DNA teda predstavujú celý genóm organizmu a tvoria tak genómovú knižnicu. Nezávisle na použitej restrikčnej endonukleáze, je lepšie ak skúmaný gén obsahuje viac ako jedno restrikčné miesto rozpoznávané enzýmom. Ak to platí a je umožnené štiepenie, skúmaný gén je rozštiepený - a teda sa nenachádza v žiadnom kline v knižnici. Aby sme tomu zabránili, prebehne čiastočné natrávenie, čím sa obmedzí množstvo alebo čas pôsobenia enzýmu. Toto spôsobuje, že sa rozštiepi iba malé množstvo restrikčných miest v každej DNA, čím vznikajú fragmenty o veľkosti asi 20 kb. Enzýmy, ktoré štiepia veľmi často (rozpoznávajú sekvencie o dĺžke 4bp) sú väčšinou využívané na tento účel a teda vzniká takmer náhodná zbierka fragmentov. Toto zaisťuje vysokú šancu, že skúmaný gén bude obsiahnutý v niektorom z fragmentov. Ak skúmaný gén je v určitom tkanive exprimovaný vo veľkej miere, je pravdepodobné, že mRNA transkribovaná z tohto génu sa tiež v tejto bunke nachádza vo vysokých koncentráciách. Napr. retikulocytová mRNA sa skladá vo väčšej miere z molekúl kódujúcich globínové reťazce hemoglobínu. Táto mRNA môže byť použitá ako templát pre vznik komplementárnej DNA (cDNA) za použitia reverznej transkriptázy. Vzniknutá cDNA je teda dvojvláknovou kópiou mRNA. cDNA môže byť amplifikovaná klonovaním alebo PCR. Využíva sa ako sonda na lokalizáciu génu, ktorý kóduje originálnu mRNA v zmesi viacerých neznámych fragmentov DNA. Ak mRNA použitá ako templát je zmenou viacerých rôznych fragmentov, vznikajúca cDNA bude tiež heterogénna. Tieto zmesi môžu byť naklonované za vzniku cDNA knižnice. Pretože cDNA nemá žiadne nekódujúce časti, môže byť využitá pre syntézu eukaryotických proteínov v baktériách v expresných vektoroch. Tieto špeciálne plazmidy obsahujú bakteriálny promotor pre transkripciu cDNA a sekveniu Shine-Dalgarno, ktorá umožňuje bakteriálnemu ribozómu začať transláciu vzniknutej mRNA molekuly. Týmto spôsobom sa vyrába syntetický ľudský inzulín. Štiepenie veľkej molekuly DNA restrikčnym enzýmom dáva vznik obrovskému množstvu fragmentov. Ako môžeme vybrať skúmaný DNA fragment z pomedzi množstva rôznych fragmentov? Odpoveď sa skrýva v použití sondy – krátkeho úseku ssDNA, značeného radioizotopom (napr. 32 P) alebo neradioaktívnou molekulou, ako napr. biotínom. Sekvencia sondy je komplementárna l sekvencii v skúmanej DNA. Sondy sa využívajú na identifikáciu toho, ktorý prúžok na géle alebo ktorý klon v knižnici obsahuje skúmanú DNA, v procese nazývanom screening. Užitočnosť sond tkvie v procese hybridizácie, pri ktorej sa sonda obsahujúca komplementárnu sekvenciu viaže na sekvenciu skúmanej DNA. ssDNA, vznikajúca alkalickou denaturáciou dsDNA, sa najprv naviaže na pevné miesto, napr. na nitrocelulózovú membránu. Imobilizovaným vláknam DNA je zabránená väzba so sebou, ale je možná väzba s exogénnou, značenou ssDNA sondou. Množstvo hybridizovaných fragmentov sa meria podľa zachovania radioaktivity na membráne. Zvyšné nenaviazané sondy sa zmyjú preč. Ak je sekvencia celého úseku skúmanej DNA je známa, jednovláknové oligonukleotidové sondy o 20-30 nukleotidoch môžu byť syntetizované a sú komplementárne k malému úseku skúmaného génu. Ak nepoznáme sekvenciu génu, môžeme využiť na vytvorenie sondy aminokyselinovú sekvenciu proteínu ako konečného produktu génu. Môžu sa tak syntetizovať krátke ssDNA sekvencie (15-30 nukleotidy) za pomoci genetického kódu ako vodítka. Pretože geneticky kód je degenerovaný, je nutné syntetizovať viacero oligonukleotidov. Oligonukleotidy sa môžu využívať na detekciu bodových mutácii v sekvencii, ku ktorým je komplementárna. Naopak cDNA sondy obsahujú tisícky báza a ich väzba na skúmanú DNA nie je bodovou mutáciou ovplyvnená. Rádioaktívne sondy sa začínajú nahrádzať nerádioaktívnymi. Najvyužívanejšou nerádioaktívnou sondou je sonda, ktorej značenie je založené na vitamíne biotín, ktorý sa chemicky viaže na nukleotidy v sonde. Biotín bol vybraný, lebo sa viaže veľmi pevne na avidín – rozšírený proteín vo vaječnom bielku. Avidín môže byť naviazaný na fluorescenčnú farbu detekovateľnú optickými metódami s veľkou senzitivitou. A preto fragment DNA hybridizovaný s biotínovou sondou môže byť zviditeľnený immerzným gélom v roztoku avidínu a farby. A vymytí zvyšného avidínu fragment DNA flurescentuje. Fluorescenčné sondy môžu umožniť detekciu a lokalizáciu DNA sekvencii v bunkovom alebo tkanivovom preparáte v procese fluorescenčnej in situ hybridizácie (FISH). IV/29. Metody frakcionace buňky, elektroforéza nukleových kyselin a proteinů. Aby sme mohli skúmať jednotlivé bunkové kompártmenty, boli vyvinuté viaceré postupy izolácie bunkových organel (frakcionácia bunky), ktoré sú založené najmä na veľkosti a hustote jednotlivých organel. Izolácia bunkových komponentov začína narušením skúmaného tkaniva a jeho následnou homogenizáciou (rozpadom jednotlivých buniek) vo vhodnom pufre. Homogenizácia pomocou „Pottera“ (Potter-Elvehjemov homogenizér – rotujúca teflónová palička uzavretá v sklenenom valci) je vhodná pre živočíšne bunky. Táto metóda je veľmi jemná a preto sa používa na izoláciu jemných štruktúr a molekúl. Iné spôsoby rozpadu buniek sú enzymatická lýza za pomoci enzýmov, ktoré rozrúšajú bunkovú stenu, mechanické narušenie pomocou drvenia zmrazeného tkaniva, krájania alebo lisovania rotujúcimi nožmi, veľkými tlakovými zmenami, pomocou ultrazvuku, osmotickým šokom a opakovaným zmrazovaním a rozmrazovaním. Pri izolácií nepoškodených organel je dôležité, aby homogenizačný roztok bol izoiónický, t.j. že purf musí mať rovnakú osmolaritu ako vnútro bunky. Ak by sme použili hypotonický roztok, bunky by nasali vodu a praskli. Naopak, pri použití hypertonických roztokov sa bunky zmrštia. Homogenizácia je nasledovaná hrubou filtráciou cez gázu, čím sa oddelia nepoškodené bunky od fragmentov medzibunkovej hmoty. Následne je celá bunková frakcia podrobená centrifugácií, pri ktorej sa zvyšuje gravitačná sila (mení sa gravitačné zrýchlenie). Po centrifugácií sa na základe rôzneho tvaru a veľkostí sa organely postupne sedimentujú zo suspenzie. Jadrá buniek sedimentujú ako prvé pri najnižšom zrýchlení, ktoré dokážu vyvinúť stolové centrifúgy. Oddelením zvyšnej suspenzie (tzv. supernantant) a opatrným prenesením sedimentu (tzv. pellety) do izotonického média dostaneme frakciu, ktorá je bohatá na bunkové jadrá. Avšak táto frakcia stále môže byť kontaminovaná rôznymi bunkovými komponentmi ako napr. fragmentmi cytoskeletu. Častice menšie ako jadro môžeme získať postupným zvyšovaním zrýchlenia pri centrifugácií zvyšného supernantantu prvej centrifugácie. Avšak ďalšie centrifugácie vyžadujú veľmi silné centrifúgy (vysoko rýchlostné centrifúgy a ultracentrifúgy). Takýmto spôsobom získame postupne mitochondrie, membránové vezikuly a ribozómy. Po poslednej centrifugácií supernantant obsahuje cytozol a v ňom rozpustené látky a zvyšky pufru. Izolačné procesy sa väčšinou odohrávajú pri nízkej teplote (okolo 0-5°C), aby sa spomalili degradačné reakcie (uvoľňujú sa enzýmy a iné faktory). Pridaním thiolov a chelatačných agents sa ochraňujú –SH skupiny pred oxidáciou. Aj navzdory týmto opatreniam izolované organely strácajú svoju biologickú aktivity. Avšak pri veľmi opatrnej práci je možné izolovať mitochondrie, ktoré budú stále in vitro prijímať substráty a produkovať ATP pomocou oxidatívnej fosforylácie po niekoľko ďalších hodín. Počas procesu frakcionácie je veľmi dôležité kontrolovať čistotu vzniknutých frakcií. To či je konkrétna organela obsiahnutá v určitej frakcií alebo to, či frakcia obsahuje iné komponenty, môžeme určiť pomocou márkrových molekúl. Tieto molekuly sa nachádzajú výlučne v jednom type organely. Napr. často sa určuje aktivita organelovo špecifických enzýmov (marker enzýmov). Distribúcia merker enzýmov v bunke odráža kompartmentáciu procesov, ktoré katalyzujú. Elektroforéza nukleových kyselín separuje fragmenty DNA. Pohyblivosť v elektrickom poli je závislá na veľkosti, tvare a náboji molekuly. Na rozdiel u proteínov, kde je pomer týchto troch parametrov vždy variabilný, v DNA je pomer veľkosti a náboja konštantný, lebo všetky komponenty DNA majú podobné veľkosti a nosia jeden negatívny náboj. Ak sa elektroforéza odohráva na materiáli s veľkými mriežkami, ktorý neoddeľuje látky na základe tvaru a veľkosti, pohyblivosť molekúl bude závisieť čisto na ich hmotnosti. Takýmto materiálom bežne využívaným v genetickom inžinierstve je gél z polysacharidu agarózy. Agarózový gél nie je veľmi stabilný a preto sa leje horizontálne do elektroforetickej komory. Na zviditeľnenie oddelených fragmentov, po skončení oddeľovania, sa gély ponoria do roztoku etídium bromidu. Ide o interkalačnú látku (môže vyvolávať mutácie!), ktorá vykazuje silnú fluorescenciu v UV oblasti po naviazaní na DNA, hoci vykazuje len slabú fluorescenciu vo vodných roztokoch. Porovnaním vzdialeností dvoch PCR produktov voči DNA o známom počte nukleotidov určujeme ich dĺžku. Po zafarbení sa pruhy môžu odstrániť z gélu a DNA z nich môže byť extrahovaná a použitá na ďalšie výskumy. Elektroforéza proteínov a všeobecné princípy elektroforézy sú napísané v otázke I/7. IV/25. Polymerázová řetězová reakce, uplatnění PCR v klinické diagnostice, RT-PCR a využití této techniky. Polymerázova reťazová reakcia (PCR) je metóda genetickej technológie, ktorá umožňuje množenie (amplifoikáciu) ľubovoľných fragmentov DNA bez účasti enzýmov, vektorov a hostiteľských buniek. PCR umožňuje syntézu miliónov kópií určitej nukleotidovej frekvencie za pár hodín. Dokážeme zmnožiť aj minimálne množstvo DNA. Táto metóda dokáže využiť DNA akéhokoľvek pôvodu – bakteriálnu, vírusovú, eukaryotickú,... PCR využíva DNA-polymerázu na repetitívnu amplifikáciu konkrétnej časti DNA. Každý cyklus zdvojnásobuje počet DNA vo vzorke, čím dochádza k exponenciálnemu rastu koncentrácie DNA s každým opakovaním cyklu amplifikácie. Amplifikovaná DNA môže byť následne analyzovaná pomocou elektroforézy, Southern blotu alebo pomocou priameho sekvenovania. Nie je nutné poznať sekvenciu využívanej DNA v PCR, je však nutné poznať sekvenciu krátkych úsekov na každej strane využívanej DNA. Tieto úseky sa nazývajú priľahlé úseky a ohraničujú sekvenciu DNA, ktorá nás zaujíma. Sekvencia nukleotidov týchto priľahlých regiónov sa využíva na vytvorenie dvoch oligonukleotidových vláken, ktoré sú približne 20-25 nukleotidov dlhé a komplementárne k príslušnému priľahlému regiónu. 3 ́-koniec každého oligonukleotidu smeruje k využívanej DNA. Tieto syntetické oligonukleotidy fungujú ako primery v PCR. Ďalším krokom v tejto reakcií je denaturácia DNA. Aby mohla byť DNA amplifikovaná, musí byť zohriata, aby sa oddelili jej vlákna od seba. Následne DNA ochladíme, aby sme mohli na ňu hybridizovať primery (jeden pre každé vlákno DNA). V nasledujúcom kroku sú do vzorky pridané DNA-polymeráza a dostatočné množstvo všetkých štyroch typov deoxyribonukleozid tirfosfátov, aby sa začala syntéza dvoch nových vláken, komplementárnych k originálnym DNA vláknam. DNA-polymeráza pridáva nukleotidy na 3 ́-hydroxylový koniec primeru a následne reťazec rastie pozdĺž celej využívanej DNA , čím sa vytvárajú komplementárne kópie využívanej DNA. Po skončení jedného cyklu PCR reakcie sú vlákna opäť zahriate aby sa znova rozpadli na jednotlivé vlákna, na ktoré sa nahybridizujú primery a reakcia sa opakuje. Počas PCR reakcie sa využíva termostabilná DNA- polymeráza, ktorá sa získava zo špeciálnych termorezistentných baktérií, teda počas zahrievania nedenaturuje a preto sa nemusí po každom cykle dodávať nová polymeráza. Počas jednej PCR prebehne priemerne 20-30 cyklov, čím sa množstvo DNA znásobí milión krát (2 20 ) až miliardu krát (2 30 ). Hlavnou výhodou PCR oproti klonovaniu ako metódy zmnoženia určitej DNA sekvencie je presnosť a rýchlosť. Sekvencie DNA, ktoré sú obsiahnuté iba v stopových množstvách môžu byť zmnožené na toľko, že sa z nich stanú dominantné sekvencie vo vzorke. PCR je tak presná, že sekvencie DNA, ktoré sa nachádzajú v jednej bunke môžu byť zmnožené a študované. Izolácia a zmnoženie určitej DNA sekvencie pomocou PCR je rýchlejšie a menej technicky náročné ako klonovacie metódy, ktoré využívajú rekombinantné DNA techniky. PCR má viacero využití: 1. Porovnanie normálneho génu s jeho mutovanou formou: PCR umožňuje syntézu mutovanej DNA v dostatočnom množstve na zistenie jeho sekvencie bez pracneho klonovania. 2. Detekcia vzácnych sekvencií nukleových kyselín: Vírusy s dlhou dobou latentnosti (napr. HIV vírus) sa ťažko detekujú konvenčnými metódami v ranných štádiách infekcie. PCR predstavuje rýchlu a presnú metódu detekcie sekvencií vírusovej DNA aj napriek tomu, že iba v malom počte buniek sa nachádza vírus. 3. Forenzná analýza vzorky DNA: DNA fingerprinting pomocou PCR znamenal revolúciu v analýze stôp z miesta činu. DNA izolovaná z jedného ľudského vlasu, trošku krvi alebo semena je dostatočná na určenie, či vzorka pochádza od konkrétneho jedinca. DNA markre analyzované počas fingerprintingu sú často krátke tandemové opakujúce sa polymorfizmy (short tandem repeat polymorphisms) . Podobná technika sa požíva aj pri určení otcovstva. 4. Prenatálna diagnostika cystickej fibrózy: Cystická fibróza je autozomálne recesívne genetické ochorenie, ktoré vzniká ako dôsledok mutácie génu pre CFTR proteín (cystic fibrosis transmembrane conductance protein). Najčastejšou mutáciou je delécia troch nukleotidov, ktorá spôsobí stratu fenylalanínu z CFTR proteínu. Pretože mutovaná alela je o tri nukleotidy kratšia ako normálna alela, je možné ich rozdeliť na základe veľkostí PCR produktov, vzniknutých z množenia konkrétnej časti DNA. Rozdelenie prebieha pomocou elektroforézy a môžeme určiť dominantného homozygota (zdravý jedinec), heterozygota (prenášač) alebo recesívneho homozygota (postihnutý jedinec). RT-PCR (reverse transcription PCR) využíva miesto DNA na amplifikáciu mRNA. Prvým krokom je izolácia cieľovej RNA alebo mRNA zo vzorky tkaniva, následne prebieha prepis mRNA do cDNA pomocou reverznej transkriptázy a nakoniec prebieha klasická PCR. Táto metóda je podstatne náročnejšia ako normálna PCR, lebo RNA je rýchlo degradovaná účinkom ribonukleáz, ktoré často kontaminujú vzoriek RNA. RNázy sú termostabilné, nepoškodí ich ani sterilizácia autoklávovaním alebo účinky denaturačných činidiel. Aby sa zabránilo degradácii RNA, ošetrujú sa pomôcky, roztoky a vzorky inhibírmi RNáz (napr. dietylpyrokarbonát, DEPC). RT-PCR má využitie pri štúdiu vírusových genómov, ktoré sú tvorené iba RNA, ďalej pri vkladaní ľudských génov do bakteriálnych genómov (prokaryotická DNA neobsahuje intróny rovnako ako cDNA), detekcii dedičných chorôb, malígnych nádorov (rakovinové bunky produkujú špecifické mRNA, ktoré slúžia ako jeden z najlepších markerov) alebo pri určovaní génovej aktivity určitého tkaniva alebo bunky. RT-PCR v zmysle reverznej transkripcie sa často zamieňa za Real-time PCR (RT-PCR alebo qPCR), ktorá umožňuje meranie množstva PCR produktu počas PCR reakcie a nie až na jej konci (v reálnom čase). IV/31. Povaha genových mutací, mutace dědičné a získané, polymorfismy, mini- a mikrosatelitové sekvence a jejich využití. Sekvencie DNA môžu podliehať zmenám vyvolaných pôsobením chemických, fyzikálnych a biologických činiteľov alebo tiež vznikajú ako vzácne chyby pri replikácií DNA. Tieto zmeny sa nazývajú mutácie. Niektoré mutácie sa vo fenotype nemusia prejaviť a iné môžu mať vplyv na funkciu alebo prejav znaku – závisí to na konkrétnom mieste vzniku mutácie v DNA. Mutácie môžeme klasifikovať na základe viacerých kritérií. Jedným z nich by mohol byť rozsah genetickej zmeny, ktorý začína pri malých mutáciách postihujúcich jeden alebo niekoľko málo nukleotidov v sekvencii a končí až pri rozsiahlych mutáciách vrátane chromozómových (zmeny štruktúry alebo počtu chromozómov) a genómových (zmeny počtu celých chromozómových sad – polypolidie). Ďalej ich môžeme deliť podľa postihnutých buniek na somatické, ktoré postihujú somatické bunky a ďalej sa na potomkov jedinca neprenášajú; a na zárodočné (gametické), ktoré postihujú gaméty a môžu sa prenášať na potomkov jedinca. Taktiež ich podľa príčiny môžeme deliť na spontánne, pri ktorých nie je známy vyvolávajúci faktor; a na indukované, ktoré sú navodené známymi mutagennými faktormi. Mutáciu môže jedinec zdediť od rodičov (dedičná mutácia) alebo tiež nadobudnúť počas života (získané mutácie) v procese mutagenézy. Mutagenéza môže nastať vzácne chybou pri replikácii DNA (pravdepodobnosť cca 10 -7 na konkrétnu bázu) alebo pôsobením mutagénnov. Mutagény môžu byť biologické (napr. vírusy, transpozóny,...), fyzikálne (napr. UV alebo ionizujúce žiarenie) a chemické (napr. aromatické uhľovodíky, kyselina dusitá, silné oxidovadlá, voľné radikály, interkalačné látky,...). Vznik mutácie na určitom mieste je náhodný dej, ale predsa existujú miesta, kde mutácie vznikajú častejšie (tzv. hot-spots) alebo menej často (tzv. cold-spots). Génové mutácie rozdeľujeme z hľadiska zmien v sekvencií DNA na:  Substitúcie – ide o zámenu jedného nukleotidu za nukleotid s inou bázou . Ide o najčastejší typ mutácie, ktoré sa ďalej delia na tranzicie (zámena purínu za purín alebo pyrimidínu za pyrimidín) a transverzie (zámena purínu za pyrimidín a naopak).  Delecie – ide o stratu jedného alebo viacerých nueklotidov v sekvencií DNA  Inzercie – ide o zaradenie jedného alebo viacerých neukleotidov do sekvencie DNA. Zámena jedného nukleotidu v sekvencií (bodová mutácia) môže viesť k trom situáciám. Za prvé, ak mutovaný kodón kóduje rovnakú aminokyselinu ako pôvodný kodón, ide o skrytú (silent) mutáciu (napr. ak sa v kodóne UCA, ktorý kóduje serín, nahradí posledný nukleotid uracilom, vznikne kodón UCU, ktorý stále kóduje serín). Je to spôsobené tým, že v genetickom kóde väčšinou aminokyselinu určujú prvé dva nukleotidy. Za druhé, ak sa mutovaný kodón kóduje inú aminokyselinu ako pôvodný kodón, ide o missense mutáciu (napr. ak v serínovom kodóne UCA je nahradený prvý nukleotid cytozínom, vznikne kodón CAA, ktorý kóduje prolín). Za tretie, ak sa pôvodný kodón mutáciou zmení na stop-kodón, ide o nonsense mutáciu (napr. zámenou druhého nukleotidu adenínom v serínovom kodóne UCA vznikne kodón UAA, ktorý v tomto bode zastaví transláciu a produkt bude kratší ako mal byť). Inými mutáciami môže nastať zmena v množstve alebo štruktúre pôvodného produktu. Prvým prípadom môže byť zmnoženie tandemových trinukleotidových repetícií (dynamické mutácie), čím vznikne veľké množstvo kópií rovnakého nukleotidu. Ak tento jav nastane vo kódujúcej oblasti génu, bude vzniknutý produkt obsahovať veľké množstvo nadbytočných kópii jednej aminokyseliny. Napr. zmnoženie CAG kodónu vedie k vloženiu veľkého množstva glutamínu do bielkoviny huntingtínu, čím vzniká neurodegenratívne ochorenie, Huntingtonova chorea. Nadbytočné množstvo glutamínu spôsobí nestabilitu proteínu, ktorý sa začne akumulovať v bunke. Zmnožením tandemových repetícii v nekódujúcej oblasti génu môže spôsobiť znížene množstvo výsledného produktu. Tento stav nastáva počas syndrómu fragilného X chromozómu (najčastejší dôvod mentálnej retardácie u človeka, pri ktorej zmnoženie repetícií spôsobuje represiu génu pomocou hypermetylácie DNA) alebo počas myotonickej dystrofie. Druhý prípad nastáva ak mutácia nastane na mieste zostrihnutia mRNA. Mutácia na tomto mieste spôsobuje zámenu v zostrihu intrónov, čím vznikajú aberované proteíny (napr. počas svalovej dystrofie je zmena v génovom zostrihu príčinou represie génu). Ďalším prípadom je pridanie alebo strata jedného alebo dvoch nukleotidov v kódujúcej sekvencii génu. Nastáva tak posunová (frameshift) mutácia, čím sa zmení čtecí rámec. Týmto spôsobom vzniká produkt s úplne inou sekvenciou aminokyselín alebo skrátený produkt vznikom stop-kodónu. Ak do sekvencie pribudnú tri nukleotidy, reťazec bude obsahovať aminokyselinu naviac, analogicky, strata troch nukleotidov spôsobí stratu jednej aminokyseliny. Stratou troch nukleotidov sa nemení čtecí rámec, ale stále môže spôsobiť závažné ochorenie. Príkladom môže byť cystické fibróza, ktorú spôsobuje strata fenylalanínu na 508. pozícií bielkovinového reťazca CFTR (cystic fibrosys transmembrane conductance regulator) proteínu, ktorý normálne pôsobí ako chloridový kanál v epitelových bunkách. Mutácia spôsobuje produkciu hustého a lepkavého sekrétu, ktorý spôsobuje poškodenie tráviacej a dýchacej sústavy. Polymorfizmus je všeobecne existencia dvoch alebo viacerých variant (alel, sekvenčných variant,...), ktoré sa v populácii nachádzajú s frekvenciou vyššou alebo rovnou 0,01 (1%). Polymorfizmy sú všeobecne považované za nepatogénne sekvenčné varianty a väčšinou sa nachádzajú v nekódujúcej oblasti DNA. Polymorfizmy zistené pri analýze DNA môžu slúžiť ako génové márkre, ktoré sa využívajú v rôznych oblastiach genetiky (mapovanie genómu, identifikácia génov, DNA diagnostika, forezná genetika,...) Medzi najčastejšie polymorfizmy patria jednonukleotidové polymorfizmy (SNP), polymorfizmy v dĺžke restrikčných fragmentov (RFLP) a polymorfizmus v počte tandemových repetícii (VNTR). Jednonukleotidové polymorfizmy (single nucleotide polymorphism – SNP) vzniká substitúciou, deléciou alebo inzerciou určitého nukleotidu. Väčšina SNP vzniká v nekódujúcich oblastiach DNA. SNP sa často používajú márkre pri štúdiu pravdepodobnosti vzniku ochorenia alebo pri citlivosti k liečbe určitými liekmi,... Polymorfizmus v dĺžke restrikčných fragmentov (restiction fragment lenght polymorphism – RFLP) majú za následok zmenu restrikčného miesta v zmysle straty alebo pridania restrikčného miesta. Po použitý vhodného restrikčného enzýmu tak dochádza k zmene dĺžky restrikčných fragmentov, ktoré môžeme stanoviť metódou Southern blotu. RFLP polymorfizmus sa využíva pri DNA diagnostike (viac v otázke IV/28). Polymorfizmus v počte tandémových repetícii (variable number of tandem repeat polymorphism – VNTR) vzniká zmenou počtu tandémových repetícií (mini- alebo mikrosatelitov) – deléciou alebo inzerciou. V dôsledku tohto polymorfizmu je počet repetícií na homologických chromozómoch odlišný. Minisatelitná DNA má opakujúcu sa jednotku približne 15 – 100 bp, ktorá tvorí úseky dlhé až 20 kb, vyskytujú sa napr. v oblati telomér (u človeka tvorí teloméry opakujúca sa hexanukleotidová repetícia TTAGGG, ktorá zaujíma 3-20 kb). Mikrosatelitná DNA je najčastejšou formou repetitívnej DNA, väčšinou ju tvoria jednotky dlhé menej než 10 bp (najčastejšie 2-5bp), ktoré sa opakujú v dĺžke 150 bp. Nachádzajú sa na rôznych miestach genómu, môžu sa nachádzať aj v intrónoch génov a môžu byť aj v kódujúcich oblastiach. Z dinukleotidových repetícii sú častejšie repetície obsahujúce adenín a tymín (AT) a menej časté obsahujú cytozín a guanín (CG). Najčastejšie dinukleotidové repetície sú CA, ktoré tvoria až 0,5% genómu. Počet mini- a mikrosatelitov je v populácii v danom mieste chromozómu variabilný, ale u jedinca je stabilný. Tento fakt umožňuje vzniku systému dôležitých génových márkerov, ktoré sa využívajú vo forenznej genetike, pri určovaní identity, testoch otcovstva alebo inde. IV/32. DNA a RNA viry – struktura a replikace. Vírusy sú infekčné častice, ktoré sa skladajú z aspoň dvoch základných častí: 1. Genómu, ktorý je zapísaný buď v DNA alebo RNA, ale nie v oboch naraz (ich genóm je veľmi malý). 2. Proteínovej štruktúry, ktorá sa nazýva kapsida a chráni genóm Mnohé vírusy obsahujú aj ďalšie časti, ako napr. obal zložený z fosfolipidovej dvojvrstvy a proteínov, ktorého prítomnosť je rôzna u rôznych druhov vírusov. Kompletná vírusová častica, ktorá obsahuje všetky tieto časti sa nazýva virión. Virión okrem kapsidy a nukleovej kyseliny obsahuje väčšinou aj niekoľko molekúl špecifických virových enzýmov, RNA-primer alebo iné molekuly potrebné pre začiatok reprodukcie. Vírusy sa chovajú ako vnútrobunkový paraziti majúci informáciu potrebnú k vlastnej reprodukcií. Chýba im však schopnosť uvoľňovať z látok energiu a nie sú vybavené proteosyntetickým aparátom. Pri svojej reprodukcií využívajú metabolické a proteosyntetické mechanizmy hostiteľskej bunky. Reprodukcia vírusov je akýmsi modelom syntézy a vzniku bunkových komponent. Prebieha podľa jednoduchého programu postupnej expresie génov a postupného zostavovania vysoko usporiadaných štruktúr, tvorených rôznymi makromolekulami. Podľa hostiteľa s rozlišujú bakteriálne vírusy (bakteriofágy, fágy), fytopatogénne a zoopatogénne vírusy. Pri infekcií virión buď preniká do bunky a tam stráca plášť a kapsid alebo nukleová kyselina je vstrieknutá do hostiteľskej bunky, zatiaľ čo zvyšok viriónu zostane extracelulárne. Podľa typu genetického materiálu sú rozlišované na DNA a RNA vírusy. Genóm DNA vírusov tvorí lineárna ssDNA alebo dsDNA alebo kruhová dsDNA. Genóm niektorých bakteriálnych vírusov je tvorený dsDNA s kohéznymi koncami. Lineárny je však iba vo virione, v bunke sa uzatvára pomocou kohéznych koncov a DNA- ligázy do kruhu. Z bakteriofágov medzi DNA vírusy patrí napr. fág T4, z živočíšnych napr. adenoviry, z ktorých niektoré sú príčinou bežnej respiračnej infekcie, iné však patria medzi onkogénne vírusy. Herpetické vírusy sú DNA vírusy spôsobujúce opar, pásový opar a plané neštovice (ovčie kiahne, varicella). Vírus Epstein-Barrovej (EBV-vírus) je v Európe príčinou infekčnej mononukleózy, no v Afrike vyvoláva zhubný Burkittov lymfóm. Medzi poxviry patrí vírus pravých neštovic (pravých kiahní, varioly). Niektoré z papovavirov vyvolávajú vznik nádorov (napr. opičí vírus SV40). DNA vírusy sa reprodukujú podľa dvoch alternatívnych programov. V tzv. permisívnych bunkách sa tvoria virióny a to podľa lytického (produktívneho) programu. V skore fázy tohto programu sa syntetizujú proteíny potrebné k replikácií nukleovej kyseliny a k regulácií hostiteľskej proteosyntézy v prospech vírusu. V neskorej fáze hostiteľského cyklu sa syntetizujú zložky viriónu (plášťové proteíny, vírusová nukleová kyselina a niekoľko ďalších molekúl), ktoré sa súbežne so svojou syntézou zostavujú vo virióny. Bunka naplnená viriómi potom lyzuje. Pri lytickom cykle je polovica tohto genómu aktívna v skorej fáze infekcie; proti smere hodinových ručičiek sa transkribuje gén pre syntézu veľkého proteínu stimulujúceho replikáciu vírusovej DNA. Pri zostrihu mRNA pre proteín T je vyňatý terminačný kodón, ktorý je však zachovaný v mRNA druhého skorého proteínu (malého proteínu t). Ide o klasický prípad alternatívneho zostrihu a ukážku regulačného významu takéhoto javu. Druhá polovica genómu sa prepisuje do RNA v neskorej fáze a syntetizujú sa plášťové proteíny VP1, VP2 a VP3. N-koncová sekvencia VP3 je rovnaká s C-koncovou sekvenciou VP2. Gén pre Vp1 sa v rozsahu 22 nukleotidov prekrýva s génmi pre VP2 a VP3, číta sa však v inom čtecím rámci než už spomínané 2 gény. Genóm SV40 je ukážkou intenzívne využitého priestoru k uloženiu genetickej informácie. V nonpermisívnych bunkách je reprodukcia vírusu zastavená, vírusová DNA v hostiteľskej bunke perzistuje voľne alebo je integrovaná do hostiteľského genómu (latentná infekcia, lysogénny program). Niektoré bunky takto infikované živočíšnym vírusom sa môžu transformovať (in vitro) alebo zvrhnúť v nádorovú bunku (in vivo). Príkladom takéhoto DNA-vírusu je napr. opičí vírus SV40 (simian virus) obsahujúci cirkulárnu dsDNA. V lysogénnom režime vírusu SV40 sú v expresií iba skoré gény (proteíny T). Niektoré z týchto buniek sa v in vitro transformujú, tzn. začnú sa chovať ako nádorové bunky (nekontrolovateľne sa delia, znížia sa ich adhézie k sklu atd.). Injekcia týchto buniek zvieraťu vyvolá nádor. Molekulárne mechanizmy týchto procesov sú intenzívne študované. Hostiteľská bunka nemá enzýmy pre syntézu polynukleotidového reťazca na matrici RNA. Preto RNA-vírusy musia obsahovať informáciu pre syntézu zvláštnej polymerázy, buď RNA-dependentnej RNA-polymerázy alebo RNA-depednentnej DNA- polymerázy. Virion niekedy musí byť vybavený už hotovou takouto polymerázou. Génová expresia vírusovej RNA má rôznu stratégiu, podľa ktorej je možné RNA-vírusy rozdeliť do 4 tried. Do prvej triedy RNA-vírusov patria picornaviry, vrátane polyoviru, pôvodcu detskej prenosnej obrny, a arboviry vrátane pôvodcu kliešťovej encefalitídy. Virion tejto triedy obsahuj (+)ssRNA. Najprv sa na hostiteľských ribozómoch pozdĺž tejto mRNA syntetizuje obrovský proteínový prekurzor (reťazec asi o 2000 aminokyselinách), ktorý sa potom rozštiepi na 7 proteínov. Niektoré z nich sú kapsidové bielkoviny a jeden štep je RNA-dependentná RNA- polymeráza (RNA-replikáza). Tento enzým na templáte virionovej (+)RNA katalyzuje syntézu reťazca (-)RNA a ten použije ako templát k pomnoženiu (+)RNA, teda genómov, ktoré sa zabudujú do nových virových častíc. Na rozdiel od baktérií eukaryotická hostiteľská bunky je schopná prekladať mRNA (aj polygénovú) iba do jediného reťazca. Preto vírus využíva k tvorbe svojich jednotlivých proteínov eukaryotickú posttranslačnú proteolýzu. S podobným mechanizmom sa stretávame napr. pri biosyntéze niektorých peptidových hormónov (ACTH, endorfíny,...). Druhá trieda zahŕňa vírusy obsahujúce v častici(-)ssRNA. Patria sem rhabdoviry, ako je pôvodca vztekliny (besnota, rabies), chrípkové vírusy, vírus príušnic (mumps) a vírus spalniček (osýpky). Teraz je pri expresii vírusu riešená skutočnosť, že genómová RNA je reťazec (-), nepoužitý ako mRNA a že hostiteľská bunka nemá enzým replikujúci (-)RNA. Virion však obsahuje RNA-dependentnú RNA- polmyerázu (replikázu), ktorá najprv na vírusovej genómovej matrici syntetizuje 5 krátkych mRNA. Tie potom na ribozómoch riadia syntézu 5 proteínov (vrátane kapsidového, plášťového a vrátane novej replikázy, ktorá katalyzuje vznik novej úplnej (dlhej) vírusovej (+)RNA a virionovej (+)RNA). Tak je všetko pripravené k zostaveniu virionov. U tejto triedy je problém, ako získať z polygénovej informácie jednotlivé peptidy, riešený na úrovni transkripcie. Syntetizujú sa krátke mRNA, nevzniká proteínový prekurzor, ktorý by bolo nutné posttranslačne upravovať ako pri reprodukcií vírusov 1. triedy. Tretiu triedu tvorí reovirus. Bol nájdený v ľudskom respiračnom a tráviacom systéme, aj keď nespôsoboval zjavné ochorenie (repiration and enteric orphans). V jeho virióne sa nachádza 10 (±)dsRNA a RNA-dependentná RNA-polymeráza, ktorá v hostiteľskej bunke použije (-) reťazce vírusovej RNA ako matricu k syntéze desiatich mRNA. Ich transláciou vzniká 10 vírusových proteínov vrátane novej replikázy. Replikáciou sa potom rozmnožia a vytvoria tiež genómové (±)dsRNA. Jednolivé zložky sa zostavujú v nové viriony. Genóm reoviru teda obsahuje 10 monogénnych mRNA. Do štvrtej triedy sa zaradzujú retroviry (napr. vírus Roussova sarkomu – pôvodca vtáčieho sarkómu alebo vírus HIV – pôvodca AIDS). Názov vyjadruje zvláštnu stratégiu replikácie týchto vírusov, t.j. reverzibilného prenosu informácie z RNA do DNA. Virion vírusu Rousova sarkomu (RSV) obsahuje 2 molekuly (+)ssRNA, RNA-dependentnú DNA-polymerázu (reverznú transkriptázu) a tRNA Trp . Tieto zložky sú obalené kapsidovými proteínmi a lipidovou membránou obsahujúcou vírusový glykoproteín. Po vniknutí vírusu do bunky RNA-dependentná DNA-polymeráza v cytosole prepíše vírusový genóm do reťazca (-)DNA a hneď ho doplní na (±)dsDNA nazývanú provirus. Ako primer pri syntéze DNA slúži virionová tRNA Trp , ktorá bola v predošlom cykle prevzatá od hostiteľskej bunky a asociovala sa na krátky komplementárny úsek vírusovej RNA. Templátová (virionová) RNA je behom syntézy proviru rozložená. Retrovirová DNA je transkribovaná iba vtedy, ak je začlenená (integrovaná)d hostitelského genómu. Ktomu slúžia dlhé koncové repetície (LTR, long termina repeats) na oboch koncoch provirovej DNA. Zahŕňajú úsek U3, R a U5. U5 a U3 sú rozdielne sekvencie, R je repetícia. V LTR sú signálne sekvencie pre integráciu a transkripciu (enhancery, promotry). (±)dsDNA RSV sa najprv zacykluje a potom sa premiestní z cytozolu do jadra. Začlení sa (integruje) na úplne určité miesto vtáčieho genómu (je schopná sa integrovať aj do cicavčieho genómu na rôzne miesta). Genóm RSV obsahuje 4 gény. Gén gag kóduje veľký proteínový prekurzor (polyprotein), z ktorého sa potom proteolyticky oddelí niekoľko virových proteínov. Gén pol nesie informácie pre syntézu reverznej transkriptázy a gén env pre vznik vírusového obalového glykoproteínu. Z lekárskeho hľadiska je zaujímavý gén src, ktorý nie je pre reprodukciu vírusu nutný, avšak jeho produkt vyvoláva malignizáciu bunky (fibroblast mení v sarkómovú bunku). Preto je zaradený do skupiny tzv. onkogénov. Kóduje proteinkinázu, ktorá katalyzuje fosforlyáciu trozínového zvyšku iných proteínov. Mechanizmus, akým tento enzým vyvoláva malígny zvrat, nie je úplne objasnený. Pri expresii genómu RSV sa alternatívnym zostrihom syntetizujú 3 rôzne mRNA. Nezostrihaná mRNA sa stane genómovou, je asociovaná s vírusovými proteínmi a tRNA. Hotový virion „vypučí“ z cytoplazmatickej membrány hostiteľskej bunky, pričom si zoberie časť tejto membrány, bez toho aby bunku lyzoval. Tým sa retoviry líšia od DNA vírusov. Retrovirová DNA sa replikuje s hostiteľským genómom, takže vírus sa prenesie do dcérskych buniek. Na chromozómoch zdravého kurčaťa bol nájdený gén, líšiaci sa štruktúrou iba veľmi málo od vírusového src. Ukázalo sa, že je to normálny bunkový gén zodpovedný za diferenciáciu bunky. Všeobecne sa nazýva protoonkogén a je označovaný ako c-src na rozdiel od vírusového onkogénnu v-src. Boli už objavené desiatky takýchto protoonkogénov. Podľa názoru vedcov bol onkogén prenesený do vírusového genómu sekundárne a ním prenášaný z bunky na bunku (transdukcia). Jeho expresia je potom riadená vírusovým promotorom, ktorý nepodlieha normálnym reguláciam, takže nie je zaručená fyziologická hladina jeho produktu. Niektoré vírusové promotory sú veľmi výkonné. Vírusové onkogénny nemajú intróny, na rozdiel od bunkových protoonkogénov. Retrovirové onkogénny je možné podľa ich produktov deliť do 5 skupín: 1. Onkogény kódujúce tyrozínovú proteinkinázu (napr. src) 2. Onkogény kódujúce bielkovinu s funkciou rastového faktoru (napr. onkogén sis kóduje proteín takmer rovnaký ako PDGF) 3. Onkogény s informáciou pre syntézu receptorov rastových faktorov (napr. onkogén erb-B) 4. Onkogény riadiace vznik proteínov viažucich guanylnukleotidy, teda G-proteiny (napr. onkogen Ha-ras), takéto produkty potom nie sú schopné štiepiť GTP, čo poruší regulačné vlastnosti G-proteinu a spôsobí malignizáciu buniek 5. Onkogény kódujúce jadrové regulačné proteíny (napr. onkogén myb) Z rozmanitosti produktov onkogénov vyplýva, že mechanizmy onkogenézy sú rôzne, pretože tieto proteíny zasahujú do rôznych stupňov regulácie bunkovej diferenciácie a proliferácie. Onkogén Erb-B napr. produkuje iba tyrozinkinázovú časť membránového receptoru pre epidermálny rastový faktor EGF. Na normálnom receptore je tyrozínkináza aktívna iba po naviazaní EGF na receptor. Produkt onkogénu Erb-B však tuto väzbovú časť neobsahuje a kinázová aktivita je konštitučne odblokovaná. Virus Rousova sarkómu bol príkladom tzv. akútne transformujúceho vírusu. Patria sem tiež akútne leukemické vírusy. In vitro sú takýmito vírusmi bunky transformované behom 2-3 týždňov. Onkogén je v tomto prípade vložený do vírusového genómu a jeho transkripcia je riadená vírusovým promotorom. Existuje ešte skupina pomaly transformujúcich vírusov (napr. chronické leukemické vírusy), ktoré transformáciu buniek navodia až po 4-12 mesiacoch. Genómy týchto vírusov neobsahujú onkogén. Bunku malignizujú až vtedy, ak sú integrované v susedstve normálneho bunkového protoonkogénu, ktorý je potom riadený výkonným provirovým promotorom. Niektoré retroviry sú nebezpečné bez toho, aby navodzovali maligný zvrat. Vírus ľudskej imunodeficiencie (HIV, human imunodeficiency virus) vyvoláva syndróm získanej imunitnej nedostatočnosti (AIDS, acquired immune deficiency syndrome). Vírus je príbuzný lymfotropnému viru, ktorý u človeka vyvoláva vzácne leukémiu (HTLV-I). Vírus HIV infikuje lymfocyty T4 a lyzuje ich. Tým organizmus stráca dôležitú zložku imunitnej obrany. Lymfocyty T4 sú totiž potrebné k uchovaniu pamäte pre sekundárnu imunitnú odpoveď, majú význam pri zrení B-buniek v plazmatické bunky, produkujúce protilátky a pre zrenie lymfocytov T8, potrebných k odstraňovaniu infikovaných buniek. Človek umiera na bežnú infekciu alebo na maligný nádor. Intenzívne štúdie tohto vírusu zatiaľ nepriniesli výsledky, ktoré by umožnili účinnú terapiu. Thymidinazid je reverznou transkriptázou zaradený do provirusovej DNA a ukončuje predlžovanie reťazca, ktorý neobsahuje voľnú 3 ́-OH skupinu. Liek spomaľuje ochorenie. IV/33. Protoonkogeny. Protoonkogény sú bunkové gény, ktoré môžu vyvolať nekontrolovateľnú bunkovú proliferáciu, ak dôjde k zmene ich sekvencie (mutácie) alebo k chybnej regulácii ich expresie. Boli objavené ako virové onogény (v-onkogény) v nádorových retrovírusoch (onkovírusoch). Tieto vírusy často priberajú do svojho genómu gény hostiteľskej bunky. Ak sú tieto gény v priebehu neskoršej infekcie integrované do hostiteľskej DNA inej bunky, môže dôjsť vo výnimočných prípadoch k tvorbe nádoru. Vírusom indukované nádory sú síce u človeka vzácne, ale ich výskum prispel podstatne k poznaniu protoonkogénov a ich funkcii. Protoonkogény kódujú proteíny podieľajúce sa na regulácii rastových a diferenciačných procesov. Na onkogény sa menia, až keď je ich sekvencia zmenená mutáciami (napr. delécie) alebo ak dôjde zmenou regulácie k ich nadmernej expresii a následnej tvorbe veľkého množstva génového produktu. K nadmernej expresii môže dôjsť, ak sa amplifikáciou vytvorí príliš veľa funkčných kópii génu alebo ak je gén ovplyvnený nadmerne aktívnym promotorom. Ak súčasne dôjde k poruche kontroly onkogénnej expresie produktami tzv. tumor supresorových génov (viac v otázke IV/34) je vyvolaná malígna transformácia a neriadená proliferácia bunky. Väčšinou nevedie zmena jedného protoonkogénu k strate kontroly rastu. Dochádza k nej, ak sa za dlhšiu dobu v jednej bunke zhromaždí viac mutácií a regulačných defektov. Ak sa imunitnému systému nepodarí transformovanú bunku odstrániť, môže dôjsť behom mesiacov až rokov k ich zmnoženiu do do makroskopicky zistiteľného nádoru. Spoločným znakom protoonkogénov je skutočnosť, že kódujú proteíny podieľajúcich sa na procesoch prenosu signálu, pootláčajú bunkový cyklus alebo podporujú apoptózu. K označeniu génov sa používajú skratky troch písmen, ktoré väčšinou ukazujú na pôvod vírusového génu a sú písané kurzívou (napr. myc pre myelocytomatózu – vírusové ochorenie vtákov). Produkty protoonkogénov podľa funkcie delíme na: 1. Ligandy receptorov, napr. rastových faktorov a cytokínov aktivujú bunkovú proliferáciu 2. Membránové receptory typu 1-helix s tyrozinkinázovou aktivitou (RTK), ktoré môžu viazať rastové faktory a hormóny 3. Proteíny viažuce GTP a adaptorové proteíny – patria sem G-proteíny v užšom zmysle a príbuzné proteíny ako Ras (produkt onkogénnu c-ras) 4. Receptory pre lipofilné hormóny sprostredkujúce účinok steroidných hormónov a príbuzných signálnych látok. Riadia tiež transkripciu určitých génov (viac otázka IV/22). Produkty viacerých protoonkogénov (napr. erbA)patria do nadrodiny ligandami riadených transkripčných faktorov. 5. Nukleárne supresory nádorov potláčajú u definitivne diferencovaných buniek ich návrat do bunkového cyklu. Gény kódujúce tieto funkcie sú preto označované ako antionkogény. 6. Proteíny viažuce DNA. Celá rada protoonkogénov kóduje transkripčné faktory. Pre kontrolu bunkovej proliferácie sú dôležité najmä myc spoločne s fos a jun. Bielkovinové produkty obidvoch posledných génov tvoria heterodimerné transkripčný faktor AP-1. 7. Proteinkinázy zaujímajú ústrednú úlohu v intracelulárnom predávaní signálu. Fosforiláciou proteínov pôsobí zmeny biologickej aktivity, ktoré môžu byť vrátené späť až účinkom proteínfosfatáz. Súčinnosť fosforilácie bielkovín vyvolané proteinkynázami a defosforilácie účinkom proteínfosfatáz (interkonverzia) pôsobí na reguláciu bunkového cyklu a ďalších dňležitých procesov. Proteinkynáza Raf sa účastní najmä na signálnom prenose inzulínu. IV/34. Tumor supresorové geny. Tumor supresorové gény (tiež antionkogény alebo recesívne onkogénny) sú druhým typom génov, ktoré môžu vyvolať malígnu transformáciu bunky (ďalšie sú protoonkogény a mutátorové gény). Produkty tumor supresorových génov regulujú najmä priebeh bunkového cyklu (IV/35) a niektoré sa tiež zúčastňujú procesov reparácie DNA (otázky IV/17 a IV/18). Na rozdiel od produktov protoonkogénov, produkty tumor supresorových génov majú hlavne antiproliferačný účinok, podporujú diferenciáciu a apopotózu. K poruche kontroly bunkového cyklu vedie chýbanie oboch alel určitého tumor supresorového génu (napr. deléciou), zmenou ich štruktúry (napr. bodovou mutáciou) alebo inaktiváciou nimi kódovaného produktu. Mutácie v tumor supresorových génoch majú recesívny charakter. S týmto súvisí tzv. dvojzásahová teória, ktorá bola prvý krát vysvetľovaná navzniku vzácneho dedičného retinoblastómu. Na rozdiel od oveľa častejšieho sporadického retinoblastómu, kde sa jedná o náhodné mutácie jednej a nasledovne druhej alely v bunkách sietnice, je u dedičnej formy jedna mutovaná alela zdedená, príslušný jedinec je teda heterozygót, u ktorého sa zdedená nádorová predispozícia zatiaľ neprejavuje. Ak dôjde k mutácii alebo eliminácii druhej alely, iniciuje sa rozvoj nádorového klonu buniek sietnice. Tomuto procesu sa hovorí strata heterozygozity (LOH – Loss Of Heterozigoyzity). Medzi najvýznamnejšie tumor supresorové gény patria Rb, p53, BCR1, BCR2 a iné. Rb gén (Retinoblastoma) je prvý objavený tumor supresorový gén, ktorý sa vyskytuje v každej bunke, kde reguluje bunkový cyklus. Jeho produkt, Rb- proteín, spolu s p53-proteínom, funguje ako akási brzda bunkovej proliferácie. Rb negatívne reguluje dôležitý transkripčný faktor E2F. Delécia Rb-génu, ku ktorej dochádza pri vzniku kongenitálneho retinoblastómu, alebo sekvestrácia jeho produktu v prítomnosti adenovirového proteínu E1A alebo proteínu E7 (pri infekcií vírusom ľudského papilómu) navodí odblokovaní supresie E2F. Naopak p53 pôsobí tým, že podporuje expresiu p21/CIP, ktorý je mohuntným inhibítorom kináz regulujúcich bunkový cyklus (cyklín dependentné kinázy). Strata regulačnej funkcie Rb-génu v bunkovom cykle alebo nadmerná expresia c- myc vedú k zvýšenej proliferácii, ale aj k zvýšenej apoptóze postihnutých buniek. Virogénne produkty, ako je E1A (infekcia adenovirom, T121-antigén (z SV-viru) alebo E7 (z ľudského papilomavíru) sa viažu a Rb a majú potom podobný účinok. V tomto štádiu počet transformovaných buniek zatiaľ nenarastá. Avšak ďalšia zmena, spôsobujúca stratu p19ARF alebo mutáciu p53 alebo nadmernou expresiou bcl-2, vedie k zvýšenej proliferácií a k zníženej apoptóze. Prispievajú k tomu génové produkty ako E1B (z adenoviru), veľký antigén z SV-víru a E-6 antigén z papillomavíru, ktoré sa viažu na proteín p53. Apoptóza, respektíve tendencia k jej zníženiu má kľúčový význam pre malígny rozvoj. Gén p53 (alebo tiež TP53 – tumor protein 53) kóduje kľúčový regulačný faktor, ktorý monitoruje postihnutie DNA. Interakcia p53 býva jedným z prvých krokov, ktorý vedie k malígnej transformácií pri vývoji mnohých nádorových ochorení. Pacienti s Li- Frameniho syndrómom majú väčšinou jednu mutantnú alelu v zárodočných bunkách a tým aj zvýšené riziko vzniku sarkómov, leukémie a karcinómu mliečnej žľazy. Gén p53 sa nazýva aj strážca genómu a reaguje na poškodenie DNA dočasným pozastavením cyklu a umožnením tak oprave chýb (tzv. veľký repair). Gén p53 však nie je priamo odpovedný za pozastavenie cyklu, ani za reparáciu chýb. Zahájenie a trvanie kľudového štádia kontroluje prostredníctvom génov, ktorých transkripčnú aktivitu riadi proteín p53. Gén p53 sa uplatňuje aj v 2. Kontrolnom bode interfázy – pozastavením bunkového cyklu v tomto období umožňuje tzv. postreplikačný repair. Gén p53 ďalej vyvoláva a koordinuje apoptózu, keď reparácia DNA nie je úspešná. IV/35. Buněčný cyklus, úloha komplexů cyklinů a cdks (cyklin dependentní kinázy). Všetky bunky organizmu vznkajú bunkovým delením. Tento proces je možné rozdeliť na rast bunky, duplikáciu jej súčasti (ako sú DNA, organely, atď) a vlastné delenie. U dospelého človeka sa v každej sekunde rozdelí niekoľko miliónov buniek. Proliferujúce bunky prechádzajú deliacim cyklom (bunkovým cyklom), ktorý u cicavčích buniek v tkanivovej kultúre trvá asi 2 hodín. Cyklus sa delí na štyri odlišné fázy, ktoré prebiehajú v poradí G 1 , S, G 2 a M. Diferencované bunky sa naopak delia veľmi zriedka alebo vôbec. Ukončili fázu G 1 a nachádzajú sa v kľudovej fáze, tzv. fáze G 0 , v ktorej môžu zotrvať dlhodobo. Vplyvom mitogénnych signálov (rastové hormóny , cytokíny, nádorove vírusy, etc.) prejde veľa odpočívajúcich buniek späť do fázy G 1 a po prekročení kontrolného bodu zahajujú bunkové delenie. Behom fázy S dochádza k replikácii DNA a tvorbe nového chromatínu (viac otázka IV/16). Nasledujúca fáza G 2 je prípravou mitózy a v jej priebehu je napr. syntetizovaný tubulín pre tvorbu deliaceho vretienka. Morfologicky zvláštne nápadná je krátka fáza M, pri ktorej dochádza k oddeleniu chromatíd (vlastná mitóza) a vzniku dcérskych buniek (cytokinéza). Fázy M a S oddeľujú úseky označované ako fázy G 1 a G 2 (podľa gap – medzera). Behom fázy G 1 bunka následkom neosyntézy svojich súčastí rastie, vo fáze G 2 dochádza k príprave na mitózu. Súhrnne označujeme fázy G 1 , G 0 , S a G 2 ako interfázu, ktorá je v bunkovom cykle vystriedaná krátkou fázou M. Somatické bunky sa v jednotlivých tkanivách delia odlišnou frekvenciou. Svalové a nervové bunky sa za normálnych okolností nedelia (existujú však aj výnimky) a nachádzajú sa trvalo vo fázy G 0 . Bunky ostatných tkanív a orgánov sa delia zriedka, ale môžu byť k deleniu stimulované rastovými faktormi (napr. hepatocyty). Naopak spermie, bunky kostnej drene, pokožky alebo tráviaceho systému sa delia rýchlo a pravidelne. Aby bunkový cyklus prebiehal riadene, existujú kontrolné body, v ktorých sa bunka rozhoduje, či bude alebo nebude bukový cyklus pokračovať. V kontrolnom bode na konci fázy G 1 sa rozhoduje o ďalšom pokračovaní bunkového cyklu. Kontrolný body G 2 /M na konci G 2 fázy spúšťa mitózu a kontrolný bod metafáza/anafáza behom fázy M spúšťa cytokinézu. Priebeh bunkového cyklu je pod kontrolou rodiny cyklíndependentných kináz (Cdk 1-6). Ide o Ser/Thr-špecifické proteínkinázy, na ktoré sa musí naviazať aktivačný proteínz rodiny cyklínov (cyklín A-D), aby došlo k ich aktivácii. V porovnaní strvalou prítomnosťou Cdk behom bunkového cyklu sa koncentrácia jednotlivých cyklínov výrazne mení, pretože sú syntetizované fázovo špecificky a procesom ubikvitinácie sú v proteazómoch opäť rýchlo degradované. Preto je k aktivácii Cdk nutná prítomnosť vhodného cyklínu ďalšie mechanizmy slúžia dodatočnej kontrole proteínkinázovej aktivity komplexov cyklínu a Cdk. Pre jednotlivé fázy bunkového cyklu sú charakteristické určité kombinácie komplexov cyklínu s Cdk. Každý z nich má ako substrát špecifcké proteíny, ktorých funkcia a štruktúra je riadená fosforyláciou alebo defosforyláciou. K substrátom komplexov cyklín-Cdk patria proteíny bunkového jadra, transkripčné faktory a ich inhibítory, enzýmy bunkového jadra meniace chromatín a DNA, proteíny Golgiho aparátu alebo centrozómy. Prekročenie všetkých troch kontrolných bodov je možné iba s pomocou aktívnych komplexov cyklínov s Cdk, bez nich sa bunkový cyklus zastaví. Tato kontrola zaručuje, že deliaca sa bunka je dostatočne veľká, DNA intaktná a predchádzajúce fázy delenia prebehli v plnom rozsahu. Kontrolu bunkového cyklu je možné si predstaviť ako sieť pozitívnych a negatívnych proteínových interakcii, ktoré sú schopné vyvolať bunkové delenie, ak pre to existujú všetky predpoklady. V centre riadenia bunkového cyklu sa nachádzajú Cdk, ktorých aktivita je striktne kontrolovaná a riadená na rôznych úrovniach prostredníctvom väzby ich aktivujúcich podjednotiek cyklínov, väzby na negatívne regulátory (Cdk-inhibítory, CKI), fosforylácie/defosforylácie a tiež zbalovaním alebo subcelulárnou lokalizáciou. Aby mohol heterodimérny komplex cylíku a Cdk pôsobiť ako proteínkináza, musí byť ešte špecificky fosforylovaný Cdk-aktivujúcou kinázou (CAK). V prípade CAK ide o zvláštny komplex cyklínu s Cdk (Cdk7/cyklín H) obsahujúci ešte iný proteín (Mat1). Ďalšia fosforylácia účinkom proteínkináz Wee1 a Myt1 naopak Cdk inaktivujú, čo môže byť opäť potlačené proteínfosfatázou Cdc25. Cdk-inhibítory (CKI)patria do dvoch rodín. Zástupcovia rodiny INK4 sa viažu a následne inhibujú Cdk. Zástupcova rodiny Cip/Kip sa naopak viažu na aktívny komplex cyklínu s Cdk. K definitívnej inaktivácii komplexu cyklínu s Cdk dochádza následkom ubikvitinácie cyklínu, ktorá navodí jeho rozštiepenie v proteazómoch. Zvyšná inaktívna Cdk môže byť využitá v nasledujúcom cykle. V bunke získavajú následne prevahu proteínfosfatázy a defosforylujú všetky proteíny, ktoré sa zúčastnili príslušnej fázy bunkového cyklu vrátane Cdk. Regulácie bunkového cyklu sa zúčastňujú aj významné produkty protoonkogénov (otázka IV/33) a tumor supresorových génov (otázka IV/34). IV/31. Ubikvitinace a proteazomální degradace proteinů Proteíny označené na degradáciu pomocou cytoplazmatického ubiquitin-proteazomálneho systému sú najprv modifikované pomocou kovalentného naviazania ubiquitínu na molekulu. Ubiquitín (Ub) je malý, globulárny neenzymatický proteín. Ubiquitinácia konkrétnej zlúčeniny prebieha pomocou izopeptidového naviazania α-karboxylovej skupiny medzi C-koncovým glycínom Ub na ε-amino skupiny lyzínu proteínu v trojkrokovej, enzymatickej, ATP-dependentnej reakcie. Využívajú sa pri nej tri enzýmy- Enzým č.1 (aktivačný enzým) aktivuje Ub, ktorý je potom prenesený na enzým č.2 (konjugačný enzým), enzým č. 3 (ligáza) rozpoznáva proteín, určený na degradáciu a následne interaguje s E2-Ub komplexom. Následné naviazanie štyroch a viac molekúl Ub na proteíny vytvára polyubiquitínový reťazec. Bielkoviny označené Ub sú rozpoznávané veľkými, súdkovitými, makromolekulárnymi proteolytickými komplexmi nazývanými proteazómy. Proteazómy rozkladajú, deubiquitinujú a rozstrihajú proteíny na fragmenty, ktoré sú ďalej degradované pomocou cytozolickými proteázami na aminokyseliny, ktoré sú následne premiestnené do zásobárne aminokyselín. Ub je následne recyklovaný. Degradácia pomocou ubiquitin-proteazomálneho systému (na rozdiel od hydrolýzy proteolytickými enzýmami) vyžaduje príun energie vo forme ATP. IV/37. Biochemie apoptózy, příklady pro- a antiapoptotických genů/proteinů. Kaspázy. Úloha mitochondrií v buněčné smrti. Počet buniek v určitom tkanive je určovaný v podstate dvomi procesmi –množením buniek (proliferáciou) a fyziologickou bunkovou smrťou – apoptózou. Oba deje sú regulované stimulačnými a inhibičným faktormi, ktoré môžu existovať buď v rozpustnej forme (rastové faktory a cytokíny) alebo sú prezentované naviazané na povrchu okolitých buniek. Od apoptózy je treba odlíšiť nekrózu, pri ktorej je príčinou bunkovej smrti väčšinou fyzikálne alebo chemické poškodenie. Apoptózu považujeme za geneticky naprogramovanú smrť bunky, ktorá je nasledovaná „čistou“ deštrukciou bunky a recykláciou jej súčastí. Morfologicky je pre apoptózu typické zvraštenie bunky , zmeny bunkovej membrány (odškrtenie vačkov zvaných apoptotické telieska), zmrštenie bunkového jadra, kondenzácia chromatínu a fragmentácia DNA. K typickým biochemickým zmenám riadime najmä prítomnosť negatívne nabitého fosfatidylserínu na plazmatickej membráne. Tento signál rozpoznávajú makrofágy a ďalšie fagocytujúce bunky, ktoré apoptotické bunky odstránia fagocytózou bez toho, aby došlo k vzniku zánetlivých prejavov. S pomocou apoptózy nie je kontrolovaný len rozsah tkaniva (presnejšie počet buniek), ale dochádza aj k odstráneniu nežiaducich alebo prebytočných buniek, napr. v priebehu embryonálneho vývoja či v imunitnom alebo nervovom systéme. Apoptózou sú eliminované aj choré bunky ako bunky nádorové, bunky napadnuté vírusmi alebo bunky s ireparabilne poškodenou DNA. Za bežný príklad je možné považovať odlupovanie pokožky po spálení slnkom. V centre procesu apoptózy sa nachádzajú kaspázy (cysteine aspartic acid enzyme), skupina špecializovaných cysteínproteáz, ktoré štiepia v okolí aminokyseliny aspartátu. Vytvárajú enzymatickú kaskádu, ktorej články sa v kľudovom stave vyskytujú v cytoplazme ako prokaspázy a je možné ich aktivovať limitovanou proteolýzou. Kaskádu začínajú iniciačné kaspázy (kaspáza – 2, 8, 9 a 10) kontrolujúce efektorové kaspázy (kaspáza – 3, 6 a 7), ktoré sa fixujú na dôležité bunkové proteíny a štiepia ich, čo následne vyvolá bunkovú smrť. Častými substrátmi efektorových kaspáz sú láminy jadrovej membrány, transkripčné faktory, proteíny snRP a inhibítory zvláštnych DNáz fragmentujúcich potom jadrovú DNA. Apoptózu ovplyvňuje mnoho extracelulárnych a intracelulárnych signálov. Vonkajšiu (zevní) dráhu apoptózy zahajujú ligandy na bunkovom povrchu svojou väzbou na receptory receptorovej rodiny faktorov nekrózy nádorov (TNFR – tumor necrosis factor receptor, tzv.“ receptory smrti“). Radíme k nim aj receptory Fas vyskytujúce sa na plazmatickej membráne väčšiny somatických buniek. Ak sa naviažu ligandy Fas na receptory Fas, dôjde k trimerizácii receptorov. Táto zmena aktivuje vo vnútri bunky prostredníctvom adaptorového proteínu FADD (Fas-associated death domain) iniciačné kaspázy – 8 a 10, ktoré spustia proces apoptózy. Vnútorná (vnitřní), mitochondriálna dráha je vyvolaná genotoxicky (poškodenie) alebo oxidačným stresom. Počas jej priebehu dochádza za účasti proteínov Bcl k permeabilizácii vonkajšej mitochondriálnej membrány, ktorou vstúpia mitochondriálne proteíny do cytoplazmy. Kaspázovú kaskádu tu spúšťa hlavne cytochrom c svojou väzbou na adaptorový proteín Apaf1, čo má za výsledok vytvorenie apoptozómu, kruhového heptaméru rekrutujúceho iniciačnú prokaspázu-9, ktorou aktivuje kaspázu-9. Do rodiny proteínov Bcl patria proapoptotické (hlavne Bad, Bak, Bax a Bid) a antiapoptotické proteíny (hlavne Bcl-2). Labilná rovnováha medzi týmito proteínmi Bcl sa pri strese vychýli smerom k apoptóze . Tiež štiepenie Bid na tBid pôsobením kaspázy-8 aktivuje Bcl-2, čím dochádza k prepojeniu vnútornej signálnej dráhy pre vyvolanie apoptózy s vonkajšou signálnou dráhou, ktorá tak môže byť posilnená. Extracelulárne rastové faktory inaktivujú Bad alebo potláčajú produkciu Bcl-2 a chránia tak pred apoptózou. Nakoniec štiepia aktivované iniciačné kaspázy-8, 9 a 10 prokaspázu-3 a tak spúšťajú kaskádu apoptózy. IV/38. Epigenetika, modifikace histonů, metylace DNA, význam. Epigenetické mechanizmy menia génovú expresiu, ale nie sú spôsobené zmenami v sekvencií DNA, ale majú dedičný význam. Epigenetické mechanizmy hrajú významnú úlohu pri kontrole génovej expresie. Medzi najvýznamnejšie epigenetické mechanizmy patrí metylácia DNA, modifikácie histónov, genomický imprinting alebo inaktivácia X chromozómu. Metylácia DNA sa považuje za mechanizmus, ktorým sa tlmí transkripcia. Je zaisťovaná enzýmami metyltransferázami, ktoré metylujú cytozínové zvyšky za vzniku 5-metylcytozínu, najmä v dinukleotidových sekvenciách CG. Sekvencie CG sa vyskytujú na rôznych miestach genómu Okrem toho vytvárajú CpG ostrovčeky, ktoré sú súčasťou promotorických oblastí mnohých génov, ale môžu sa vyskytovať aj v prvom exóne alebo iných častiach kódujúcej sekvencie Pri regulácií transkripcie hraje úlohu predovšetkým metylácia v oblasti promotoru. Metylácia DNA súvisí úzko s modifikáciou histónov, hlavne s rozsahom ich acetylácie a tým zmenou konformácie chromatínu. Metylácia DNA a deacetylácia histónov vyústia v silno kondenzovaný stav chromatínu, ktorýneumožňuje pripojenie RNA- polymerázy. V priebehu replikácie DNA je metylovaný iba pôvodný reťazec DNA. Metyltransferázy rozpoznávajú prednostne hemimetylovanú DNA, metylujú cytozíny na novom reťazci a tým zaisťujú, že novo syntetizovaný reťazec DNA bude mať rovnako metylované cpG ako pôvodný reťazec. Týmto spôsobom je metylačná vzorka kopírovaná do dcérskych buniek. Zdá sa, že úloha metylácie v regulácií génovej expresie spočíva v špeciálnej biologickej funkcii, ktorá je v mnohých ohľadoch veľmi vzácna. Hraje dôležitú úlohu pri diferenciácii (tkanivovo špecifická regulácia expresie génov), súvisí s inaktváciou X chromozómu a s genomickým impritingom. Medzi modifikácie histónov patrí acetylácia, metylácia a fosforylácia. Metylácia lyzínových zbytkov histónov inaktivuje transkripciu DNA a metylácia arginínových zbytkov naopak transkripciu aktivuje. Fosforilácia H1 histónu súvisí s kondenzáciou chromozómov a defosforylácia s ich dekondenzáciou. Rovnako aj acetylácia súvisí so zmenou kondenzácie chromatínu a reguláciou génovej aktivity. Históny sú acetylované v transkripčne aktívnom chromatíne a hypoacetylované v neaktívnom chromatíne. Acetylácia ruší kladný náboj histónov a umožňuje uvoľnenie väzby z DNA začiatok transkripcie. Deacetylácia histónov vedie k zvýšeniu kladného náboja a k tesnej elektrostatickej väzbe s DNA v inaktivovanom chromatíne. Tieto modifikácie zaisťujú enzýmy histon acetyltransferázy a histon deacetylázy. Mnoho transkipčných faktorov má aktivitu histon acetyltransferázy, ktorá pôsobí ako koaktivátor transkripcie, alebo histon deacetylázy, ktorá pôsobí ako korepresor génovej expresie. Deacetylácia histónov súvisí úzko s metyláciou DNA a prestavbou chromatínu do inaktívnej formy. Enzymatický komplex obsahujúci histon deacetylázy sa viaže na metylovanú DNA prostredníctvom väzobných proteínov MeCP1 a MeCP2, čo vedie k zmenám štruktúry chromatínu. Ide o komplexný proces na ktorom sa podieľajú aj iné proteíny (napr. HP1 proteín). Ak je tento proces narušený, dochádza k zmene transkripčnej aktivity. Asi 15. ďeň po oplodnení je jeden z dvoch XX chromozomov ženy inaktivovaný pomocou špiralizácie. Takto sa kompenzuje nerovnováha v počte X chromozómov u muža a ženy. To, ktorý X chromozóm v bunke bude inaktivovaný je náhodné, ale v klonoch pôvodnej bunky bude inaktivovaný rovnaký X chromozóm ako v materskej bunke. Tým pádom je ženský organizmus mozaikou buniek s inaktivovaným materským alebo otcovským X chromozómom. Proces inaktivácie je kontrolovaný X- inaktivačným centrom, ktoré obsahuje viaceré súčasti. Jednou z nich je gén Xist (X inactivate specific tranport), ktorý kóduje transkript mRNA dlhý 17kb. Transkript nepreniká do cytoplazmy, ale viaže sa na X chromatín, z ktorého bol prepísaný a ovplyvňuje jeho štruktúru. Inou súčasťou je gén Xce (X chromosome controlling element), ktorý pravdepodobne kontroluje, ktorý z dvoch X chcromozómov bude inaktivovaný a ktorý nie. Potom, čo je inaktivovaný X chromozóm pokrytý RNA transkriptom, dochádza k jeho neskorej replikácií, hypoacetlyácií histónov a hypermetylácií DNA. Niektoré gény ostávajú aktívne na inaktivovanom X chromozóme (najmä gény na pseudoautozomálnych oblastiach chromozómu). Na určitých lokusoch je potlačená expresia jednej alely, buď maternálneho alebo paternálneho pôvodu, čo vyvoláva monoalelickú expresiu. Jav bol nazvaný genomický impriting a je definovaný ako forma aktivácie a inaktivácie alely, ktorá závisí na rodičovskom pôvode chromozómu. Môže sa týkať všetkých tkanív, v ktorý je gen exprimovaný alebo len niektorých (tkanivová špecifickosť), zatiaľ čo v ostatných sú vyjadrené obe alely génu. Výber imprintovanej alely nie je náhodný, to znamená, že záleží na tom , či je potlačená maternálna alebo paternálna alela. Tento stav sa prenáša do dcérskych buniek , v ktorý je potlačená expresia vždy rovnakej alely. Mechanizmus genomického imprintingu, teda rpzlišenie jednotlivých alel a označenie jednej z nich na imprinting nie je úplne objasnený a nie je ani známe v ktorom štádiu sú alely imprintované. Na udržanie tohto stavu sa však podieľa alelovo špecifická DNA metylácia. Inaktívne alely majú metylované CG dinukleotidy v CpG ostrovčekoch promotoru. Imprinting u človek sa týka viac asi 30 génov.