Vypracované otázky z MIKROBIOLOGIE PRAKTICKÁ ČÁST 1. LF UK 2015/2016 Kruh 3009 PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 1. 1 1. Indikace, riziko a účelnost mikrobiologického vyšetření  Mikrobiologické vyšetření: = laboratorní stanovení přítomnosti a určení druhů mikroorganismů (bakterií, virů, hub a parazitů) ve vzorcích odebraných ze živého organismu Indikace: - Používá se k potvrzení nebo vyloučení podezření na infekci - Provádí se v případě onemocnění nebo v rámci preventivní prohlídky - Na základě průkazu přítomnosti mikrobů ve vzorcích odebíraných z živé tkáně se může zahájit patřičná léčba - Stanovení citlivosti na antibiotika pomůže vybrat nejvhodnější preparát - Biologický materiál k vyšetření může tvořit krev, moč, stolice, hlen, hnis, stěry z kůže... Princip: - Biologický materiál odeslaný k vyšetření se zpracovává různými způsoby - Základem bakteriologického vyšetření je rozmnožení mikroorganismů pomocí kultivace. Vzorek odebraný z těla se rozprostře na speciální živnou půdu, která umožňuje růst baktérií. - Takto „naočkovaná“ živná půda se uchovává za stanovených teplotních podmínek. Po určité době na ní vyrostou kolonie bakterií. Z těch se potom odebírají vzorky, barví se a vyšetřují pomocí mikroskopu Riziko: - Může dojít ke špatné identifikaci mikroorganismů ve vzorku - Záměna vzorků PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 2. 1 2. Diagnostika bakteriálních onemocnění MIKROSKOPICKÝ PRŮKAZ INFEKČNÍHO AGENS • rychlý průkaz • omezená diagnostická hodnota • přímo z infekčního materiálu nebo z kultivačně zachyceného mikroba MIKROSKOP • optický - nejčastěji používaný • elektronový - použití ve virologii • fluorescenční - diagnostika pomocí fluoreskujících látek Při mikroskopování optickým mikroskopem můžete měnit zvětšení zorného pole pomocí změny objektivu. Na nativní preparáty použijete zvětšení menší (10x, 40x), na barvené preparáty použijete zvětšení 100x (tzv. imerzní objektiv). Při tomto zvětšení musíte již pracovat s imerzním olejem PREPARÁT • nativní - na podložní sklo kápnete přímo tekutý materiál, tuhý materiál rozetřete v kapce fyziologického roztoku. Překryjete krycím sklem a pozorujete. • fixovaný (barvený) - materiál rozetřený na podložním skle necháte zaschnout a potom zfixujete (protáhnutím v plameni kahanu nebo metanolem). Pak můžete preparát barvit. BARVENÍ Barvicí postupy volíme dle požadavku na znázornění bakteriálních struktur. • monochromatické (orientační) - použití jedné barvy • polychromatické - použití 2 a více barev • barvení dle Grama • barvení na acidorezistenci • barvení spor • barvení dle Giemsy • barvení na znázornění pouzder Barvení dle Grama - základní diferenciální barvení v bakteriologii. Rozděluje bakterie na Gram pozitivní (zbarvené modře) a Gram negativní (zbarvené červeně). Toto rozdílné zbarvení je způsobeno odlišným složením buněčné stěny bakterií. Některé bakterie se barví modře i červeně, nazýváme je Gram labilní. Jiné bakterie se velmi těžko barví dle Grama, jsou acidorezistentní (rod Mycobacterium). PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 2. 2 Barvení na acidorezistenci (dle Ziehl-Nielsena) - acidorezistentní tyčky (Mycobacterium tuberculosis) se barví vysoce koncentrovanými barvivy za vyšších teplot červeně, okolí se dobarvuje kontrastní barvou (většinou zeleně). POPIS PREPARÁTU Popisujete preparát zhotovený z infekčního materiálu, nejdříve se zorientujete v zorném poli a pak se zaměříte na popis bakterií - barvitelnost, tvar, uspořádání, velikost, množství (na křížky). ODBĚR MATERIÁLU • infekční původ onemocnění • biologický materiál z nemocného člověka • výtěry dle lokalizace procesu (krk, nos, ucho, rectum) • sputum, hnis, stěr z rány • krev na hemokultivaci nebo na serologické vyšetření • likvor, moč, stolice • bioptický materiál • pitevní materiál • vzorky potravin, stěry z prostředí Podmínky odběru: • správná technika odběru • odběr před zahájením léčby • rychlý a kvalitní transport • správné označení a adresování materiálu KULTIVAČNÍ PRŮKAZ INFEKČNÍHO AGENS • naočkování materiálu do vhodného živného média • inkubace při optimální teplotě • vyhodnocení výsledku (namnožení mikroorganismu) Největší diagnostický význam má v bakteriologii a mykologii, ve virologii se jako vhodné živné médium musí používat živé buňky (kuřecí embrya, tkáňové kultury). KULTIVAČNÍ PODMÍNKY • dostatek biogenních prvků a živin • vlhkost • teplota • pH • plynné prostředí (aerobní, anaerobní, mikroaerofilní) Kultivační postup se liší dle druhu materiálu a požadavku na vyšetření (mykologické, anaerobní) PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 2. 3 KULTIVAČNÍ METODY • aerobní kultivace - nejběžnější, bez omezení přístupu vzduchu k půdě • mikroaerofilní kultivace - snížený obsah O 2 a zvýšný obsah CO 2 • anaerobní kultivace - kultivace na pevných či tekutých půdách s redukujícími substancemi a bez přístupu O 2 (anaerostat). • speciální kultivace • Mykobakterie - dlouhá kultivační doba (týdny), speciální kultivační půdy • Mykologie - dlouhá kultivační doba , speciální kultivační půdy • Virologie - kultivace virů pouze na živých buňkách KULTIVAČNÍ PŮDY • tekuté (pomnožovací) - obsahují masový výtažek, pepton, sole. Bakterie rostou ve formě zákalu, sedimentu, povrchové blanky,.. • pevné - do tekutého základu se přidá agarová řasa. Bakterie rostou ve formě kolonie. Kolonie - statisíce až miliony bakterií namnožených z jedné buňky. Je viditelná pouhým okem, její charakter je většinou typický pro určitý rod (nebo i druh) mikroorganismu. • půdy selektivní - určeny ke kultivaci úzké skupiny bakterií. Růst doprovodné (nežádoucí) mikroflóry je potlačen různými inhibitory (např. antibiotika), k nimž je selektovaný mikroorganismus rezistentní. • půdy diagnostické - tyto půdy obsahují taková aditiva, která zviditelní určité (biochemické) vlastnosti narostlé bakterie pomocí nichž můžeme tuto bakterii předběžně identifikovat již podle vzhledu kolonie. Přehled základních kultivačních půd • tekuté - játrový bujón, anaerobní bujón, Selenitová půda, Šulova půda • pevné - krevní agar, Endova půda, Dezoxycholátový agar (DC agar), Sabouraudova půda, Löwensteinova vaječná půda IZOLACE A IDENTIFIKACE BAKTERIÍ (URČOVÁNÍ ČISTÝCH KULTUR BAKTERIÍ) Odebraný materiál se naočkuje na pevné půdy a také na pomnožovací půdu, z které se po 18 - 24 hodinové kultivaci přeočkuje na pevný agar. Na agarech si po proběhlé kultivaci všímáme narostlých kolonií a jejich vlastností. Při této primokultivaci naroste většinou směs různých kolonií (mikroorganismů), které musíme od sebe nejprve odlišit. Podezdřelé kolonie (možní patogeni) přeočkujeme na čistý agar, aby nám narostla čistá kultura pouze 1 mikroorganismu (izolace kolonie). Kolonie pak popisujeme, popis končí buď určením bakteriálního druhu (rodu) nebo určením dalších postupů vedoucích k identifikaci mikroorganismu. Popis kolonie • druh materiálu, kultivační půda, datum, délka kultivace • vlastnosti kolonie PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 2. 4 • velikost • tvar, profil • povrch • barva • konzistence, zápach • vztah ke kultivační půdě - vrůstání do půdy, hemolýza, viridace, zkvašování laktózy,.. • vztah mikroorganismů navzájem Testy k identifikaci mikroorganismů • Katalázový a oxidázový test • Plazmakoagulázový test ( Staphylococcus aureus) • CAMP test (Streptococcus agalactiae) • Optochinový test ( Streptococcus pneumoniae) • Difterické cuky ( rod Corynebacterium) • Krátká řada cukrů ( čeleď Enterobacteriaceae) - testování biochemických vlastností (zkvašování glukózy, tvorba plynu, ureázy a indolu, tvorba H 2 S, využití anorganického uhlíku). Enterotest I, Enterotest II - rozšířená mikrometoda této krátké řady. STANOVENÍ CITLIVOSTI BAKTERIÍ NA ANTIBIOTIKA • běžná součást vyšetření • umožní nejefektivnější léčbu • různá škála antibiotik pro různé skupiny mikroorganismů Metody stanovení citlivosti • Diskový difuzní test • Stanovení minimální inhibiční koncentrace SEROLOGICKÝ PRŮKAZ INFEKČNÍHO AGENS • Sérologie je součást imunologie • v mikrobiologii sledujeme interakce antigenu (Ag) a protilátky (Ab) v séru nemocného pacienta • sledování protilátek = nepřímá diagnostika • sledování antigenu = přímá diagnostika SLOŽKY REAKCE • Antigen - přirozeně se vyskytující nebo chemicky syntetizovaná substance či molekula, která může stimulovat tvorbu protilátek a je organizmem rozpoznána jako cizí materiál. Antigenem je větší částice (bakterie, buňka, molekula proteinu či cukru) někdy i malé molekuly případně i materiál vlastního organismu. Základním charakteristickým znakem antigenu je povrchový znak - determinanta, který je PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 2. 5 organismem rozpoznán jako cizí. Bakterie, viry, paraziti nebo buňky mají různé antigenní determinanty. Alergen - antigen, který se váže na imunoglobulin typu IgE a může vyvolat alergickou reakci. • Protilátka (imunoglobulin) - protein složený z polypeptidových řetězců. Tvorbu protilátek zajišťují B lymfocyty z kostní dřeně • IgG - tvoří hlavní podíl sérových Ig, prochází placentou • IgA - obrana sliznic (slzy, sliny, bronchiální sekret) • IgM - objevuje se na začátku infekce, má krátkou životnost • IgE - obvykle je v nízké koncentraci • IgD - nejasná funkce POUŽÍVANÉ SEROLOGICKÉ REAKCE • Aglutinace • Precipitace • Reakce vazby komplementu • Difúze a elektroforézy v gelu • Reakce se značenými složkami - imunofluorescence (IF), radioimunoanalýza (RIA), enzymoimunoanalýza (ELISA) • Molekulárně biologické metody - imunoblotting, PCR, hybridizace INTERPRETACE VÝSLEDKŮ • kvalitativní • kvantitativní - titr protilátek (obrácená hodnota posledního pozitivního ředení) Kvůli objektivní detekci vyšetřujeme alespoň 2 vzorky krve odebrané v určitém odstupu - sledujeme dynamiku tvorby protilátek. PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 3. 1 3. Diagnostika virových onemocnění VIROLOGIE • studuje viry - nejmenší infekční činitele • viry se skládají z nukleové kyseliny (DNA nebo RNA) a bílkovinného obalu • viry jsou schopné metabolismu, růstu a dělení pouze v živé hostitelské buňce VYŠETŘOVANÝ MATERIÁL Různé výtěry (nosohltan, spojivky), výplach nosohltanu, kožní léze, obsah puchýřků či jiných změn, moč, stolice, likvor, krev na serologii, pitevní materiál,.. IZOLACE A IDENTIFIKACE Mikroskopie • optický mikroskop - malá rozlišovací schopnost, sledujeme virové inkluze v buňce • elektronový mikroskop - vyšší rozlišovací schopnost, viditelný samotný virus Kultivace Pouze na živých buňkách ! • kuřecí embrya - použití pro citlivé a náročné viry (virus chřipky) • tkáňové kultury = živé buňky z určité tkáně (novotvary, embryonální tkáň) narostlé v tzv. monolyeru - 1 vrstva buňek na dně speciální nádoby pro kultivaci ve virologii. Do této kultivační nádoby se přidá vyšetřovaný materiál, obsahuje-li virus, vytváří se mikroskopem viditelný cytopatogenní efekt (morfologické změny napadených buněk ). Takto namnožený virus identifikujeme většinou serologickými metodami. Serologické metody • přímá i nepřímá diagnostika je široce používána (levnější a rychlejší než kultivace) • často imunofluorescence, ELISA HLAVNÍ ZÁSTUPCI DNA viry - Poxviridae (virus varioly) Herpesviridae (virus herpes simplex, cytomegalovirus, virus Epsteina a Barrové) Hepadnaviridae (virus hepatitidy B) RNA viry - Orthomyxoviridae (virus chřipky) Paramyxoviridae (virus spalniček) Togaviridae (virus zarděnek) Flaviviridae (viry komplexu klíšťové encefalitidy) Rhabdoviridae (virus vztekliny) Retroviridae (viry HIV-1, HIV-2) Pomalé virové infekce a nekonvenční viry (priony) o Creutzfeldt-Jacobova presenilní demence (CJD) o Bovinní transmisivní spongiformní encefalopatie (Nemoc šílených krav) PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 4. 1 4. Diagnostika mykotických onemocnění MYKOLOGIE • studuje infekce člověka způsobené mikromycetami = eukaryontní rostlinné mikroorganismy, představované kvasinkami a vláknitými houbami • infekce jsou různých typů - mykózy, mykotoxikózy, mykoalergózy, mycetismy VYŠETŘOVANÝ MATERIÁL Šupiny, vlasy, nehty, hnis, sputum, různé výtěry, bronchiální sekret, moč, stolice, likvor, krev na serologii nebo na hemokulturu, bioptické vzorky různých tkání, stěry z prostředí,.. IZOLACE A IDENTIFIKACE Mikroskopie • nativní preparáty • projasňované preparáty (odstranění keratinu ze šupin, vlasů,..) • barvené preparáty • mikrokultury Kultivace • speciální půdy tekuté i pevné (Sabouraud, Czapek-Dox, kvasnicový agar, Littmanova půda) • inkubace 10 - 30 dnů při teplotě 25°C, mnohdy paralerně při 37°C • popis kolonie • vzhled makroskopický i vzhled mikroskopický • typ kvasinkovitý nebo vláknitý • testování fyziologických vlastností - fermentace či asimilace glycidů, nutriční požadavky,.. Serologické metody • přímá i nepřímá diagnostika je široce používána HLAVNÍ ZÁSTUPCI Povrchové mykózy - Trichphyton Cladosporium Subkutánní mykózy - Sporothrix Systémové mykózy - Candida albicans Cryptococcus neoformans Aspergillus fumigatus PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 5. 1 5. Diagnostika parazitárních onemocnění Spoléhá především na mikroskopické vyšetření různých klinických materiálů. V některých klinických případech je významný i vyšetření serologické, jen výjimečně také kultivační průkaz. Mikroskopické pozorování parazitů může být prováděno jak v nebarveném preparátu, tak i po obarvení podle Giemsy., hematoxylinem, trichromem, . Před vlastním pozorováním se hlavně vzorky stolice mohou upravit např. zkoncentrováním flotační metodou podle Fausta. Na sklíčko se klinické vzorky nanášejí obvykle ve formě tlustého nátěru, tlusté kapky, krevního nátěru atd. Podmínkou úspěchu mikroskopického vyšetření josu hlavně zkušenosti pozorujícího pracovníka. Významný je i volba metody, která může být velmi usnadněna uvedením pokud možno podrobné anamnézy a diagnostického podezření na průvodce klinického materiálu. Pro mikroskopické vyšetření na střevní parazity se posílají zejména stolice, anální výtěry a perianální stěry či otisky. Vzorky stolice se odebírají ve velikosti lískového ořechu a posílají se v nesterilních zkumavkách. Vzorky se nesmějí zmrazovat, zejména pro améby je nutné vyšetření během 30minut po odběru. V nativním nebo barveném preparátu se hledají červi, jejich části nebo vajíčka. Klasická metoda perianálního stěru se prováděla skleněnou tyčinkou. Dnes je nahrazena perianálním otiskem na průhlednou lepící pásku nalepenou přes anální otvor, paska se potom rovnou nalepí na sklíčko. Pro vyšetření krve se obvykle odebírá kapka z bříška prstu, na podložním sklíčku se pro pozorování nativního preparátu, významného pro diagnostiku trypanosom nebo mikrofiliárií, upravuje zředěním fyziologickým roztokem. Pro barvené preparáty se na sklíčko umisťuje tlusté kapka,nebo tenký nátěr této kapky připravený rozetřením krve hranou druhého sklíčka. Preparát se po zaschnutí barví podle Giemsy. Odběr sputa je významný zejména pro diagnostiku larev Ascaris lumbricoides, odběr bronchoalveolárních laváží pak pro diagnostiku plicních fungi Pneumocystis carinii. Vaginální resp. uretrální výtěry se provádějí sterilními tampony, na sklíčku se barví podle Giemsy pro diagnostiku trichomoniázy. Stěr tamponem ze zadní klenby poševní se barví podle Giemsy, někdy též podle Grama. Mikrobní obraz poševní: Poskytuje orientační obraz stavu osídlení a umožňuje detekci některých specifických patogenů. Složení vaginální mikrobní flóry se mění v závislosti na věku a hormonálních vlivech. U dospělé ženy se klasicky rozeznává šest základních obrazů, některých se rozlišují podtypy, možné jssou i směsné typy: MOP I: (normální), Doderleinovi tyčinky, epitelie, leukocyty MOP II: (nehnisavý bakteriální výtok), koky, tyčinky, případně vibria, bez Doder. Tyčinek, epitelie, leu MOP III: (hnisavý bakt. Výtok), bohatá směs koků a tyčinek, málo epitelií, hodně leukocytů MOP IV: (kapavka), velké množství leukocytů, intra i extracelulární diplokoky, málo epitelií MOP V: (trichomoniáza),trichomonády, ojediněle Doder. Tyčinky, směs různých bakterií, různě epitelií, leukocytů PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 5. 2 MOP VI: (hnisavá,nehnisavá mykóza), kvasinky, epitelie, leukocyty, ojediněle Doderl. Tyčinky V poslední době jsou rozlišovány i další typy MOP Vláknitá laktobaciloza: mimo normální flóru jsou přítomny vláknité bakterie rodu Leptothirx, více epitelií a leukocytů Bakteriální vaginóza: chybí laktobacily, velké množství anaerobních bakterií (Gardnerella vaginals, Bacteoides, Mobiluncus,) Aerobní vaginitida: lactobacily jsou nahrazena Gram pozitivními koky a Gram negativními tyčinkami, vetší množství leukocytů Serologické vyšetřeni: Stanování protilátek nebo detekce antigenů v séru je až na výjimky obecně méně významné než mikrob. Průkaz, sérologické metody slouží v parazitologiii většinou jako pomocné nebo konfirmační. Diagnostický význam výsledků stanovení protilátek může být omezen také seropozitivitou většiny populace, jak je tomu např. u Pneumocystis carinii, která vyvolává onemocnění jen u imunokompromitovaných jedinců. Serologické vyšetření je málo významné u střevních parazitů, pokud nepronikají do jiných orgánů, v tomto případě pak je např. významná diagnostika cysticerkózy vyvolané Taenia solinum metodou ELISA nebo invazivních forem amébiazy vyvolané Entamoeba histolytica průkazem protilátek IgG metodami nepřímé hemaglutinace, imunofluorescence nebo ELISA. Serologické reakce jsou jako jediná diagnostická metoda používány v případech, kdy je přímý průkaz parazita obtížný, zejména u toxokarózy a toxoplasmozy. Prevence a terapie: Prevence parazitárních onemocnění spočívá především v hygienických opatřeních zamezujících rozmnožování přenašečů a kontaktů s nimi,zabezpečení komunální hygieny budováním kanalizace a likvidací odpadů, zabezpečení zdrojů pitné vody a potravin, atd. V našich podmínkách je důležité též seznámit osoby,které cestují do endemických oblastí s možnými riziky a předcházení jim. (např. malarické oblasti- komáři) Terapie parazitárních onemocnění spoléhá především na široké spektrum chemoterapeutik jejichž pouívání je v jednotlivých případech specifické. Jde např o azolové deriváty (metronidazol), antimalarika (chlorochin). Podobně jako u atb existuje riziko rezistence. V některých případech se využívá i mechanické terapie. Př. Chirurgické odstranění cyst. PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 6. + 7. 1 6. Metody přímého průkazu mikrobiálního agens, interpretace výsledků vyšetření. -nález mikroba (pod mikroskopem (mikroskopický průkaz) nebo ho vypěstujeme (izolace mikroba)) - nebo průkaz typických mikrobiálních Ag nebo NK -u mikroskopického průkazu zjišťujeme i identifikaci, citlivost na Atb MIKROSKOPIE: -málo citlivý +rychlý, levný Nativní preparát- při dg syfilidy , ze sekretu tvrdého vředu→vyšetření v zástinu, hledá živě se pohybující trepanomatech + se využívá v parazitologii a mykologii 1. Barevné nátěry: viz otázka 10 Izolace bakterií: nejčastěji pomocí kultivačního průkazu (vypěstování na vhodných půdách), pokus na zvířeti (dnes zřídka)+ rickettsie a chlamydie na kuřecím zárodku popř. buněčných kulturách a. Viz. Otázka kultivační půdy b. Pokus na zvířeti: zásada „tří R“: Refinement (konat jen pečlivě připravené pokusy a co za nejlepších podmínek), Reduction (na nejmenším počtu zvířat a nejméně často), Replacement (nahradit pokus na zvířeti jiným postupem) -v mikrobiologie pokusu na zvířeti třeba k: průkazu inf. Agens (tuberkulóza-likvor-morče, tularímie, brucelóza, moru , antraxu,Q- horečky), průkazu toxinů (podezření na botulismus), materiál: zbytky potravy, krev, střevní obsah mrtvoly), k neutralizačním a protekčním testům (výroba očkovacích látek), k přípravě Ag a imunních sér, získání komplementu a ery, +výzkum 3. Bližší určení vypěstovaného kmene: -nejprve určení orientačně : vzhled kolonií, hemolýza, růst na dalších půdách, citlivost na Ab, druh vzorku.. -ověření rychlými biochemickými testy (př. Oxidasa) -barvení dle Grama : tvar, velikost. Uspořádání - bližší určení: nejčastěji: biochemické a fyziologické vlastnosti izol. Kmene (přeočkování na novou půdu, dříve tzv. pestrá řada (zkumavky s dg půdami, výsledek se projevil změnou zabarvení) -možno využívat tzv. BIOCHEMICKÝCH PROFILŮ (testy se rozčlení např. do trojiv, každý pozitivní výsledek má určitou hodnotu, ty se pak sečtou, tato seřazená čísla představují biochem. Profil →existuje rejstřík: obsahuje % pravděpodobnosti, s jakou daný výsledek odpovídá danému taxonu, seznam atypických výsledků atd. PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 6. + 7. 2 -někdy biochem. Testy nestačí: např. shigelly: nutno určení Ag struktury- sklíčková aglutinace (nutno mít antiséra) využívá se i k identifikaci Escherichia coli- enteropatogenních a enterohemorhagických sérotypů, citrobakterů,pseudomonád.. +behtahemolytické streptokoky: latexová aglutinace (protilátky proti polysacharidu vázány na povrch latex. Částic) + vzácně průkaz toxicity, virulence, pokus na zvířeti -typizace kmenů: výsledky biochemických testů (biotypizace), antibiogram, u některých salmonel (S. typhimurium): fagotypizace-kmen se podrobí účinku řady standardních bakteriofágů → určení dle toho, který fág je lyzován, shigelly: bakteriocinotypiuazace +velký význam : molekulárně epidemiologické metody (postupy založené na vyšetření DNA)- restrikční endonukleázová analýza -určení klonality, zda kmeny dvou pacientů jsou totožné -dále se určuje citlivost na Atb a průkaz bakteriálního toxinu (viz otázka 10.13) Průkaz dalších produktů bakter. Metabolismu: -plynová chromatografie: průkaz hnisu MK (některé anaeroby) - hmotnostní spektrofotometrie: likvor při podezření na basilární meningitidu -dechový test: v zahraničí, průkaz helicobacter pylori- nemocnému se podá roztok urey značené 13 C nebo 14 C,kterou rychle rozštěpí na NH 3 a CO 2 - CO 2 v pacientově dechu PRŮKAZ BAKTERIÁLNÍCH NK: -rozlišujeme metody s a bez amplifikací 1. bez amplifikace: s tzv, genomovou sondou (jednovláknité DNA, chemicky označené, komplementární k DNA mikroba, užívá se k průkazu gonokoků a Chalmydia trachomatis z urogenitálního vzorku 2. s amplifikací: PCR: zahřátí-denaturace dvou vláken, ochlazení: na tato vlákna se připojí krátké syntetické nukleotidy (tzv. primery)- ohraničí hledaný úsek DNA, v přítomnosti Taq polymerágy se primery prodlužují-na každém vlákně vzniká kopie hledané sekvence – provádí se na přístroji tetracykleru, po amplifikaci např. elektroforéza -Mycobakterium tuberculosis, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonnorhoeae... -variantou: LCR: ligázová řet. Reakce: M. tuberculosis, B, burgdorferi, N. gonnrhoeae - metoda NASBA (nucleic acid semence-based amplification)- amplifikuje se RNA, detekce C. trachomatis PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 6. + 7. 3 7. Metody nepřímého průkazu mikrobiálního agens; interpretace výsledků vyšetření; titr protilátek a jeho význam. = průkaz infekčního agens podle nálezu stop, které zanechalo v organismu → na prostou většinu podle nálezu protilátek → tzv. průkaz protilátek nebo sérologický průkaz -měříme protilátky, jaké, množství, kdy jaký nárůst, u časné infekce: přítomnost IgM / IgA -protilátky vzácně: likvor, moč, sliny -průkaz specifické buněčné imunity: kožní testy, aplikace antigenního preparátu z příslušného mikroba → + výsledek: indurace v místě podání vpichu -tuberkulinové testy: do kůže se vpravuje tuberkulin- ag preparát z tuberkulózního mycobacteria PRECIPITACE: - Není nejcitlivější, nastává jen v přítomnosti dostatečného množství protilátek - Vyžívá se jen: PRECIPITAČNÍ neboli VLOČKOVACÍ TESTY NA LUES: tzv. reakce s nespecifickým Ag, Ag v nich není původce choroby ale kardiolipin z hovězích srdcí (průkaz trepanoma pallidum), v séru luetiků často protilátky reagující s kardiolipinem tzv. REAGINY - Reakce VDRL (veneral disease research laboratory), RRR (ryhlá reaginová reakce)-obě : syfilis - Jednoduché ale falešně + v těhotenství, u malárie, nádorových chorob.. AGLUTINACE: -Widalova reakce: slouží k důkazu protilátek břišního typhu a jiných salmoneloz, titr 1:50 podezřelý, 1:100 + -dále dg yersenióz, listeriózy, tulammerie -brucelóza: Wrightova reakce- třeba počítat s výskytem inkompetentních protilátek a prokázat je Coombsovou reakcí -ricketiózy: protilátek proti Proteus vulgarit -protilátky proti leptospirám: reakce aglutinace-lýzy )-odečítá se v zástinu , možno vidět shlukování i rozpad leptospir -HEMAGLUTINACE: jsou-li Ag erytrocyty: Paulova-Bunnellova reakce: průkaz tzv. heterotrofních protilátku inf. Mononukleóz (beraní, hovězí ery, morčecí ledviny) -průkaz chladových aglutininů: dg. Primární atypické pneumonie vyvolané Mycoplasma pneumoniae AGLUTINACE NA NOSIČÍCH: = precipitace převedená na aglutinaci PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 6. + 7. 4 -nosičem ag je povrch vhodné částice (nejčastěji latex)-latexová aglutinace nebo pasivní hemaglutinace (na červené krvinky) -latexfixační test k důkazu revmatoidního faktoru u revmatoidní artritidy -pasivní hemaglutinace → důkaz protilátek proti shigellám, Vi-ag Salmonela Typhi, proti tuberkulinu (Dubosova-Middlebrookova reakce),proti různým parazitům → nejčastěji ale reakce TPHA v dg syfilis KOMPLEMENTFIXAČNÍ REAKCE (KFR) -komplement, který se váže na vznikající komplexy antigen protilátka→ většinou neviditelné → označení indikátorovým neboli hemolytickým systémem = beraní ery senzibilizované protilátkou, jako zdroj komplementu: morčecí séra -pokud se komplement navázal v první fázi reakce → přidané ery zůstávají beze změny→ „zábrana hemolýzy“ -jestliže hledaná protilátka v séru nebyla, komlex ag-protilátka nevznikne, komplement zůstane volný, naváže se indikátor → hemolýza - virologická sérologie, dg respiračních nákaz, exantematických nákaz, neuroinfekcí - v bakteriologii: dg brucelózy, listeriózy, rinoskleromu, u inf. Mycoplasma pneumoniae -parazitologie: echinokokóza, toxoplazmóza NEUTRALIZAČNÍ REAKCE: -ty, při nichž protilátka brání některým biol. Účínkům ag -nejznámější tzv. virusneutralizační test-kdy protilátka neutralizuje infekčnost viru - průkaz antilyzínů: protilátky inhibující hemolýzu působenou hemolyzinu y různých bakterií → nejběžnější reakce ASLO: - průkaz antistreptolyzinu O -průkaz antipneumolyzinz -průkaz antistafylolyzinů alfa a gama METODY SE ZNAČENÝMI SLOŽKAMI -značení fluoreskujícím barvivem nebo enzymem, radioizotopem, těžkým kovem -oproti ostatním sérologickým reakcí umožňuje průkaz jednotlivých tříd Ig -dle druhu označení: 1. Imunofluorescence : -jen jedna složka je označena fluorescenčním barvivem, výsledek se odečítá pomocí fluorescenčního mikroskopu, nejběžnější modifikace: nepřímá imunofluorescence (FTA-ABS- konfirmační test v seros syfilidy), legionely.. 2. Imunoenzymatické testy 3. Radioimuoeseje 4. reakce imunoelektronoptické ELISA -enzyme-linked immuno sorbent assai PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 6. + 7. 5 - je analytická metoda využívaná ke kvantitativnímu stanovení různých antigenů. Tato metoda má řadu variant. Všechny jsou založeny na vysoce specifické interakci antigenu a protilátky, přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navázán enzym (nejčastěji peroxidáza nebo alkalická fosfatáza). Enzym katalyzuje chemickou přeměnu substrátu, který je přidán do reakční směsi, na produkt, který je barevný. Stanovuje se pak spektrofotometricky (viz chromogenní substrát), nebo na základě fluorescence (fluorimetrické stanovení). Koncentrace produktu je úměrná koncentraci antigenu nebo protilátky ve vzorku. Dalším společným znakem metod ELISA je zakotvení (adsorpce nebo kovalentní navázání) antigenu nebo protilátky na nerozpustný nosič. WESTERN BLOT • někdy označován také jako imunoblot • protože je mnoho funkčních proteinů složeno ze dvou nebo více podjednotek, jsou jednotlivé polypeptidy separovány v přítomnosti detergentu dodecylsulfátu sodného (SDS), který denaturuje proteiny • po proběhnutí elektroforézy se proteiny detekují barvením Coomassie modří nebo značením stříbrem • rozdělené polypeptidy lze ale také přenést z gelu na nitrocelulózovou membránu a jednotlivé proteiny detekovat pomocí protilátek • přenos se označuje jako westernový přenos a uskutečňuje se pomocí elektrického proudu • po tomto přenosu se specifický protein identifikuje tak, že se membrána s imobilizovanými proteiny umístní do roztoku obsahujícím protilátku k tomuto proteinu • následně se nenavázané protilátky z membrány odstraní vymytím • přítomnost první (primární) protilátky se detekuje inkubací se sekundární protilátkou • tato sekundární protilátka obecně reaguje s imunoglobuliny • sekundární protilátka je spojena (konjugována) buď s radioaktivním izotopem nebo enzymem INTERPETACE SEROLOGICKÝCH NÁLEZŮ -průkaz protilátek k dg většinou nestačí, znamená to jen, že jedinec už se s agens někdy setkal → výjimka sifilis, HIV -v několika málo případech se můžeme opřít o výši titru -titr protilátek: nejvyšší ředění, v němž ještě došlo k prokazatelné sérologické reakci -u některých chorob vyšší titry jsou odkazem probíhající nebo nedávné infekce - Widalova reakce: 1:100 a vyšší → + výsledky u probíhajícího typhu - vyšší hodnoty mohou signalizovat nedávnou infekci beta-hemolytickými streptokoky - chceme li dg nedávnou infekci vycházíme z dynamiky imunitní reakce: první styk: 10 dnů IgM popř. IgA, během týdne až měsíce se obvykle vytratí -IgG mohou přetrvávat léta až po celý život PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 6. + 7. 6 -pro čerstvost infekce se vyšetřují dva vzorky séra: 1. Akutní –na začátku onemocnění, 2. Rekonvalescentní nejméně za týden po vzorku prvním -právě probíhající infekce: = čtyřnásobný vzestup titru protilátek mezi 1. A 2. Vzorkem, nebo tzv. SEROKONVERZE: v 1. Vzorku nález protilátek -, ve 2. +) → musí být ale oba vzorky vyšetřeny naráz -při interpretaci sérologického nálezu se můžeme dopustit dvojí chyby: -1. Případný nález protilátek můžeme považovat za dg, přitom může jít o protilátky přetrvávající v dětství 2. negativní nález- protilátky se ještě nestihly vytvořit PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – TYPY KULTIVAČNÍCH PŮD A JEJICH VYUŽITÍ 1 8. TYPY KULTIVAČNÍCH PŮD A JEJICH VYUŽITÍ Kultivace o Proces, kdy dochází k rozmnožování bakterií na mediích (půdách). o Je to pěstování a rozmnožování bb. v laboratorních podmínkách. Kultivační půdy o Jsou to média, která se používají pro kultivaci mikroba in vitro. o Půdy musí obsahovat: o Živiny a růstové faktory o Kultivace musí probíhat při optimálním pH a T (v termostatu při 35-37°C) Média: o Pevná o Připravují se z bujonů přidáním agaru (=polysacharid mořských řas) → do 40°C mají gelovitou konzistenci, při více než 80°C půdy tají a dají se rozlít do Petriho misek o Často označované jako agary o Kapalná o =bujóny – kultivace probíhá ve zkumavkách, jamkách, baňkách nebo velkých nádobách tzv. fermentorů Druhy půd: 1. Základní půdy o Používají se ke kultivaci většiny běžných bakterií 2. Obohacené půdy o Použitelné ke kultivaci náročných bakterií (vyžadují např. růstové faktory,..) o Půdy obsahují vitamíny, AMK, cukry, koenzymy, Fe 3+ soli,.. o Např. krevní agar • Růstovým faktorem je hemin • Je nezbytný k růstu hemofilů, Neisseria gonorrhoeae • Hemin se aplikuje do půdy ve formě Hb nebo tepelnou hemolýzou krevního agaru na tzv. čokoládový agar PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – TYPY KULTIVAČNÍCH PŮD A JEJICH VYUŽITÍ 2 3. Diagnostické půdy o Jsou určeny ke sledování určitých znaků izolovaného bakteriálního kmene (např. sleduje se schopnost bakterií utilizovat cukry, citronan, štěpit močovinu – Proteus, Helicobacter, schopnost produkovat charakteristické produkty – sulfan, indol, pigmenty) o Např. diagnostické sety typu Enterotestu 4. Selektivní půdy o Obsahují inhibitory, které zabraňují růstu některých bakterií a umožňují růst bakterií, které tolerují daný inhibitor o Inhibitory – NaCl, žlučové soli, antibiotika o Např. Lowensteinova-Jensenova půda, Šulova půda pro kultivaci mykobakterií 5. Selektivně diagnostické půdy (=diferenciální) o Kombinace dvou předešlých – obsahují inhibitory tak i indikátory o Např. Endova půda, MacConkey či deoxycholát-citrátový agar o Při utilizaci substrátu získávají kolonie bakterií charakteristické zbarvení – žluč- eskulinový agar slouží k identifikaci enterokoků, Rambachův agar slouží k identifikaci enterobakterií 6. Transportní půdy o Určeny pro přepravu choulostivých bakterií do laboratoře o Většinou tekuté o Základem je thioglykolát, fosfátový pufr a soli, obsahují minimum živin, aby nedošlo k nadměrnému pomnožení o Např. Amiesovo médium, Stuartovo médium, Cary-Blairovo médium VYBRANÉ KULTIVAČNÍ PŮDY: 1. ŽIVNÉ PŮDY o Nejběžnější půda obsahuje masový extrakt, pepton a NaCl o Používají se: tekuté (bujón) nebo zahuštěné agarem o Slouží k záchytu většiny bakterií o Většinou tvoří základ pro obohacené půdy 2. KREVNÍ AGAR o Základem je živná půda s přídavkem krve (5-10%) o Krev je ovčí, koňská, králičí nebo lidská o Slouží k záchytu většiny lidských i zvířecích bakterií o Rostou G+ i G- o Lze určit i stupeň hemolýzy – a jak se to POZNÁ? Přece jednoduše, dojde k zesvětlání  o Roste zde např. Proteus (roste plazivě), Candida albicans et tropicalis, Stafylococcus aureus 3. ENDOVA PŮDA o Půda, která obsahuje pepton, NaCl, laktosu, siřičitan sodný a bazický fuchsin, je zahuštěna agarem PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – TYPY KULTIVAČNÍCH PŮD A JEJICH VYUŽITÍ 3 o Je světle růžová, uchovává se ve tmě (je to kvůli tomu, že na světle dále růžoví) o Nerostou zde G+ o Bakterie, která zkvašují laktosu na aldehydy, reagují s fuchsinem za vzniku Schiffových bazí, zbarvujících kolonie do tmavě růžové až dočervena o Slouží pro rozlišení bakterií laktosa-pozitivní a laktosa-negativní o Roste zde: E.coli, Klebsiella pneumoniae 4. MacConkey půda o Obsahuje pepton, NaCl, laktosu a acidobazický indikátor (neutrální červeň nebo bromkresolový purpur) o Je zahuštěna agarem nebo je tekutá o Laktosa-pozitivní bakterie zkvašují laktosu a produkují kyseliny, které vedou ke změně indikátoru do růžova až červena (neutrální červeň) nebo do žluta (bromkresolový purpur) o V tekutém médiu dochází k produkci plynu 5. DEOXYCHOLÁT-CITRÁTOVÝ AGAR (DC agar) o Obsahuje citronan sodný, citronan železitý, thiosíran sodný, deoxycholát sodný, laktosu a acidobazický indikátor (neutrální červeň), je zahuštěna agarem o Je bezbarvá až slabě růžová o Nerostou zde G+, rostou G- o Roste zde Proteus, Salmonela, Citrobacter → tyto bakterie produkují sulfan a kolonie jsou pokryty černou sraženinou sulfidů železa o G-, které zkvašují laktosu, tak se okolí kolonie projeví zbarvením indikátoru do růžova až červena, v koliních je přítomen bílý precipitát o Laktosa-negativní bakterie rostou v bílých koloniích o Je potlačen plazivý růst Protea 6. ŽLUČ-ESKULINOVÝ AGAR o Obsahuje skulin, železité ionty, citronan, žluč, je zahuštěna agarem nebo je tekutá o Bakterie produkují ß-glukosidasu a ta hydrolyzuje eskulin na eskuletin a vytvářejí komplex se železitými ionty a dochází ke zbarvení okolí kolonií do šeda až hnědočerna o Specifický růst pro Enterokoky – např. Enterococcus faecalis – vyvolává infekce močových cest o Růst je potlačen u stafylokoků a streptokoků o Slouží k rozdělení G+ a G- 7. WILSON-BLAIROVA PŮDA o Obsahuje pepton, siřičitan sodný, citronan bismutitý, briliantovou zeleň, hydrogenfosforečnan sodný a síran železitý, je zahuštěna agarem o Je krémová až nažloutlá o Na této půdě rostou Salmonely – černě zbarvené kolonie PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – TYPY KULTIVAČNÍCH PŮD A JEJICH VYUŽITÍ 4 8. CLAUBERGOVA PŮDA o Obsahuje pepton, krev, glycerol, soli a teluričitan draselný, je zahuštěna agarem o Díky teluričitanu je inhibován růst bakterií kromě korynebakterií – Corynebacterium diphtheriae 9. TINSDALOVA PŮDA o Obsahuje pepton, kvasničný extrakt, soli, sérum, cystin a teluričitan draselný o Díky teluričitanu je inhibován růst bakterií mimo korynebakterií o Diferenciační znak – šedočerný zákal (tzv. halo) kolem některých kolonií – slouží k rozlišení Cor. diphtheriae var. gravis, Cor. diphtheriae var. mitis, Cor. diphtheriae var. intermedius, Cor. Ulcerans o Pokud rostou jiné bakterie – Klebsiella, Neisseria,... - tak se tvoří kolonie bez halo 10. ČOKOLÁDOVÝ AGAR o Je to krevní agar, kdy se přidává krev do svarového základu při teplotě 85 °C o Je zbarven dohněda díky tepelně denaturované krvi o Umožňuje růst náročných bakterií – Neisseria gonorrhoeae, bordetely, hemofily 11. LOWENSTEINOVA-JENSENOVA PŮDA o Obsahuje asparagin nebo hydrolyzát kaseinu, glycerol, vaječný žloutek, bílek, škrob, soli a malachitovou zeleň, je zahuštěna koagulovanými vejci o Je žlutá až nazelenalá, zakalená o Je určena pro mykobakterie – ale je nutné očkovaný materiál mořit – NaOH, HCl,.. 12. SABOURAUDOVA PŮDA o Obsahuje pepton, glukosu či manosu, je zahuštěna agarem o Je bezbarvá až nažloutlá o Rostou zde kvasinky a plísně o Např. Candida albicans, Candida tropicalis (kvasinky) 13. Müller-Hinsonův agar (MH agar) o Používá se pro senzitivitu na antibiotika PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – ANAEROBNÍ KULTIVACE 1 9. ANAEROBNÍ KULTIVACE Kultivace • = cílené udržování či rozmnožování mikroorganismů v podmínkách in vitro. • Kultivují se aerobní i anaerobní organismy. • Aerobní mikroorganismy se kultivují na vzduchu. • Anaerobní mikroorganismy je nutno kultivovat v uzavřených systémech (=anaerostaty). • Mezi striktně anaerobní druhy, které žijí jen v prostředí bez kyslíku, patří většina druhů rodu Clostridium. • Indikace vyšetření na anaeroby: o obsah hnisavých abscesů o tracheální a plicní aspiráty o pleurální a ascitecké tekutiny o hnis, bioptické vzorky, krev, žluč • Pro transport uzavřené zkumavky či nádobky s anaerobní atmosférou, použití transportního média (Amiesovo, Stuartovo) pro transport tampónů. • Anaerostaty – zařízení, v nichž je z atmosféry odstraněn kyslík, který je pro striktní anaeroby metabolickým jedem. • Některé organismy snášejí nízké koncentrace kyslíku (=tzv. mikroaerofilní nebo aerotolerantní organismy). • Inkubace probíhá 48 hodin při 37 ̊C. • Vytvoření anaerobního prostředí: • Postupy, které jsou založeny na biologickém, chemickém a fyzikálním principu. PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – ANAEROBNÍ KULTIVACE 2 1. Biologický princip • Tzv. Fortnerova metoda – na část povrchu Petriho misky se naočkuje aerobní bakterie (Serratia marcescens) na zbytek povrchu se naočkuje anaerobní bakterie → miska se uzavře zalepením víčka plastelínou a inkubuje se v termostatu, kdy aerobní bakterie vydýchává kyslík a vytváří tak anaerobní prostředí pro anaerobní růst bakterií. • Kyslík je v malé koncentraci obsažen uvnitř misky, a proto tato metoda není vhodná pro striktní anaeroby. 2. Fyzikální princip • Vytvoření anaerobního prostředí vyčerpáním vzduchu z kultivační nádoby pomocí vývěvy – není 100% a dnes se již nepoužívá. • Dnes se používá metoda, kdy se vytlačí vzduch z anaerostatu profouknutím inertním plynem (dusíkem) nebo směsí plynů. 3. Chemický princip • Zapálení svíčky - dojde k obohacení o CO 2 , zbytková koncentrace kyslíku je značná, použití v nouzových podmínkách. • Založen na odstranění kyslíku reakcí s vhodným činidlem. • Chemické činidlo, které absorbuje kyslík je alkalický roztok pyrogalolu. • Další možností jsou sáčky, které obsahují směs tetrahydridoboritanu nebo horčíku, hydrogenuhličitanu a kyseliny vinné, kdy po přidání vody se vyvíjí vodík a CO 2 → kyslík se spotřebovává s vodíkem na současně vloženém katalyzátoru z jemně rozptýleného kovu (platinová/palladiová čerň); alternativně jemná železná síťka nebo práškové železo - před vložením navlhčit - spotřeba kyslíku korozí železa. Další z možností kultivace anaerobních mikroorganizmů je jejich očkování do vrstev kapalin, ve kterých je přístup vzduchu omezen (pouze v horní vrstvě půdy). Pro omezení přístupu kyslíku v nižších vrstvách lze využít i toho, že se půda po zaočkování mikroorganizmů převrství sterilním parafínovým olejem. → tzv. O/F test PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 10. BARVENÍ BAKTERIÍ, MIKROMYCET A PARAZITŮ 1 10. Způsoby barvení bakterií, mikromycet a parazitů NATIVNÍ PREPARÁTY • Prohlížejí se houby, prvoci (resp. ↑ paraziti) • Příprava preparátu: na podložní sklíčko kápneme kapku mikrobiální kultury nebo suspenzi vzorku ve fyziologickém roztoku, přiklopíme krycím sklíčkem (bez bublinek) a otřeme nadbytek kapaliny a pozorujeme • Imerzní olej se nepoužívá BARVENÉ PREPARÁTY • Charakteristické pro bakterie • Příprava preparátu: naneseme vzorek na sklíčko → fixace → barvení → pozorování • Naneseme kulturu na podložní sklíčko, suspendujeme kulturu v kapce fyziologického roztoku, kapku suspenze usušíme nad plamenem (POZOR: NEUVAŘIT) → účel fixace: usmrcení bakterií + jejich pevné přichycení ke sklíčku, aby se při barvení nesmyly • Fixace: chemicky (methanolem) nebo tepelně • Pozorování: imerzní objektiv (označen 1-2 čárami) → preparát na sklíčku zakápneme kapkou imerzního oleje, krycí sklíčko se nepoužívá • Hrubým posunem ponoříme objektiv do imerzního oleje • Ukončení pozorování: nutné očistit objektiv (buničinou navlhčenou benzinem) • Typy barvení: o Barvení podle Grama o Barvení na acidorezistenci podle Ziehl-Neelsena o Barvení pouzder tuší podle Burriho o Barvení metachromatických granulí podle Alberta • Pro bakterie o velikosti několika μm – používá se mikroskopie s imerzním objektivem s 1000x zvětšením • Pro sledování buněčných struktur bakterií a virů se užívá elektronový mikroskop 1. Barvení podle Grama • Princip: absorpce komplexu krystalové violeti s Lugolovým roztokem (tj. roztok jodu v jodidu draselném) do bakteriálních buněk • Diferenciace bakterií: založena na rozdílném vymývání tohoto komplexu organickým rozpouštědlem (acetonem) z bakteriální stěny • Správnější název: Gramovo odbarvování • Bakteriální stěna obsahuje peptidoglykan (murein) • Stěna G - bakterií: tenká, obsahuje ↑ množství lipidů → tenká stěna umožňuje lepší průnik organického rozpouštědla a snadné vymytí komplexu krystalové violeti z bakterií → musí se dobarvovat obvykle karbolfuchsinem na RŮŽOVO PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 10. BARVENÍ BAKTERIÍ, MIKROMYCET A PARAZITŮ 2 • Stěna G + bakterií: silnější a vrstevnatá → silná stěna neumožňuje průnik barviva a nedochází k vymývání a bakterie zůstává FIALOVÁ • POSTUP: (VLAK) o V – Fixovaný preparát převrstvíme na 2-3 minuty krystalovou VIOLETÍ o L – opláchneme, převrstvíme na 2-3 minuty LUGOLOVÝM roztokem o Opláchneme vodou o A – odbarvujeme acetonem, dokud odtéká fialový roztok o Opláchneme vodou o K – převrstvíme na 1 minutu karbolfuchsinem o Opláchneme vodou a pozorujeme imerzním objektivem 2. Barvení na acidorezistenci podle Ziehl-Neelsena • Barvení acidorezistentních bakterií (mykobakteria) • Obsahují ve stěně 30% lipidů (vosky, mykolové kyseliny) → špatně absorbují barviva a musejí se proto barvit za HORKA (takto absorbovaná barviva se pak nedají vymýt ani odbarvením rozpouštědly s příměsí silných kyselin (acidorezistence) nebo zásad o Pozn.: mykolové kyseliny: mastné kyseliny s ↑ obsahe atomů uhlíků (60-90C) v molekule • Barvení karbolfuchsinem a dobarvují se malachitovou zelení → acidorezistentní organismy se jeví jako růžové na zeleném pozadí • Význam: průkaz mykobakterií ve sputu • POSTUP: o Fixovaný preparát – převrstvit koncentrovaným roztokem karbolfuchsinu o Plamenem zahříváme sklíčko o Po vychladnutí doplníme barvivo a krok 2 dvakrát opakujeme o Opláchneme vodou o Odbarvení – roztokem HCl v etanolu (dokud odtéká růžový roztok) o Opláchneme vodou o Převrstvíme na 30s roztokem malachitové zeleně o Opláchneme vodou, usušíme a pozorujeme imerzním objektivem 3. Barvení podle Giemsy • Princip: absorpce tzv. Giemsova barviva na bázi eosinu a methylenové modři • Preparátem může být tlustá krevní kapka nebo fixovaný vaginální výtěr • Hledané organismy: prvoci, bakterie, rickettsie, chlamydie, mykoplazmata či virové inkluze • Bakterie se barví modře, pouzdra světle modře, sliz růžově • POSTUP: o Fixovaný preparát se podle požadavků ponořuje do koncentrovaného nebo zředěného Giemsova roztoku na 2 minuty, 30 minut nebo přes noc PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 10. BARVENÍ BAKTERIÍ, MIKROMYCET A PARAZITŮ 3 o Opláchneme vodou, usušíme, pozorujeme imerzním objektivem 4. Barvení podle Alberta • Využívá se pro znázornění granul • Tělo bakterie růžové, granula zelená 5. Barvení podle Writz – Conklina • Znázornění bakteriálních spor • Např. spory Clostridium tetanii 6. Barvení podle Burriho • Nátěr na sklíčko → fixace plamenem → barvení → přetření tuší → imerzní olej • Černé pozadí, bakteriální tělo fialové, pouzdro je vidět jako volný prostor BARVENÍ MIKROMYCET • Candida albicans – barví se podle Grama pozitivně • Gramovo barvení – mikromycety (Candidy, Aspergillus,...) • Genciánová violeť – specifické barvivo pro Zygomycety • Cryptococcus – kvasinka s polysacharidovým pouzdrem (barví se tuší podle Burriho) BARVENÍ V PARAZITOLOGII • Barvení podle Giemsy-Romanowského (1 díl G-R + 9 dílů pufrované destilované vody) • Pro parazity o velikosti desítek až stovek μm – používá se suchý objektiv se 4x zvětšením • Barvení Gomoriho trichromem • Barvení Ziehl-Neelsena na střevní kokcidie (Toxoplasma gondii) PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 11. TOXINY 1 11. Metody průkazu produkce toxinů • Toxiny mohou poškozovat hostitele. • Bakteriální toxiny se podle vlastností dělí na exotoxiny, endotoxiny a zvláštní kategorii exotoxinů – enterotoxiny. EXOTOXINY • Jsou produkovány G + , G - bakteriemi a z nich jsou vylučovány do okolí • Jsou to proteiny (mající obvykle enzymatickou aktivitu a jsou termolabilní) o Pozn. termolabilní - citlivý vůči vyšší teplotě, měnící své vlastnosti při vyšších teplotách • Mohou být detoxifikovány např. formaldehydem (využívá se toho při přípravě toxoidů = anatoxinů používaných při imunizaci) • Toxicita je velká, působení je velmi rozmanité • Podle účinku se rozlišují: o Neurotoxiny (např. botulotoxin, tetanospasmin) o Proteolytické toxiny (proteinasy) o Cytotoxiny (cytolysiny) o Hemolysiny (sfingomyelinasa, lecithinasa) o Hydrolytické enzymy (kolagenasa, hyaluronidasa, streptokinasa) o Superantigeny (působí polyklonální aktivaci T lymfocytů – toxin syndromu toxického šoku, M-protein) o Komplexní toxiny (antraxový toxin Bacillus anthracis) • Produkují je: klostridia (Clostridium perfringens) ENDOTOXINY • Jsou součástí vnější membrány G- bakterií • Do okolí se uvolňují až po smrti bakterií • Jsou to lipopolysacharidy • Do vnější membrány jsou zakotvené svou lipidovou částí (toxickým lipidem A), polysacharidový řetězec (O-antigen) vyčnívá do okolí • Jsou termostabilní (odolný vůči ↑ teplotě) • Nejsou inaktivovány teplem, formaldehydem → není možno připravit toxoid • Toxicita je menší • Mají řadu biologických účinků – pyrogenita, aktivace makrofágů, lymfocytů, komplementu → souhrn těchto aktivit vede k letálnímu endotoxinovému šoku • Přítomnost endotoxinů – jsou kontrolovány testy na králících a díky Limulus (test založený na schopnosti lymfy ostrorepa v přítomnosti endotoxinu koagulovat) ENTEROTOXINY • Produkované a vylučované G + i G - bakteriemi • Působí lokálně na střevní sliznici → vyvolává průjmy a dehydrataci PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 11. TOXINY 2 • Jsou to proteiny, termostabilita je různá o odolný vůči vyšší teplotě – např. enterotoxin Stafylococcus aureus odolává třicetiminutovému varu • některé mohou být detoxifikovány • enterotoxin Vibrio cholerae (choleragen) o skládá se z 5 subjednotek B a subjednotky A o proniká do buněk střevního epitelu a aktivuje produkci cAMP → důsledek hyperselekce vody a elektrolytů • Shiga enterotoxin – produkovaný Shigella dysenteriae, S. boydii, S. flexneri, S. sonnei • Shiga-like enterotoxin – produkovaný některými sérovary E. coli – jsou cytotoxické (pronikají do střevní mukózy, způsobují ulcerace a inhibují proteosyntézu) • Enterotoxiny produkovány Clostridium perfringens, Yersinia enterocolitica • Produkce toxinů je kódovaná na plazmidech (E. coli, invazivní faktory shigel), bakteriofázích (difterický toxin Corynebacterium diphtheriae) nebo na transpozonech (enterotoxiny STA a enterotoxiny STB E. coli) STANOVENÍ TOXIGENITY Corynebacterium diphtheriae • Toxigenní kmeny C. diphtheriae jsou původci záškrtu (difterie) – závažné onemocnění u dětí • Patogen se pomnožuje v místě vstupu (obvykle na tonsilách – zde vyvolávají tvorbu pseudomembrán, které mohou spolu s otokem uzavřít dýchací cesty) • Současně produkuje toxin → * toxémie a postižení orgánů (srdce, nervová vlákna, ledviny) → dochází ke * myokarditidy, polyneuritidy, nefritidy • Terapie: zabránit zadušení (odstraňováním pseudomembrán a neutralizovat toxin podáním antidifterického séra) • Toxigenita se stanovuje metodou precipitace v agaru → do agarové půdy vyřízneme 4 jamky, které jsou uspořádány do čtverce • Uprostřed mezi jednu dvojici jamek naočkujeme kličkou čáru zkoušeného kmene, mezi druhou dvojici čáru referenčního toxigenního kmene • Do jamek nakapeme testovací antidifterické sérum obsahující antitoxin (do levých jamek v koncentraci 5, do pravých jamek v koncentraci 25) • Po inkubaci při 37 ̊C pozorujeme vznik precipitačních linií mezi čárou bakteriální kultury a příslušnou jamkou (červeně – precipitační linie) PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 11. TOXINY 3 PRŮKAZ TOXINŮ 1. PŘÍMÁ AGLUTINACE • Stanovují se protilátky v séru pacienta po přidání suspenze známých bakterií • Antigeny – jsou to struktury bakterií (peptidoglykan, lipopolysacharid, bičíky) • Lipopolysacharid – endotoxin → protilátky se vážou na specifický polysacharidový řetězec – O-antigen a * kompletní aglutinát • Např. Widalova reakce – slouží k diagnostice břišního tyfu průkazem sérových protilátek proti salmonelám 2. LATEXOVÁ AGLUTINACE • Bakterie vyvolávající infekční choroby uvolňují pouzderné antigeny • Antigeny lze prokázat pomocí latexových mikročástic, které jsou pokryty protilátkou proti příslušnému antigenu → dochází k výrazné aglutinaci • Cíl: rychle stanovit mikroba v odebraném vzorku • Příklad: stanovení pouzderného antigenu původce hnisavé meningitidy v mozkomíšním moku (likvoru). Likvor napipetujeme na speciální podložní sklíčko a poté přidáme diagnostikum - latexové částice pokryté protilátkou proti prokazovanému antigenu • Pokud likvor obsahuje hledané antigeny, dochází k výrazné aglutinaci latexových částic • Pozitivní – Stafylococcus aureus PRAKTICKÁ ZKOUŠKA - 12. 1 12. Stanovení interakcí bakteriálních hemolysynů Krevní agar je dobrou pomůckou pro stanovení hemolýz, protože obsahuje krvinky - degradace hemoglobinu či lýza erytrocytů přidaných do půdy (hemolýza) patří mezi významné diagnostické znaky: • alfa hemolýza – neuplná hemolýza- viridace - tvoří se meziprodukty (zelenohnědé zbarvení) • beta hemolýza – úplná hemolýza - projasnění půdy způsobené difúzí uvolněného hemoglobinu do okol • negativní hemolýza - barva půdy beze změny HEMOLYZIN ALFA (ALFA TOXIN) Vyskytuje se ve dvou formách. 1. Monomerová forma 3S se aktivně napojuje hydrofobními vazbami na lipidy buněčných membrán (lidských makrofágů a trombocytů nebo králičích a myších erytrocytů, makro- í mikrofágů a krevních destiček) 2. agreguje na hexamerovou formu 12S 3. udělá kánal do eukaryotní buňky (jakýsi prstnecový útvar) 4. pak následuje perforační mechanizmus alfa toxinu = obdobný účinkům komplementového komplexu, včetně stožky C9. Po intradetvitální aplikaci vyvolává nekrózu kůže a po intravenózním podání má letální účinky pro teplokrevné i studenokrevné živočichy. - Působí antagonisticky vůči hemolysinu beta. - Humánní kmeny S. aureus většinou produkují alfa toxin v kombinaci s hemolysinem delta - Protilátky proti alfa toxinu se tvoří poměrně dobře, nemají však protekční charakter. S.pneumonie S.mutans S.viridans HEMOLYZIN BETA = projasnění půdy způsobené difúzí uvolněného hemoglobinu do okolí PRAKTICKÁ ZKOUŠKA - 12. 2 Působí jako fosfolipáza C na sfingomyelin v membránách krvinek různých živočišných druhů. - Jeho aktivita je výrazně potencována dvojmocnými kationty Mg2+ a Ca2+. - Nejcitlivější jsou vůči účinkům tohoto hemolyzinu erytrocyty ovčí a hovězí. které obsahují v povrchové membráně nejvíce sfingomyelin. - Hemolysin beta zesiluje účinnost hemolysinu delta a je naopak antagonistou hemolysinu alfa. Na agaru s ovčími krvinkami vyvolává tzv. "hot-cold fenomen", který vede k projasnění zóny neúplné beta hemolýzy při změně kultivační teploty z 37°C na <10°C. Poškozuje morčecí makrofágy a lidské i králičí trombocyty toxickým narušením lysozomů a buněčné-ho metabolismu. - Hemolysin beta má dobré imunogenní vlastnosti. Jeho produkce je charakteristická pro kmeny S. aureus zvířecí provenience. S.pyogenes S-agalactinae CAMP test používaný pro důkaz S. agalactiae – na krevním agaru se v místě překřížení čar S. agalactiae a S. aureus vytvořila hemolýza motýlkovitého tvaru. HEMOLYZIN GAMA =bez projasnění - Je dvousložkový (synergohymenotropní) toxin. který je biologicky aktivní pouze za účasti obou komponent. - Nejcitlivější jsou vůči němu erytrocyty králičí. reakce vyžaduje přítomnost Na' nebo K' iontů. - Jeho toxicita je však nižší než u hemolysinu alfa. - Je inhibován agarem a proto gama hemolýza není průkazná na krevním agaru. - Gama hemolysin je imunogenní, u pacientů vyvolává dobrou protilátkovou odpověď. HEMOLYZIN DELTA Nemá enzymatický charakter, ale působí jako povrchově aktivní látka na buněčné membrány. Snadno lyzuje erytrocyty nejrůznějšího původu, jako nejcitlivější se jeví erytrocyty humánní. Rozdíly v citlivosti erytrocytů různých živočišných druhů nejsou však příliš výrazné. Toxicky působí i na makrofágy, polynukleázy a lymfocyty. Hemolysin delta je kompletně inhibován sérovými fosfolipidy. Je antigenní, protilátky lze detekovat až po odstranění všech nespecifických inhibitorů z imunního séra. PRAKTICKÁ ZKOUŠKA - 12. 3 Příkla d z prakti k CAMP test slouží k odliše ní beta- hemol ytický ch strept okoků . Umož ňuje nám odlišit Strept ococc us agalactiae od Streptococcus pyogenes. 1. Na krevním agaru se zkříží linie S. aureus a beta-hemolytického streptokoka. Pokud zkřížíme linii S. aurea s linií Streptococcus agalactiae, který vytváří CAMP faktor, dojde k hemolýze erytrocytů ovlivněných C sfingomyelinázou (beta-lysin) S. aurea a v místě protnutí vznikne projasnění ve tvaru mašličky. 2. Streptococcus pyogenes CAMP faktor nevytváří a proto v místě zkřížení k hemolýze nedojde. Název je odvozen od jmen objevitelů – Christie, Atkins, Munch-Petersen. Výsledky: pozitivní – Streptococcus agalactiae, negativní – Streptococcus pyogenes. PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 100. 1 13. Metody vyšetření citlivosti na antibiotika (principy diskových a dilučních metod, podmínky pro spolehlivost výsledků, limitace, interpretace) DIFUZNÍ DISKOVÝ TEST Úkolem je stanovení citlivosti testované bakterie k antibiotickým přípravkům. Postup: 1. Kultivovaná kultura se nachází v Petriho misce 2. Z ní odebereme 2 kolonie pomocí bakteriální kličky – vložíme do zkumavky s fyziologickým roztokem – zamícháme a vznikne nám suspenze 3. Namočíme tampon do zkumavky s daným vzorkem 4. Aplikujeme na MH agar (nanesení co nejhustěji u sebe) 5. Podle typu bakterie (buď Gram + nebo Gram - ) aplikujeme příslušná antibiotika na agar. V našem případě antibiotika na Gram +. 6. Vložíme do termostatu a necháme kultivovat při teplotě 37° C 7. Druhý den vyhodnotíme inhibiční zóny Závěr: Pozorujeme inhibiční zóny, které mají jiný průměr, tzn. že bakterie má rozdílnou citlivost vůči antibiotikům. Stanovené hraniční zóny Hraniční hodnoty (průměry) inhibičních zón, podle kterých stanovujeme, zda je bakterie citlivá nebo rezistentní vůči antibiotikům: hodnocení inhibičních zón: PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 100. 2 CN10 – průměr 15 mm → bakterie je na antibiotikum citlivá. SXT25 - Průměr 25 mm → bakterie je citlivá na antibiotikum AMC30 – Průměr 18 mm → bakterie je citlivá na antibiotikum CIP5 – průměr 24 mm → bakterie je citlivá na antibiotikum MEM10 – průměr 27 mm → bakterie je citlivá na antibiotikum CAZ30 - Průměr 22 mm → bakterie je citlivá na antibiotikum Závěr: Bakterie je na všechna aplikovaná antibiotika citlivá. DILUČNÍ METODA = ke stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC), nebo minimální baktericidní koncentrace (MBK). - Metoda je kvantitativní, lze ji plně automatizovat a standardizovat. Antibiotika jsou ředěna geometrickou řadou ( 0,125; 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8...) Základní pojmy: MIC = nejnižší koncentrace antibiotika, která již inhibuje viditelný růst; udává se v g/ m l nebo mg/l MBK = nejnižší koncentrace antibiotika, která inhibuje růst 99,9% populace mikroorganismů; udává se v ml/mg nebo mg/l. Platí, že MBK může být stejná nebo vyšší než MIC, nemůže být nižší. Diluční metoda v MH agaru E-TEST Úkolem je zjištění MIC daného antibiotika. Postup: 1. Pozorujeme půdu, na kterém je umístěn proužek napuštěný antibiotikem, jehož gradient klesá od jednoho konce ke druhému. 2. Sledujeme zónu inhibice (místo prosvětlení – tvar kapky) – tady bakterie neroste 3. Změříme nejužší konec pomocí pravítka, kam dosahuje prosvětlení a stanovíme MIC. PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 100. 3 Závěr: Stanovili jsme hodnotu MIC, která je 12 mikrogramů. Diluční metoda v bujonu. Dvě možnosti provedení 1. makrodiluční metoda ve zkumavkách s testovaným objemem větším než 1ml, 2. mikrodiluční metoda prováděná v mikrotitračních destičkách s objemem 0,1ml Jako růstové médium se užívá Mueller - Hintonův bujón. Pro snadnější přípravu a provedení je široce rozšířená metoda mikrodiluční. Koncentrace inokula opět odpovídá 0,5 stupnice McFarlanda, destička se naočkuje jehlovým inokulátorem a inkubuje za standardních podmínek. Úkolem je, stanovit na základě zákalu a čirosti v mikrotitrační destičce, obsahující různou koncentraci antibiotika, zda bakterie roste (pozorujeme zákal), zda bakterie neroste (jamka zůstává čirá, tzn. bakterie je inhibována antibiotikem a neroste) Postup: 1. Pozorování sedimentu v jamkách mikrotitračních destiček (sledujeme pomocí zrcadla). 2. Vyhodnocení senzitivnosti a rezistence bakterie na antibiotika. PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 100. 4 Závěry: Stanovili jsme MIC pro bakterie, která je 8. Dále můžeme pozorovat, že bakterie jsou rezistentní vůči antibiotiku Ampicilin → rostou v dané jamce (vidíme, že je jamka zakalená). Bakterie ENTC je rezistentnější již při vyšších koncentracích antibiotika, naopak bakterie STPN potřebuje menší dávky antibiotika k tomu, aby mohla růst. Výhody: Touto metodou lze otestovat jeden kmen současně k více antibiotikům. Dle uspořádání až k 12 různým antibiotikům na jedné destičce. Nevýhody: Špatně lze hodnotit případnou bakteriální kontaminaci. Stanovení MBK: Zkumavky / mikrotitrační jamky s čirým bujónem se vyočkují na pevné půdy bez přídavku antibiotika a inkubují se. Ze zkumavek s bakteriostatickou koncentrací vyrůstají kolonie přežívajícího inokula. Poslední zkumavka / jamka bez nárustu kolonií na agaru udává MBC. Podmínky pro spolehlivost výsledků - 1 bakteriální kolonie - Dávat pozor, abych to neinfikovaly – např z rukou - Provést víc testů – difuzní i diluční test – pro potvrzení správnosti MIC = 8 Bakterie ENTC je rezistentní Bakterie STPN je rezistentní PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 14. 1 14. SPECIÁLNÍ METODY PRO VYŠETŘENÍ CITLIVOSTI NA ANTIBIOTIKA (náročné bakterie, pomalu rostoucí bakterie, anaeroby, typické příklady špatně prokazatelné rezistence) - výsledkem stanovení citlivosti testované bakterie k antimikrobním přípravkům (ATB) je antibiogram metody: 1) Difúzní metody 2) Diluční metody 1) Difúzní metody - testy kvalitativní - určuje buď citlivost nebo rezistenci bakterie Princip: - difúzi ATB do agaru s naočkovaným bakteriálním testovaným kmenem - při potlačení růstu bakteriálního kmene antibiotikem se vytvoří inhibiční zóna a) Disková difúzní metoda - kvalitativní metoda - výsledek nás informuje, zda je antibiotikum účinné, nebo je testovaný kmen k ATB rezistentní - hodnocení probíhá na základě měření velikosti inhibičních zón s následným porovnáním s referenčními hodnotami Provedení: -z čisté, izolované kolonie připravíme suspenzi mikroba - pomocí bakteriální kličky sejmeme kolonii bakteriálního kmene a přeneseme do fyziologického roztoku -zde je potřeba dodržet stanovený zákal hodnocený pomocí McFarlandových jednotek -doporučená hodnota zákalu je 0,5 McFarlanda -suspenzi mikroba naočkujeme pomocí sterilního tampónu na celý povrch agarové půdy, nejčastěji jde o Müller-Hintonovu půdu -pomocí speciálních dávkovačů přiklademe ATB disky -Kultivujeme – nejčatěji 24 hod./ 37 °C -po inkubaci se měří průměr inhibičních zón - výsledek se porovná s tabulkou NCCLS a tak se zjistí, zda kmen je na antibiotikum citlivý nebo rezistentní - pravidlo 15: 3-5 kolonií čisté kultury testované bakterie se rozetře ve fýzáku – výsledný zákal 0,5 MCFarlanda (při koncentrovanějším je nebezpečí falešné rezistence) - do 15 min – očkovat plotny roztěrem sterilním tamoponem/přelitím PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 14. 2 - do 15 min po nanesení inokula umístit ATB plotny (max 6) - do 15 min – umístit do termostatu Výsledek: - testovaný kmen je k antibiotiku rezistentní: - ATB difundující z ATB disku NEZASTAVÍ růst bakteriálního kmene a NEDOJDE k vytvoření inhibiční zóny - Testovaný kmen je na ATB citlivý: - ATB difundující z disku ZASTAVÍ růst bakteriálního kmene a DOJDE k vytvoření inhibiční zóny - je však potřeba vycházet z referenčních hodnot  Velikost inhibiční zóny je menší než referenční rozmezí = bakterie je k ATB rezistentní  Velikost inhibiční zóny je větší (překračuje) referenční rozmezí = bakterie je na ATB citlivá Výhody: dostatečná spolehlivost, jednoduché provedení, nízké náklady, snadná dostupnost Nevýhody: nevhodné pro pomalu rostoucí a anaerobní bakterie, ovlivnění výsledku koncentrací inokula, sepse, meningitidy, edokarditidy, b) E-test - kvantitativní metoda - poskytuje informaci o vhodné koncentraci antibiotika, která je proti testovanému kmenu účinná - jde v podstatě o metodu určení minimální inhibiční koncentrace (MIC : taková koncentrace ATB, která je schopna zastavit růst bakterie) - užívá se speciální proužek napuštěný rostoucími koncentracemi antibiotika, opatřený stupnicí - Výsledek: - v případě citlivosti na ATB – vytvoří se zóna inhibice růstu ve tvaru elipsy, která přetíná proužek s antibiotikem v místě udávajícím hodnotu MIC - Provedení testu: - z čisté, izolované kolonie připravíme suspenzi mikroba - pomocí bakteriální kličky sejmeme kolonii bakteriálního kmene a přeneseme do fyziologického roztoku - je potřeba dodržet stanovený zákal hodnocený pomocí McFarlandových jednotek - doporučená hodnota zákalu je 0,5 McFarlanda - suspenzi mikroba naočkujeme pomocí sterilního tampónu na celý povrch agarové půdy, nejčastěji jde o Müller-Hintonovu půdu - přiložíme proužek napuštěný ATB 2) Diluční metody - kvantitativní testy - slouží ke zjištění minimální inhibiční koncentrace (MIC), tj. minimální koncentrace ATB, která je schopna zastavit růst bakterie PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 14. 3 - jsou přesnější nežli difúzní testy - princip - inhibice růstu bakterie danou koncentrací ATB a) diluční test v bujonu: Princip: - užívají se ATB ředěná tzv. geometrickou řadou - naředěná ATB se smíchají s tekutým bujónem, který nahrazuje tuhou půdu - takto připravené roztoky ATB s bujónem se dávkují do mikrotitrační destičky (destičky i s ATB se dodávají do laboratoře připravené) - růst bakterie se projeví zákalem - v případě inhibice bakterie ATB zákal mizí Výsledek: - jamka, ve které dojde k zastavení růstu, je hodnocena jako tzv. minimální inhibiční koncentrace Provedení: - do připravené mikrotitrační destičky se naočkuje sledovaná bakterie - následuje kultivace (nejčastěji 24 hod/ 37 °C) a odečet MIC b) diluční test v agaru: - Petriho misky jsou vyplněné standardním objemem agaru s různou koncentrací ATB - bodově se na 1 plotnu naočkuje jehlovým razidlem 30 – 40 kmenů najednou - inkubace - odečet výsledku – růst ve formě uzavřené kolonie - v místě bez růstu je MIC ATB - interpretace se provádí dle tabulkových hodnot - referenční metoda, je přesnější a lépe se hodnotí zástava růstu PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 15. 1 15. Identifikace pomocí fenotypických znaků Při identifikaci se pracuje s čistou bakteriální kulturou, u které se hodnotí fenotypové a genotypové vlastnosti. Fenotypové znaky využívané pro identifikaci bakterií 1. Morfologie buněk – tvar, velikost, vzájemné uspořádání, pohyblivost, barvitelnost podle Grama, acidorezistence (barvením), tvorba pouzdra, tvorba spór, umístnění bičíků. 2. Kultivační vlastnosti – morfologie kolonií na agarovém médiu, charakter růstu v tekutém médiu 3. Fyziologické vlastnosti – vztah k volnému kyslíku, typ metabolismu glukózy (O-F test), teplotní optimum pro růst, tolerance k NaCl a těžkým kovům, citlivost k antibiotikům, citlivost k žlučovým solím 4. Biochemická aktivita – hodnotí se produkce enzymů přímo (kataláza, oxidáza, ureáza, koaguláza, beta-galaktozidáza) nebo nepřímo důkazem produktů enzymatického štěpení (zkouška na indol, sirovodík, acetoin), využívání anorganického uhlíku (citrát), redukce dusičnanů, hydrolýza škrobu, želatíny 5. Antigenní struktura – bakteriální buňky jsou složeny z mnoha různých antigenů. Pro praktické použití je možné určovat přítomnost těchto antigenů (specifické povrchové proteiny nebo lipopolysacharidy). sérologickými metodami. Například rod Salmonella lze na podkladě rozdílů v antigenní struktuře rozdělit na 2 500 různých sérotypů. 6. Chemické složení lze použít jako doplňující znak pro identifikaci některých bakterií. Jedná se o metody, kterými se stanovuje např. celkový profil proteinů buněčné stěny; elektroforetický profil enzymů, které jsou produkty jednoho genu; dále lze využít chromatografie lipidů, fosfolipidů a mykolových kyselin apod.. Pokusím se to vysvětlit a zasadit do kontextu:  KULTIVACE V mikrobiologických laboratořích je stále hojně užívána kultivace, metoda pěstování kultury, kdy je zapotřebí nejméně 8 hodin inkubace, nejčastěji při 37 °C. Problémem při kultivaci může být:  pomalý růst buněk bakterií  požadavek na specifické podmínky. Ke kultivaci některých obtížně kultivovatelných mikroorganismů, což jsou hlavně intracelulární parazité (např. chlamydie, rickettsie a viry), je využíváno experimentálních zvířat, kuřecích embryí nebo tkáňových kultur. PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 15. 2 Narostlá diagnostická kultura signalizuje přítomnost potenciálně infekčních mikroorganismů a poskytuje materiál pro fenotypovou analýzu která je založena na rozpoznání rozdílů v morfologii kolonií a buněk 1. Tvar 2. Profil 3. Okraje 4. Velikost 5. Povrch 6. Pigmentace 7. Aroma 8. barvitelnost dle Grama 9. přítomnost a uspořádání bičíků) fyziologii  vztah ke kyslíku – aerobní x anaerobní  teplota  pH  tolerance k NaCl  využití zdrojů uhlíku/dusíku/síry)  růstu  enzymatické aktivitě  dalších faktorech (inkluze, citlivost k antibiotikům, patogenita). Podle bar vitelnosti dle Grama je možno bakterie rozdělit do dvou skupin: - což souvisí se stavbou bakteriální buněčné stěny - Gram + pozitivních bakterií složena převážně z peptidoglykanu a méně z lipidů - Gram - negativních bakterií. Při barvení je užívána krystalová violeť (tmavomodré zbarvení buněk), Lugolův roztok (tvorba komplexu barviva s jódem) a 96% ethanol nebo aceton. Některé bakterie jsou schopny barevný komplex barviva s jódem podržet – Gram-pozitivní (např. Staphylococcus, Streptococcus), jiné se rychle odbarví – Gram-negativní (např. Escherichia, Pseudomonas). Gram-negativní bakterie jsou pak dobarveny kontrastním barvivem (safranin, fuchsin) Biochemickými testy je prokazována přítomnost charakteristických buněčných složek (proteiny) a metabolitů (toxiny) mikroorganismů metodami instrumentální chemické analýzy. - Testy jsou založené na reakci buněčných produktů bakterie a sacharidu, enzymu nebo proteinu - zjišťováno využití zdrojů uhlíku mikrobem, proveden důkaz redukce dusičnanů (např. u rodu Pseudomonas) - hydrolýzy škrobu a želatiny - je sledována tvorba indolu - sirovodíku (H2S) - acetonu a derkaboxylas lysinu či ornithinu PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 15. 3 - průkaz aktivity enzymů (např. katalasy, oxidasy, fosfatasy, ureasy, β-galaktosidasy) a další testy. Techniky založené na využití zdrojů uhlíku (fermentaci) využívají přenosu elektronů z organické látky (zdroj uhlíku) na barvivo (tetrazolinová violeť), které změní barvu. Tato technika umožňuje sledování oxidativních procesů během buněčného dýchání. Jiná technika je založena na růstu organismu v přítomnosti substrátu, což se projeví zakalením tekutého kultivačního média. Pozitivní test založený na změně pH je indikován změnou barvy, pH se stává kyselejší při využití karbohydrátů a alkaličtější při využití proteinů nebo vylučování dusíku. Tyto reakce jsou závislé na inkubační době, teplotě a inokulované látce Výhodou fenotypových technik: 1. rozsáhlé databáze poznatků o vlastnostech jednotlivých bakterií Nevýhodou 2. je nutnost alespoň 16 h kultivace pro většinu testů. Komerční identifikační automaty jsou schopny u rychle rostoucích druhů bakterií tuto dobu zkrátit na 4 – 6 h, ale za cenu vyšších nákladů Tradiční fenotypové diagnostické metody mají známá omezení (možnost selhání v případě růstové náročnosti, výskyt rezistence) PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 16. 1 16. DETEKCE AGENS METODAMI MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE; MATERIÁL, INDIKACE VYŠETŘENÍ, INTERPRETACE VÝSLEDKŮ • molekulárně biologické metody patří mezi přímé diagnostické metody (vedle mikroskopie, elektronové mikroskopie, izolace a kultivace, detekce antigenů) • kvalitativní průkaz virové nebo bakteriální nukleové kyseliny ve vzorku (DNA nebo RNA) o detekce a identifikace virů, které není možné běžně izolovat na buněčných kulturách nebo prokazovat jejich antigeny v infikovaných buňkách  např. viry hepatitid C a G, lidské papilomaviry, parvovirus B19 o u pomalu rostoucích, nekultivovatelných bakterií  M. tuberculosis, Borrelia burgdodorferi, Mycoplasma pneumoniae, Ch. pneumoniae, Chlamydia trachomatis • také stanovení kvantity NK → sledování rozvoje virové infekce nebo odpovědi na léčbu antivirotiky (např. u infekcí HIV, hepatitidy B a C, cytomegalovirové (CMV) infekce) • rychlé (výsledek již za několik hodin) → diagnostika závažných infekcí vyžadujících rychlé nasazení léčby o např. detekce DNA herpetického viru (HSV DNA) z likvoru u herpetických infekcí centrálního nervového systému (CNS) nebo DNA cytomegaloviru (CMV DNA) u imunosuprimovaných pacientů po transplantaci orgánů) • amplifikační molekulárně biologické metody (PCR) dokáží zmnožit nukleovou kyselinu → význam pro analýzu vzorků, které obsahují jenom malé množství virových částic nebo bakterií → možno detekovat dalšími technikami (elektroforézou či hybridizací) • umožňují přesně určit sekvence jednotlivých bází, identifikovat genotypy viru nebo bakterie, prokazovat mutace • s rozvojem léčby u některých virů vzniká rezistence → molekulárně biologické metody úsek genomu zodpovědný za přenos rezistence dokáží detekovat (např. rezistence na lamivudin u hepatitidy B nebo azidothymidin u HIV infekce) • molekulárně biologické metody používané v ČR - metody neamplifikační (např. hybridizační), metody využívající amplifikaci nukleové kyseliny (např. PCR) Materiál • správná volba biologického materiálu závisí na patogenezi infekčního onemocnění • odebírá se nesrážlivá krev (EDTA), srážlivá krev, mozkomíšní mok, sekrety dýchacích cest, bronchoalveolární laváže, moč, amniová tekutina, různé výtěry • speciální techniku vyžadují detekce nukleové kyseliny in situ přímo v infikované tkáni PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 16. 2 • stabilita nukleové kyseliny se může lišit v závislosti na typu mikrobiálního původce, na typu použitého antikoagulačního činidla, na době transportu, na teplotě během transportu a uchování vzorku → nutné dodržovat správná pravidla pro odběr, transport a uchování vzorků Interpretace • falešně pozitivní i negativní výsledky (mrtvé mikroorganismy...) • nalezení fragmentu genomu neprokazuje prezenci živého patogenu!! Polymerasová řetězová reakce (PCR) • technika umožňující kopírovat a amplifikovat specifické úseky DNA • složky: a) Templátová DNA o směs různých sekvencí DNA, mezi nimi sekvence, která má být amplifikována o lze použít i RNA, ale nejdřív se musí vytvořit komplementární cDNA pomocí reverzní transkriptázy b) Pár oligonukleotidových primerů o primery – krátké, jednovláknové DNA (ssDNA – single strand DNA) o vymezují amplifikovaný úsek o musí být komplementární k úsekům protilehlých vláken DNA c) DNA-polymerasa o termostabilní – snášejí teploty do 100°C aniž jsou aktivovány o nejčastějí Taq polymerasa z bakterie Thermus aquaticus žijící v horkých pramenech o váže se na oddělená vlákna DNA a syntetizuje nový řetězec komplementární k původnímu d) Deoxynukleotidtrifosfáty (dNTPs) o stavební jednotky korespondující se 4 bazemi (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) o substrát pro DNA polymerasu • opakované cykly syntézy DNA – každý cyklus obsahuje 3 kroky (denaturace DNA, připojení primerů, elongace) 1. Denaturace DNA o vysoká teplota (nad 90°C) ruší vodíkové vazby → dvoušroubovice DNA se destabilizuje a rozvolňuje na jednovláknové struktury, které slouží jako templáty 2. Připojení primerů (hybridizace) o annealing (žíhat, kalit kov nebo sklo, tj. po rozpálení je prudce ochladit) o při teplotách kolem 50–60 °C PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 16. 3 o molekuly jednořetězcové DNA po ochlazení opět renaturují o jsou-li ve směsi v nadbytku specifické oligonukleotidy, budou hybridizovat se svou komplementární sekvencí rychleji než dlouhé jednořetězcové molekuly, jejichž koncentrace je mnohem nižší 3. Elongace, extenze, syntetická fáze o syntéza nových řetězců při teplotě 65–75°C o oligonukleotidy, které dosedly na jednořetězcovou DNA (templát) v předchozím kroku, slouží v tomto kroku jako primery pro DNA polymerasu - od jejich 3 ́-konce začíná syntéza nového řetězce komplementárního s templátem Molekulární hybridizace • denaturace dvoušroubovice DNA – vysoká teplota rozruší vodíkové můstky • snížení teploty → renaturace DNA na základě komplementarity • může nastat: mezi 2 vlákny DNA, mezi DNA a RNA, mezi 2 vlákny RNA • využití: vyhledávání specifické sekvence pomocí komplementární sekvence nukleové kyseliny (sonda) Sonda (proba) • molekula DNA nebo RNA, která může být na základě hybridizace využita k detekci komplementární sekvence nukleové kyseliny • sondy: klonované sekvence DNA, sekvence získané PCR amplifikací, syntetické oligonukleotidy, RNA získaná transkripcí klonované DNA in vitro • v jednovláknové podobě, označené (např. radioaktivními izotopy, modifikovaný nukleotid obsahující fluorofor) • Southern blotting o izolace a purifikace DNA z buněk (velké fragmenty) o štěpení DNA restrikčním enzymem → tisíce fragmentů různé velikosti o elektroforéza v agarosovém gelu → rozdělení fragmentů podle velikosti o gel ponořen do alkalického roztoku → denaturace DNA o blotting (přesátí) – přenesení denaturovaných fragmentů na membránu (nylon nebo nitrocelulóza) o membrána s fragmenty vystavena 80°C – fragmenty se na membráně zafixují o vlastní hybridizace – inkubace membrány se značenou sondou o po inkubaci je membrána umístěna na rentgenový film (je-li sonda značena radioaktivně) – za několik hodin je film vyvolán o v místě hybridizace se objeví tmavé pruhy (bandy) – jejich velikost odhadnuta z jejich pozice ve srovnání s fragmenty DNA, které slouží jako marker • Northern blotting o analyzovaná nukleová kyselina je RNA (hlavně mRNA), jinak podobné o zjištění aktivity genů v tkáni PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 16. 4 Gelová elektroforéza • izolace a analýza nukleových kyselin a proteinů • princip: pohyb záporně nabitých molekul DNA (hlavním nositelem náboje nukleových kyselin jsou záporně nabité fosfátové skupiny) v elektrickém poli směrem k anodě • separace molekul DNA na základě rozdílných rychlostí pohybu molekul DNA v gelu, které jsou nepřímo úměrné velikosti molekuly DNA PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 17. 1 17. Mikrobní obraz poševní (MOP); interpretace výsledků vyšetření: - MOP: slouží k získání informací o současném stavu osídlení + detekce specifických patogenů - jeden ze způsobů určování řady sexuálně přenosných nemocí - odběr sekretu se provádí sterilním vatovým tamponem za pomoci poševních zrcadel ze sliznice pochvy a z děložního čípku - materiál se přenese na dvě podložní sklíčka a barví se podle: Grama – diagnostika bakterií a kvasinek; Giemsy – diagnostika přítomnosti trichomonád. - vaginální osídlení je obdobné osídlení kůže - vaginální osídlení se mění s: věkem, hormonálními vlivy - změny s věkem: narození (převládají laktobacily), prepubertální období (mikroflóra obdobná zevnímu genitálu), puberta (laktobacily) - hormonální změny – estrogen – hladina se mění v průběhu cyklu – s ní se mění stav vaginálního epitelu a sekrece glykogenu – mění se mikroflóra - normální osídlení: - měly by převládat laktobacily – fermentují glykogen z vaginální mukózy – vznik laktátu – udržení pH 4-5!!! - +produkují H 2 O 2 + další faktory potlačující další mikroflóru - vaginální laktobacily = Döderleinův laktobacil L. acidophilus 56 % L. fermentum 16 % L. casei 8 % L.leichmannii 5 % L. salivarius 5% L.brevis 4 % L.lactis 4% L. cellobiosus 2 % - rovnováha vaginální mikroflóry může být posunuta – následkem patologického stavu, - původci sexuálně přenosných nemocí - přemnožení minoritní složky normální mikroflóry (př.: kvasinky – kandidová vulvovaginitida; Torulopsis glabrata, Saccharomyces cerevisiae, Candida stellatoidea, Candida tropicalis, Candida parapsilosis...) - přemnožení střevních bakterií (E. coli) - přemnožení anaerobů (Mobiluncus sp., Gardnerella vaginalis – bakteriální vaginózy – vazký sekret, výrazný zápach) - β – hemolytický Streptococcus agalactinae – infikuje novorozence, pro hostitelku nevýznamný - Staphylococcus aureus – produkce toxinu syndromu toxického šoku (TSST) PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 17. 2 - základní typy MOP: (hodnocení obrazu) typ I. Normální - Döderleinovy tyčinky (laktobacily) - epitelie - leukocyty typ II Nehnisavý bakteriální výtok - koky - tyčinky - vibria - BEZ Döderleinových tyčinek - epitelie - leukocyty Typ III. Hnisavý bakteriální výtok - směs tyčinek a koků - BEZ Döderleinových tyčinek - málo epitelií a leukocytů Typ IV. Kapavka - velké množství leukocytů - intra-/extracerularní diplokoky (gonokoky) - BEZ Döderleinových tyčinek - málo epitelií Typ V. Trichomoniáza - trichomonády - ojedinělé Döderleinovy tyčinky - směs bakterií - epitelie - leukocyty Typ VI. Hnisavá/nehnisavá mykóza - kvasinky - Döderleinovy tyčinky - epitelie - leukocyty Další: Vláknitá laktobacilóza - normální mikroflóra + vláknité bakterie rodu Leptothrix - více epitelií a leukocytů Bakteriální vaginóza: - chybí laktobacily - velké množství anaerobních bakterií (Gardnerella vaginalis, Bacteroides spp., Mobiluncus spp.) - zvláštní typ epiteií – clue cells Aeorobní vaginitida - Gram – pozitivní koky, Gram- negativní tyčinky (E.coli) PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 17. 3 - velké množství leukocytů PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 18. 1 18. PRAVIDLA IZOLACE VHODNÉHO MATERIÁLU PRO MIKROBIOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ - pro bakteriologické vyšetření je nutné vybrat vhodný klinický materiál, čas, způsob odběru, vhodné odeslání materiálu - laboratorní vyšetření obvykle zahrnuje: mikroskopii, kultivaci, identifikaci bakterií, stanovení složek a produktů infekčního agens, sérologické stanovení protilátky a stanovení citlivosti na ATB - izolát je čistá kultura bakterií izolovaná z určitého zdroje - izolace je nezbytná pro sledování fenotypických identifikačních znaků a pro vlastní identifikaci - čistá kultura je populace bakterií vzniklá z jedné izolované buňky a je udržovaná a vedená tak, že žádný jiný mikrobiální druh se s ní nesetká - umožňuje to aseptická práce - Izolace čisté kultury - je založena na oddělení buněk jednoho druhu ze smíšené kultury nebo přirozeného materiálu - na plotnách se provádí takto:  před použitím i po použití kličku vypálíme, držíme ji přitom svisle v plameni a opalujme i kovový konec držáku  po vypálení necháme kličku několik vteřin vychladnout a než se dotkneme očkem kultury, ochladíme očko o okraj agarové půdy  vypálenou a vychladlou kličkou nabereme smíšenou kulturu a vytvoříme inokulum  kličku vypálíme, necháme vychladnout a rozočkujeme jednotlivými tahy  v posledním roztěru získáme po inkubaci jednotlivé kolonie - Všeobecné zásady při očkování - očkujeme v místnosti kde je čisto, není prach a průvan - vše potřebné máme předem připraveno - na stůl neodkládáme nic, co přijde do styku s kulturou - odzátkované nádoby držíme šikmo, ne svisle, pracujeme rychle, bez prodlení - pokud odkládáme některou část sterilní nádoby, pak vždy tak, aby možnost kontaminace sporami byla co nejmenší (např. víčko Petriho misky dutou stranou dolů) - vzhled kolonií nebo změny kultivační půdy v jejich okolí jsou charakteristické pro určitý druh - proto jsou tuhé kultivační půdy často používány jako půdy diagnostické - u kolonií si všímáme velikosti, tvaru, povrchu, okrajů, konzistence, barvy, ev. zápachu, vzájemných vztahů apod - některé rostou na povrchu půdy v povlaku (Proteus) - vzhled kolonií u jednoho druhu mikroba může být ovlivněn jeho růstovou- disociační fází (M-fáze mukosní, hlenovitá, S-fáze hladká, R-fáze drsná) - užití zkumavek: - ožehneme hrdla obou zkumavek a přeneseme inokulum z jedné do druhé - vypálíme kličku a odložíme ji - ožehneme okraje zkumavek a vnitřní konce zátek a zkumavky uzavřeme ÚSTNÍ ZKOUŠKA – 132. 20. Metody zpracování mikrobiologických vzorků (analytická fáze) a interpretace výsledků - Mikrobiologické vyšetření – komplikovaný proces, jehož jednotlivé části se odehrávají na různých místech – klinika (indikace, odběr, transport, zhodnocení výsledků, léčba pacienta) x laboratoř (příjem a výdej výsledků) o Účel – zjištění který mikrob je příčinou sledovaného onemocnění + přítomnost jeho faktorů patogenity (toxiny) a jeho citlivosti na antimikrobiální látky o Etiologické agens vyšetřované infekce lze prokázat – přímo (průkaz mikroba, jeho části – antigen, produktu ve vzorku), nepřímo (průkaz protilátky) o Metody přímého průkazu – mikroskopie, kultivace, identifikace izolovaného mikroba, stanovení jeho citlivosti na ATB, výjimečně pokus na zvířeti, průkaz mikrobiálních antigenů a nukleových kyselin o Metody nepřímého průkazu – precipitace, aglutinace, vazba komplementu, neutralizace a metody se značenými složkami o Začíná na klinickém pracovišti (příchod pacienta s potížemi), končí interpretací všech výsledků o Proces kruhové spolupráce: pacient – sestra – lékař – laboratoř - Preanalytická fáze o Podstatou je dodržení zásad správného odběru (včetně správné přípravy pacienta před odběrem) a transport biologického materiálu do laboratoře + správné označení odběrového materiálu se vzorkem a správné vyplnění průvodky o Odběr biologického materiálu indikuje ošetřující lékař – třeba provést před zahájením terapie o Odběr v souvislosti se zahájením léčby (ATBcké) – vzorky odebrány před její změnou či po jejím krátkém vysazení (lepší) o Stanovení diagnózy závisí na klinické validitě vzorku (není validní – vyšetření neodhalí skutečného původce) – ze správného místa, kde lze předpokládat přítomnost mikroba o Technická validita – zajišťuje odběr a transport vzorku za přesně stanovených podmínek – ve správný čas (před podáním ATB), správným způsobem (lege artis, asepticky), do správných souprav (označení sterilní nádoby; popř. transportní média) - Analytická fáze o Průkaz infekční agens speciálním laboratorním mikrobiologickým vyšetřením o Interpretace nálezů  Růst mikroorganismu ve vyšetřovaném vzorku nemusí vždy znamenat přítomnost infekce  Kontaminace = zanesení cizorodých mikrobů během odběru nebo zpracování vzorku (z kůže, z prostředí,...)  Kolonizace = přítomnost mikroorganismů, včetně potenciálních patogenů, ale kteří nevyvolávají danou infekci (normální mikroflóra orofaryngu, GIT,...)  Signifikantní patogen = interpretace v kontextu klinického obrazu; místa odběru; metody odběru a zpracování vzorku; kvantity nálezu  Obligátní patogeny – původci „klasických“ nákaz: Corynebacterium diphtheriae (záškrt); Salmonella Typhi (břišní tyfus); Neisseria gonorrhoeae (kapavka)  Míra patogenity různá i u obligátních patogenů – Y. pestis více patogenní než Str. pyogenes ÚSTNÍ ZKOUŠKA – 132.  Specializace na jeden hostitelský druh (shigelly, gonokoky – člověk) x infekce různých druhů (stafylokoky, virus vztekliny)  Podmínky pro vznik infekce – změna místa přirozeného výskytu (E. coli ze střeva do moč. ústrojí, krevního řečiště); snížení odolnosti hostitele (DM, kortikoidy, ATB, tumory) 1) Zpracování likvoru - Mikroskopie: vzorek se zcentrifuguje, ze sedimentu se připraví nátěr; obarví dle Grama, či Ziehla- Neelsena, Heidenhaina nebo tuší (kryptokoky); při podezření na meningoencefalitidu se vyšetřuje nativní preparát - Průkaz antigenů: v likvoru vždy prokazujeme – pátrá se po antigenech Neisseria maningitidis, Str. pneumoniae, Haemophilus influenza typ b, Str. agalactiae, Cryptococcus neoformans - Kultivace: očkování na KA se stafylokokovou čárou, na čokoládový agar, na anaerobní KA, na část půdy Endovy či MacConkeyho; inkubace při 37°C – vyočkuje se - při podezření na TBC se očkuje na Lowensteinovu-Jensenovu a Šulovu půdu; při podezření nakryptokokovou meningitidu Sabouradova půda, amoeby se pěstují na masivně naočkovaných agarech např. E. coli 2) Krev na hemokultivaci 3) Sputum, bronchoalveolární laváž, tracheální aspirát 4) Výtěr z krku, nosu, ucha 5) Stěr ze spojivky 6) Hnis, punktát 7) Materiál z kožních lézí 8) Vzorky z urethry, cervixu, pochvy 9) Moč 10) Stolice Odběr vzorku Správný odběr vzorku je první, předpokladem k získání správného výsledku vyšetření. To má tři fáze: preanalytickou, analytickou a postanalytickou. - Preanalytická fáze - Odběr biologického materiálu o vždy považujeme za potenciálně infekční o nutno dodržovat všechny podmínky bezpečnosti práce (používání rukavic, vakuové odběrové systémy, desinfekce pracoviště po skončení práce, zákaz jídla, pití a kouření na pracovištích...) o záměna vzorků – nejčastější preanalytická chyba - Analytická fáze - Vlastní stanovení - Postanalytická fáze - Chemická kontrola metody, lékařská kontrola, tisk a zápis dat, dodání výsledku lékaři. Metody, vyšetření Stanovení látek v krvi a moči  chemické, imunochemické, turbidimetrické, elektroforetické a další speciální metody. Moč  fyzikální, chemické a mikroskopické vyšetření Likvor  fyzikální, chemické a mikroskopické vyšetření Žaludeční a pankreatická šťáva ÚSTNÍ ZKOUŠKA – 132.  z hlediska klinické biochemie fyzikálně a chemicky Stolice  imunochemické testy Exsudát a transudát  speciální testy na rozlišení: složení močových kamenů, sliny (drogy), plodová voda (genetické vady), sperma (imunologické metody), pot (chloridy, drogy, proteiny). Krev Krev je nejčastější odebíraný vzorek. Odebírá se krev venosní, kapilární a arteriální, používáme sterilní jehly na jedno použití. Pro obtížné odběry jsou k dispozici speciální jehly s křidélky (modré, zelené) nebo jehla s krytím. Pro kapilární odběry slouží lancety, další obecně užívané pomůcky jsou držák, zkumavky. 1) Odběr venosní krve  poučení pacienta: 10 – 12 hodin nalačno, neměl by kouřit, pít alkohol, nevykonávat fyzicky náročnou činnost, obvyklý odběr je mezi 6 – 9 hodinou ranní.  speciální dieta  nejvhodnější poloha při odběru - vsedě, až pololeže, vhodný i krátký naprostý fyzický klid.  Nerozhoduje, z které ruky se odběr dělá, pozor na modřiny, u žen mastektomie (chirurgické odnětí prsu).  speciální pozornost: odběry při infusích, z kanyly, z portu. Průběh  Kůže v okolí místa odběru (kubitální žíla v loketním ohbí) se desinfikuje vhodným prostředkem (Cutasept, Septonex, 70 % isopropylalkohol, pozor na případné ovlivnění výsledku). Stékající desinfekce – volně zaschnout, otřít čtverečkem buničiny (vlhká kůže – hemolysis).  Paže – natažená směrem dolů, turniket alespoň 2,5 cm široký, přiložený ve výši 10 – 15 cm nad loktem, ne déle než 1 min  Paží se necvičí, zatnout pěst (po 5 min – přesun vody a nízkomolekulárních látek přes kapilární stěnu, změna aerobního metabolismu na anaerobní, změny koncentrace nebo katalytické koncentrace některých analytů (K + , laktát, cholesterol, bilirubin, ALT, AST, CK, LD)  sterilní čtvereček buničiny přiložit na vpich, stlačit na 2 – 3 min.  pacient by neměl vykonávat fyzicky náročnou činnost a odběrovou paži zatěžovat U starších dětí  odběr ze žíly stejným postupem  děti musí být klidné (strach a stres – zkreslení výsledku (zvýšený adrenalin, glukosa) U mladších dětí a novorozenců  lépe provádět odběr kapilární krve mikrozkumavky a lancety Materiál Odebírá se do skleněných i plastových zkumavek (skleněné – rychlejší sražení krve x zkreslení výsledků). Obsah zkumavek s protisrážlivými činidly se musí okamžitě po odběru dobře promíchat pomalým desetinásobným převrácením uzavřené zkumavky (mikrosraženiny). Netřepat! – mechanická hemolýza, denaturace bílkovin, snížení aktivity enzymů. Existují také vakuové odběrové systémy – barevně odlišené zátky podle druhu přídavku ve zkumavce. Barvy se liší podle výrobců (kontrola typů zkumavek). U těchto systémů je nutné vyčkat, až ustane nasávání krve (předčasné vysunutí – množství krve menší → porušení správného poměru krve k protisrážlivému činidlu). komplexotvorné působení některých činidel a druh kationtů (lithné či amonné soli). Ještě také užíváme zkumavky se zvláštními separačními gely (údaje výrobce, vliv při stanovení některých analytů). ÚSTNÍ ZKOUŠKA – 132. Existuje více typů vyšetření – odběr do více zkumavek 1. zkumavky bez přídavků, 2. zkumavky s citrátem na koagulační faktory, 3. zkumavky s heparinem, 4. zkumavky EDTA pro krevní obraz  Sérum – z plné krve, 30 min stání, sražení, centrifugace 5–10 min. při 2000 g, oddělení krevního koláče a séra  Plasma – antikoagulační látky – centrifugovat okamžitě, obvykle 15 min, navíc fibrinogen a ostatní koagulační faktory  Zkumavky není možné stáčet opakovaně, krvinky musí být odděleny do ½ h po stočení Hodnocení séra  hemolytické (rozpad erytrocytů)  ikterické (vyšší koncentrace bilirubinu)  chylosní (vyšší obsah lipoproteinů) 2) Odběr kapilární krve  potřeba malého množství materiálu, opakovaný odběr v krátkém čase (diabetici, ABR)  výhodný – u novorozenců a nedonošenců  z bočních stran patičky nebo prstu, méně vhodný odběr z ušního lalůčku nebo z palečku na noze  kůži prohřát přiložením zahřáté látky, desinfikovat 70% vodným roztokem isopropylalkoholu, osušit sterilním čtverečkem, opatrně vpichovat jehlu  hloubka vpichu na patičce < než 2,4 mm (narušení kosti, zvláště u nedonošenců)  první kapka – otřít, (vyšší procento tkáňového moku), nabírat z další kapky (nemnout, nevymačkávat krev)  zkreslení i u pacientů se špatným krevním oběhem a nedostatečným prokrvením periferie  nejčastější odběr – ze strany třetího nebo čtvrtého prstu nepíšící ruky  krev se nasává do špičky pipety nebo do heparinizované kapiláry  anaerobní odběr – vniknutí bublinek vzduchu změna poměru plynů, uvolnění NH 3  obsah promíchat (drátek a magnet)  odběr kapilární krve u metod POCT 3) Odběr arteriální krve  rizikový odběr, převádí lékař nebo proškolený personál  anaerobní odběr do heparinizovaných kapilár na vyšetření acidobazického stavu a NH 3  užívání vakuových systémů 4) Transport a uchovávání vzorku krve  přesun označeného vzorku s přiloženou žádankou do laboratoře – neprodlený (plná krev)  chránit před mrazem, přehřátím (ovlivnění enzymů) i světlem (odbourávání bilirubinu, porfyrinů, folátů)  do vzdálenějších laboratoří – vhodnější odesílat sérum nebo plasmu  ve speciálních případech transport na tajícím ledu (ABR, NH 3 )  speciální stanovení – požadavky laboratoře Moč Sběr a konzervace moče  dodržení základních hygienických požadavkù ÚSTNÍ ZKOUŠKA – 132.  čistota a označení odběrové nádoby,  střední proud ranní moče  jednorázový odběr – první ranní moč, střední proud po hladovění, nejvíce koncentrovaná, prvních 10 ml moče je nejvhodnější pro stanovení chorob ledvin  cévkovaná moč Sběr moče  po 3, 12, 24 hodinách  pro kvantitativní stanovení (Addisův sediment, minerály, kreatinin, hormony)  provedení (začátek, konec sběru)  konzervace – chlad, HCl, tymol, formaldehyd (ne pro chemická a mikrobiologická vyšetření), toluen, chloroform (několik ml) Žaludeční šťáva  bezbarvá tekutina, silně kyselá (pH 1,2–3,0), 2 sekrety obsahující prekursory proteolytických enzymů (pepsinogeny), HCl  získává se pomocí žaludeční sondy  stimulační test – odběry po podání pentagastrinu (na lačno koncentrace skoro nulová, po stimulaci max. asi za 40 min., 12–20 mmol/l/hod.) → stanovení sérového pepsinogenu Pankreatická šťáva  vylučována do duodena pod vlivem potravy a hormonů, výrazně alkalická (pH 7,1-8,3), obsahuje anorganické (hydrogenfosfáty) a organické látky  obsahuje důležité enzymy: trypsin, chymotrypsin, elastáza, karboxypeptidázy, α-amyláza, lipáza, DNA a RNA nukleáza (vylučovány jako neaktivní proenzymy)  získává se po zavedení sondy, vyšetření enzymů Žluč  produkt exkrece jater, lehce alkalická, žlutá – bilirubin (konjugovaný) a biliverdin, žlučové kyseliny (soli, konjugáty) – hořká chuť  žlučníková šťáva: 3x–5x hustší (sušina) než jaterní, vyšší obsah cholesterolu, žlučových kyselin a bilirubinu (za chorob. stavů vznikají kameny, 85% cholesterolu) Stolice  hnědé zbarvení – produkty odbourání bilirubinu,  zápach – produkty anaerobních bakterií, organické sirné sloučeniny  vyšetřuje se při krvácení v gastrointestinálním traktu (okultní krvácení) – screening karcinomu tlustého střeva  stanovení elastázy – lipidový metabolismus Mozkomíšní mok (likvor)  čirá, vodnatá tekutina, kvalitativní složení obdobné krev. plazmě, kvantit. nižší obsah bílkovin, glukózy, minerálů  získává se lumbální punkcí (sterilní odběr pro mikrobiologii), nutné alespoň 3 ml  fyzikální, chemické a mikroskopické vyšetření – statimové x speciální ÚSTNÍ ZKOUŠKA – 132. Ostatní materiál  exsudát, transudát – rozlišení Rivaltovou zkouškou (obsah proteinů, buněk)  pot, sliny, sperma, plodová voda, močové a žlučové kameny – speciální testy ÚSTNÍ ZKOUŠKA – 21. 1 Ϯ1. VALINÍ MATERIÁL K MIKROIOLOGICKMU VYaETŘENÍ U IN&EKCÍ KREVNÍHO ŘEIaT U SYSTMOV|CH IN&EKCÍ • mikrobiologické vyšetření krve významné pro diagnostiku: o septických stavů o kontinuální bakteriémie spojené např. s břišním tyfem nebo brucelózou o různých bakteriálních lézí – např. při endokarditidě o některých maligních procesů • krev by měla být sterilní, takže každý nález bakterií resp. kvasinek je pak příznakem bakteriémie resp. fungémie • i při těžkých sepsích je koncentrace bakterií v krvi malá, a tak se využívá hemokultivace (pomnožení v kultivačním médiu) Bakteriémie • krátkodobá (přechodná, intermitentní) o často již po průniku bakterií do krve poraněním nebo zákrokem (např. po extrakci zubu) o může být příznakem mikrobiálních lézí v různých orgánech, z nichž se bakterie uvolňují o viridující ústní streptokoky (po extrakci zubu), pneumokoky (při pneumónii), meningokoky (při meningitidě), Streptococcus agalactiae (při dětské meningitidě), E. coli a další enterobakterie (při pyelonefritidě), anaerobní střevní bakterie (při peritonitidě), Staphylococcus aureus (při osteomyelitidě), kožní bakterie (při dekubitech) • trvalá (kontinuální) o při celkových infekcích • při břišním tyfu (Salmonella typhi) • při brucelóze (bakterie rodu Brucella) • při intravaskulárních lézích (endokarditidy, tromboflebidity) • při karcinomech (např. střevních) • při leukémii (málo obvyklé bakterie - Aeromonas hydrophila, Bacillus spp., Capnocytoplhaga spp. – a kvasinky) Fungémie • při maligních onemocněních, zejména hematologických Septický syndrom (sepse, septikémie) • závažný, život ohrožující stav s řadou charakteristických příznaků • při větších koncentracích bakterií, při oslabení hostitele ÚSTNÍ ZKOUŠKA – 21. 2 • způsoben i lékařským zákrokem – tzv. katétrová sepse – vyvolána stafylokoky kolonizujícími plastové části katétrů po jejich kontaminaci nesterilním infuzním roztokem, nevhodné manipulaci nebo dlouhodobém zavedení Zásady odběru • nutná aseptická opatření (i stopová kontaminace se jeví jako závažná) • odběr žilní krve do sterilní stříkačky nebo odběrovou soupravou dodanou výrobcem komerčního systému (u dospělých 8 - 10 ml, děti 1 - 5 ml) • místo odběru dezinfikováno (jodová tinktura, Jodonal) – nechá se působit do zaschnutí • k odběru se nesmí používat dříve zavedené jehly • místo odběru se po dezinfekci nesmí palpovat • odebraná krev se vstříkne do hemokultivační nádobky – její zátka předem dezinfikována • důležitý čas odběru (bakterie nebývají do krve vyplavovány kontinuálně) – u septických stavů nejlépe vzorky odebrané na počátku vzestupu pacientovy teploty • několik odběrů v různých časových intervalech (kvůli snadné kontaminaci, nerovnoměrné koncentraci bakterií) • nehrozí-li nebezpečí z prodlení, měla by být krev na hemokultivaci odebraná před zahájením antibiotické terapie (u některých komerčních souprav možné zvolit kultivační médium s obsahem látek – např. aktivní uhlí - které omezují nepříznivý vliv antibiotik) Hodnocení hemokultury • významný každý nález bakterií, který není kontaminací, což může být těžké odlišit • odlišení o uvážení druhu bakterií (jedná se o příslušníky běžné kožní mikroflóry?) o účinnost dezinfekce kůže (byly stejné bakterie zachyceny i na kontrolním stěru?) o porovnání opakovaných nálezů (není nález ojedinělý?) o stav pacienta (jeví příznaky septického či jiného onemocnění?) • pro zjištění pozitivity hemokultury se provádí její vyočkování na kultivační půdy a následně identifikace a zjištění citlivosti izolovaných mikrobů na AML • důslednou asepsí je třeba zabránit kontaminaci hemokultury, infekci personálu • krev zvláště infekční͊ – kromě bakterií může obsahovat i viry (hepatitidy, HIV) ÚSTNÍ ZKOUŠKA – 22. 1 22. VALIDNÍ MATERIÁL K MIKROBIOLOGICKÉMU VYŠETŘENÍ U INFEKCÍ DÝCHACÍCH CEST, ÚSTNÍ DUTINY A UCHA Ústní dutina • stěr tamponem z lézí • případný povlak odloučených epiteli seškrábnout a odebrat stěr z jeho spodiny • větší abscesy – odběr tekutiny do stříkačky • etiologická agens: bakterie, viry i patogenní mikromycety Horní cesty dýchací • Nosní dutina o výtěr tamponem navinutým na drátu, zavedeným podél septa do průduchu do hloubky cca 3 cm o nosičství Staphylococcus aureus • Paranasální dutiny o výplach po punkci dutiny (výtěr z nosu není validní) o u sinusitid má smysl vyšetřovat jen centrifugovaný výplach z dutiny provedený sterilním fyziologickým roztokem o u chronické sinusitidy je nutná i anaerobní kultivace vzorku o zánět paranazálních dutin (sinusitis maxillaris, příp. frontalis) • obvykle zahajují respirační viry, příp. Mycoplasma pneumoniae • hnisavá bakteriální infekce bývá až sekundární → Streptococcus pneumoniae a Haemophilus influenzae, méně často Branhamella (Moraxella) catarrhalis, Staphylococcus aureus a Streptococcus pyogenes • v etiologii sinusitid poměrně často i anaeroby, zejména Bacteroides spp., Prevotella spp., Porhyromonas spp. a Peptostreptococcus spp. o chronické sinusitidy → grampozitivní koky (stafylokoky), a to i anaerobní (peptokoky, peptostreptokoky) • Krk – tonzily o výtěry z krku se provádějí hlavně při akutních zánětech horních cest dýchacích (tonsilitidy, faryngitidy), umožňují taky záchyt rezidentních potenciálních patogenů, které vyvolávají i jiná onemocnění (Streptococccus agalactiae, pneumokoky, meningokoky, gonokoky) o ráno, nalačno, před ústní hygienou (bakteriální flóra není spolknuta nebo vypláchnuta) o pacient vyplázne jazyk nebo jej stlačíme špachtlí (vyslovením „á“ je elevací uvuly minimalizován dávivý reflex) ÚSTNÍ ZKOUŠKA – 22. 2 o tamponem se valivým pohybem otře povrch tonzil, příp. zadní stěny faryngu o Streptococcus pyogenes • o jeho přítomnosti svědčí hemolýza na krevním agaru • původce akutní tonsilitidy neboli pravé anginy, také tonsilitida katarální, folikulární, pseudomembranózní... • nebezpečí této anginy spočívá v jejích tzv. sterilních následcích – revmatické horečce či poststreptokokové glomerulonefritidě • občas se vyskytuje na tonzilách i u zdravých o Streptococccus agalactiae • vykazuje taky úplnou hemolýzu nebo jen viridaci • v této lokalitě jen potenciální patogen o Viridující streptokoky • běžnou součástí ústní mikroflóry • kromě účasti na vzniku zubního kazu jsou v této lokalitě nepatogenní • malé, suché a drsné kolonie – v tzv. R (rough) fázi o Streptococcus pneumoniae • patogenní, také vykazuje viridaci • faktorem virulence jeho pouzdro • původce onemocnění dýchacích cest včetně pneumonie • je třeba ho odlišit od ostatních viridujících streptokoků • odlišení tzv. optochinovým testem - streptococcus pneumoniae je citlivý na optochin, ostatní streptokoky jsou rezistentní • velké, vlhké a lesklé kolonie – v tzv. S (smooth) nebo M (mukózní) fázi o Staphylococcus aureus • patogenní (ale objevuje se i na tonsilách zdravých osob) • jeho hemolýza vzhledově odlišná od hemolýzy Streptococcus pyogenes, kolonie žlutohnědě pigmentovány • komplikuje banální virová onemocnění nebo chřipky, které mohou přejít až v pneumonii • terapie problematická, u běžného nosičství se nezahajuje, pro volbu vhodné AML je kvůli obvyklé multirezistenci vhodné vyšetření citlivosti o Neisserie • mnoho nepatogenních, součástí ústní mikroflóry, malé našedlé kolonie ÚSTNÍ ZKOUŠKA – 22. 3 • patogenní – Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae – růstově náročné (komplexní půdy a atmosféra s CO 2 ) o Haemophilus influenzae • u dospělých považován za součást ústní mikroflóry • může komplikovat virová onemocnění – laryngitidy, bronchitidy • hlavně u dětí (někdy u dospělých) je ale původcem epiglotitidy, pneumonie či meningitidy • jeho přítomnost může být ověřena na čokoládovém agaru • kultivace se stafylokokovou čárou – hemofily nevykazují hemolýzu, proto se kultivují současně se Staphylococcus aureus, ten způsobí hemolýzu a z erytrocytů se uvolní hemin, který Haemophilus potřebuje • hemofily pak rostou jako drobné kolonie v zóně hemolýzy okolo stafylokokové čáry – tento jev se nazývá satelitismus • Laryngeální výtěr o vlhký tampon na drátě se zavede nad příklopku hrtanovou o pacient zakašle – na tamponu se zachytí kapénky sekretu dýchacích cest o Bordetella pertusis, Bordetella parapertussis, mykobakteriózy Dolní cesty dýchací • Sputum o odběr ráno před jídlem a ústní hygienou do tzv. sputovky (nádobka se širokým hrdlem a uzávěrem) o sliny jsou bezcenné, nutné vykašlání sputa z dolních cest dýchacích!!! o diagnostika tuberkulózy o při diagnostice pneumónií je třeba interpretovat významnost nalezených bakterií a vyhodnotit taky množství leukocytů a polymorfonukleárů • Bronchoalveolární laváž (BAL) o diagnostika pneumónií i jiných zánětů o provádí se zavedením sondy a výplachem do cca 30 ml fyziologického roztoku o vlastní mikrobiologické vyšetření musí být provedeno a vyhodnoceno alespoň semikvantitativně, protože takto získané vzorky jsou vždy kontaminovány flórou horních cest dýchacích o hraniční koncentrace pro pneumonii 10 4 bakterií v 1 ml o kontaminaci vzorku mikroflórou horních cest dýchacích omezují techniky chráněného odběru (protected specimen brush technique, PSB) ÚSTNÍ ZKOUŠKA – 22. 4 • do bronchu se zavede dvojitý bronchoskopický katétr umožňující kromě fibroskopické kontroly odběr malého množství (0,001 – 0,01 ml) sekretu na kartáček zasunutý během zavádění a vytahování v uzavřeném katétru • vzorek se vyšetřuje kvantitativně, 10 3 bakterií ve vzorku odpovídá koncentraci 10 5 až 10 6 bakterií v 1 ml sekretu Ucho • kultivace bakteriálního původce • sekret ze středouší po paracentéze nebo spontánní perforaci • u externích a chronických otitid výtěr zvukovodu • zánět zevního zvukovodu (otitis externa) → Staphylococcus aureus • chronické otitidy → Pseudomonas aeruginosa, příp. Proteus mirabilis • akutní zánět středního ucha (otitis media) o obvykle zahajují respirační viry, příp. Mycoplasma pneumoniae o hnisavá bakteriální infekce bývá až sekundární → Streptococcus pneumoniae a Haemophilus influenzae, méně často Branhamella (Moraxella) catarrhalis, Staphylococcus aureus a Streptococcus pyogenes o v etiologii mediálních otitid poměrně často i anaeroby, zejména Bacteroides spp., Prevotella spp., Porhyromonas spp. a Peptostreptococcus spp. PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 23. 1 23. VALIDNÍ MATERIÁL K MIKROBIOLOGICKÉMU VYŠETŘENÍ U INFEKCÍ GASTROINTESTINÁLNÍHO TRAKTU obecné zásady: - základním předpokladem je správný odběr a transport vzorku͊ - dodržet sterilitu odběrových pomůcek (při odběrech na kultivační vyšetření) - při odběru na parazity může být i nesterilní - použití SPZsN|C, odběrových souprav - prevence dodatečné kontaminace vzorku - desinfekce okolí odběrového místa - odběrové pomůcky (jehly, tampony, stříkačky͙) vyjmout z obalu těsně před použitím - při manipulaci se NESM1 dotknout jiného místa, než místa odběru - po provedení odběru se ihned vracejí do obaluͬ transportního média - odběr ze správné lokality, kterou požadujeme vyšetřit - dostatečné množství vzorku - důležitý je i čas odběru (v průběhu onemocnění se patogeny mohou měnit) - žádoucí odebírat před zahájením léčby ATB a jiné terapie - komunikace s pacientem, informovanost (co, proč, jak)  - dokumentace (označení nádobky, průvodka, žádanka) - označení nádobky, žádanka - identifikační Ʒdaje pacienta - pojišƛovna, diagnóza - klinika, jméno indikujícího lékaře a podpis - druh materiálu, datum odběru - požadované vyšetření - další informace důležité pro interpretaci výsledků (ATB, způsob odběru, příznaky͙) Žaludek, duodenum: - hl. při podezření na otravu potravinami - vyšetřuje se obsah – získán žaludeční sondou н zasílání zvratků - pro potvrzení alimentární infekce nutné dodat i zbytky podezřelých potravin (př.: u otravy botulotoxinem, stafylokokovým enterotoxinem) - Helicobacter pylori – cílené kultivačníͬmikroskopické vyhledání - odběr biopsie – transport v chladu v mediu Stolice: syšetření stolice: - běžný dg. postup – hl. při akutních průjmových onemocněních, a jiných onemocněních '/T s nejasnou etiologií - pro hromadné vyšetření při podezření na epidemie salmonelózyͬ shigelózy – tampony impregnované deoxycholát-citrátovým kultivačním médiem PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 23. 2 - odběr – tamponem – zavedeným hluboko do konečníku – transportní medium pro přepravu - ev. rektální rourka - kousek stolice – na bakteriologické ve sterilnímͬparazitární nemusí být sterilní - vyšetření průjmové stolice po podání projímadla – při podezření na nosičství PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 24. 1 24. VALIDNÍ MATERIÁL K MIKROBIOLOGICKÉMU VYŠETŘENÍ U INFEKCÍ MOČOVÝCH CEST obecné zásady: - základním předpokladem je správný odběr a transport vzorku! - dodržet sterilitu odběrových pomůcek (při odběrech na kultivační vyšetření) - použití SPRÁVNÝCH odběrových souprav - prevence dodatečné kontaminace vzorku - desinfekce okolí odběrového místa - odběrové pomůcky (jehly, tampony, stříkačky...) vyjmout z obalu těsně před použitím - při manipulaci se NESMÍ dotknout jiného místa, než místa odběru - po provedení odběru se ihned vracejí do obalu/ transportního média - odběr ze správné lokality, kterou požadujeme vyšetřit - dostatečné množství vzorku - důležitý je i čas odběru (v průběhu onemocnění se patogeny mohou měnit) - žádoucí odebírat před zahájením léčby ATB a jiné terapie - komunikace s pacientem, informovanost (co, proč, jak)  - dokumentace (označení nádobky, průvodka, žádanka) - označení nádobky, žádanka - identifikační údaje pacienta - pojišťovna, diagnóza - klinika, jméno indikujícího lékaře a podpis - druh materiálu, datum odběru - požadované vyšetření - další informace důležité pro interpretaci výsledk ( ATB, způsob odběru, příznaky...) Odběr moči: - důležité zabránit kontaminaci z ústí uretry a okolí – před odběrem dekontaminace (alespoň omytí mýdlem) + u žen zamezit styku se zevním genitálem 1) vymočením do sterilní nádobky ; uzavírá se ihned sterilním víčkem - odběr první porce moči – při podezření na zánět přední části uretry (uretritida) - střední proud moči – první porce je vymočena a s sebou odnáší bakterie z uretry a jejího ústí - při podezření na onemocnění vyšších etáží (cystitida, nefritida) - konečný proud moči – odběr při podezření na prostatitidu 2) odběr moči cévkováním - u hospitalizovaných pacientů – kontaminace není vyloučena, hl. u permanentních katetrů, které bývají osídleny mikroflórou - hrozí nebezpečí infekce pacienta při katetrizaci 3) suprapubická punkce – minimální využití Odebrané množství: - postačí pár ml PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 24. 2 - výjimkou – 100-200 ml pro vyšetření na tuberkulózu a Weilovu nemoc Transport: - při delším transportu než několik hodin se doporučuje chlazení vzorku na 4°C (pro zabránění množení bakterií) Vyšetření moči: - zpravidla kvantitativní Výtěr z uretry: 1) pro diagnostiku kapavky – Neisseria gonorrhoae - citlivost na vyschnutí tamponu – nutnost uložení do transportního media/ přímý odběr na kultivační médium 2) chlamydiové uretitidy – speciální dakronový tampon – sedřou se epitelie s intracelulárními chlamydiemi PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 28. 1 28. Validní materiál k mikrobiologickému vyšetření u kožních infekcí - Hnis je klinicky validní materiál a je vhodnější než pouhý výtěr z hnisavého ložiska, který může obsahovat běžnou kožní flóru; - V případě podezření na infekci anaerobními mikroorganismy je nezbytné materiál transportovat v uzavřeném systému umožňujícím zachování anaerobního prostředí; - Onemocnění kůže mohou vyvolat nejrůznější původci; na kůži se často projevuje řada onemocnění jiných orgánů; - Mikrobiologické vyšetření je indikováno u onemocnění povrchových (dermatomykózy, dermatofytózy) – na vyšetření se zasílá samovolně uvolněný (šupinky) nebo opatrně seškrábnutý povrch kůže, seškrab nehtů, vytržené chlupy, vousy či vlasy; - Z akutních projevů kožních infekcí, vředů, furunklů, abscesů, granulomů apod. se odebírá stříkačkou co největší množství hnisu či exsudátu; - Je-li tekutiny málo, odebírá se stěr či výtěr tamponem, vhodný je i otisk léze na mikroskopické podložní sklíčko případně přímo na povrch agarové půdy; - Zejména při hlubších lézích je velmi žádoucí odběr na anaerobní vyšetření; - Z nehnisavých granulomů, spojených např. s infekcemi atypickými mykobakteriemi včetně lepry, se odebírají excise; - Kožní léze o Mikrobiologické vyšetření (základní) – odběr (stěr z kožní léze); adjustace (sterilní tampón na špejli ve zkumavce s transportní půdou podle Amiese); uchovávání před transportem (maximálně 16 h při pokojové teplotě); podmínky transportu (do 2 h při pokojové teplotě); výsledky – negativní (2 dny); výsledky – pozitivní (2-4 dny); o Mykobakteriologické vyšetření – odběr (stěr z kožní léze); adjustace (sterilní tampon na špejli ve zkumavce bez transportní půdy zvlhčený ve sterilní destilované vodě); uchovávání před transportem (max 16 h při pokojové teplotě); podmínky transportu (do 2 h při pokojové teplotě); výsledky – negativní (9 týdnů); výsledky – pozitivní (9 týdnů); o Dermatomykózy – odběr (po dezinfekci 70% alkoholem se sterilním skalpelem seškrábnou šupiny z okraje ložiska, nehet, podnehtová drť, vlasy se vytrhnou i s kořínkem z okraje ložiska); adjustace (odběrový kontejner); uchovávání před transportem (při pokojové teplotě); podmínky transportu (do 72 h při pokojové teplotě); výsledky – negativní (3 týdny, výsledek mikroskopického vyšetření do 3 dnů); výsledky – pozitivní (2-3 týdny); Klinická mikrobiologie infekcí kůže a měkkých tkání Primární pyodermie, impetigo, - Etiologie: Staphylococcus aureus (70 – 80 %), Streptococcus pyogenes (20 – 30 %). - Projevy: superficiální, intraepidermální, nebolestivé vesikulopustuly; vysoce infekční (!). - Klinicky validní materiál: obsah pustul. PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 28. 2 Folikulitida - Etiologie: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa (sérotyp O11). - Projevy: pyodermie vlasového folikulu, papula 2 – 5 mm s okolní deskvamací; sycosis barbae – hluboká, často chronická folikulitida vousaté části. - Klinicky validní materiál: obsah papuly. Furunkl, karbunkl - Etiologie: Staphylococcus aureus. - Projevy: hluboký zánět zasahující do podkoží rezultující z předchozí folikulitidy; karbunkl je větší a hlubší léze s celkovými příznaky. - Klinicky validní materiál: tkáň/hnis; krev na hemokultivaci při celkových příznacích. Erysipel - Etiologie: Streptococcus pyogenes. - Projevy: bolestivá superficiální celulitida s lymfadenitidou s ostře ohraničenými okraji vystupující na okolí, nejčastěji se objevují na místech s preexistující lymfatickou obstrukcí. - Klinicky validní materiál: biopsie. Celulitida - Etiologie: Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, méně často enterobakterie, Haemophilus influenzae, Pasteurella multocida, Pseudomonas aeruginosa. - Projevy: akutní zánět kůže a podkoží s teplotou, únavou a zimnicemi bez zřetelného ohraničení a elevace versus erysipel; regionální lymfadenopatie. - Klinicky validní materiál: aspirační biopsie. Kožní formy difterie - Etiologie: Corynebacterium diphtheriae. - Projevy: tři typy lézí: a) ranná difterie – sekundární infekce preexistující rány; b) primární kožní difterie - v tropech; c) superinfekce ekzematózních kožních lézí. - Klinicky validní materiál: pseudomembrány z povrchu lézí. - - Streptokoková gangréna (nekrotizující fasciitida – typ II) - Etiologie: Streptococcus pyogenes, vzácně streptokoky sk. C, G. - Projevy: výrazná lokální bolestivost, edém, erytém; velmi rychle se šíří do hlubokých tkání – poté streptokoková myositida doprovázená vysokou teplotou. - Klinicky validní materiál: hnis (sekret) z rány, biopsie tkáně, krev na hemokultivaci. Progresivní bakteriální synergická gangréna - Etiologie: anaerobní streptokoky, Staphylococcus aureus, Proteus spp. - Projevy: rozvoj infekce v ráně po chirurgickém výkonu; lokální bolestivost, napětí, erytém, otok s tendencí k ulceraci; vřed je obklopen gangrenózní kůží přecházející do edematózní, růžové přechodné oblasti; proces pokračuje pomalu, ale vytrvale. - Klinicky validní materiál: hnis (sekret) z rány, biopsie tkáně. Synergická nekrotizující celulitida PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 28. 3 - Etiologie: smíšená flóra, peptostreptokoky, Bacteroides spp., Escherichia coli. - Projevy: výrazná lokální bolestivost, edém, erytém; rychle se šíří do hlubokých tkání; může být přítomen krepitus; odporně páchnoucí sekrece z rány. - Klinicky validní materiál: hnis (sekret) z rány, biopsie tkáně. Klostridiová anaerobní celulitida - Etiologie: Clostridium perfringens, C. septicum. - Projevy: ID delší než 3 dny; tmavá mírně páchnoucí sekrece z rány s příměsí tukových globulí, extenzivní krepitus (!) – výraznější než u myonekrózy. - Klinicky validní materiál: hnis (sekret) z rány, biopsie tkáně. Nekrotizující fasciitida (typ I) - Etiologie: peptostreptokoky, Bacteroides spp., enterobakterie, vzácně: MRSA (u HIV pozitivních a imunosuprimovaných), Pseudomonas aeruginosa, Vibrio vulnificus, Aeromonas hydrophila. - Projevy: ID 1 – 4 dny; neostře ohraničená léze nejčastěji na končetinách; zapáchající séropurulentní exsudát, výrazná bolest a otok; rychlá progrese se změnou barvy kůže z červené na modrošedou a s tvorbou puchýřů a nastupující anestézií postiženého okrsku. - Klinicky validní materiál: exsudát z rány, biopsie tkáně. Gangrenózní celulitida u imunosuprimovaných pacientů - Etiologie: Pseudomonas aeruginosa. - Projevy: vysoká teplota, rychlá progrese, mírná bolestivost, ostře ohraničená nekrotická oblast s černými příškvary a se zarudlým okolím připomínající dekubitální vředy. - Klinicky validní materiál: hnis (sekret) z rány; biopsie tkáně. Pyomyositida (bakteriální) - Etiologie: Staphylococcus aureus; u HIV pozitivních pacientů: S. aureus, Salmonella spp., streptokoky. - Projevy: primární svalový absces bez postižení kůže a podkoží; vysoké teploty, lokalizovaná bolest a „dřevnatá“ konzistence. - Klinicky validní materiál: hnis; krev na hemokultivaci. Klostridiová myonekróza / plynatá gangréna - Etiologie: Clostridium perfringens, C. septicum. - Projevy: ID 6 hod – 2 dny; rapidně progredující, život ohrožující anaerobní infekce kosterních svalů; prominující bolest, otok postiženého svalu, hypotenze, tachykardie => šok, renální selhání; sérosangvinózní exsudát; krepitus bývá přítomen. - Klinicky validní materiál: exsudát. Dermatofytózy - Etiologie: nejčastěji Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes/interdigitale complex, vzácněji T. verrucosum, T. tonsurans, T. schoenleinii, Microsporum canis, M. gypseum, Epidermophyton floccosum. PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 28. 4 - Projevy: jsou rozmanité, od nenápadných olupujících se zarudlých ložisek až po abscedující ložiska pokrytá krustami s množstvím píštělí, doprovázené lymfadenitidou regionálních uzlin. Antropofilní dermatofyta vyvolávají povrchová onemocnění kůže a adnex se slabou zánětlivou reakcí; zvířecí druhy mohou vyvolávat výraznou zánětlivou reakci a invadovat i podkoží. Infekce mohou postihnout veškeré části těla a dle lokalizace procesu je nazýváme tinea capitis, t. barbae, t. corporis, t. cruris, t. mannum, t. pedis. Časté jsou i infekce nehtů a nehtových plotének (onychomykózy). Postižen může být jeden i více nehtů, které ztrácejí barvu, jsou matné, ztluštělé, a tvoří se ložiska hyperkeratózy, která mohou odlučovat nehtovou ploténku od lůžka; infekce se může šířit i do nehtového lůžka. Při diagnostice jsou významné anamnestické údaje o pobytu v přírodě, kontaktu se zvířaty nebo i profesionální anamnéza. - Klinicky validní materiál: šupiny z okraje ložisek, nehty a podnehtová drť, vlasy, vousy, příp. tkáň z okraje ložisek při zasažení podkoží na mikroskopické a kultivační vyšetření. Kožní a slizniční kandidóza - Etiologie: Candida albicans a další druhy (např. C. parapsilosis, C. tropicalis, vzácněji C. glabrata, C. krusei, C. famata, C. lusitaniae, C. guilliermondii), Saccharomyces spp., Trichosporon spp., Rhodotorula spp., Cryptococcus spp. - Projevy: kožní kandidóza – vzniká v intertriginózních prostorách; objevují se drobné vezikuly, které se mění v svědící červenavá vlhká ložiska, jejichž okraje macerují (interdigitální forma) a následně se tvoří i bolestivé ragády. Infekce může vznikat i v místech vlhké zapářky (intertrigo) nebo v tzv. plenkové lokalizaci (plenková dermatitida), kdy se objevují tmavá větší ložiska na stehnech, hýždích a genitálu. Vzácně se může objevit u imunosuprimovaných pacientů generalizovaná kožní kandidóza projevující se drobnými červenými uzlíky kdekoli po těle. Kandidová onychomykóza: vzniká většinou sekundárně v proximální části nehtu; bývá spojená s tvorbou paronychia (nehtové valy zduřelé, zarudlé a silně bolestivé). Slizniční kandidózy se mohou vyskytovat v akutní i chronické formě; většinou se manifestují jako ostře ohraničené bělavé povláčky, které mohou splývat. Podle lokalizace procesu se rozlišují různé klinické jednotky: orální kandidóza, vulvovaginální kandidóza či kandidová balanitida. - Klinicky validní materiál: stěr, seškrab nebo biopsie z ložisek na mikroskopické a kultivační vyšetření. Pityriáza - Etiologie: nejčastěji Malassezia furfur, M. globosa, M. sympodialis. - Projevy: manifestace drobnými světlými ložisky na kůži (většinou vadí pouze kosmeticky). U imunosuprimovaných, hlavně HIV pozitivních, vyvolává M. furfur seboroickou dermatitidu. - Klinicky validní materiál: seškrab z ložisek na mikroskopické vyšetření, kultivace se nemusí podařit vzhledem k tomu, že se jedná o lipofilní druh. Otomykózy - Etiologie: nejčastěji Aspergillus fumigatus, A. niger, A. flavus, Candida albicans, C. parapsilosis a další druhy. PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 28. 5 - Projevy: převážně se jedná o chronickou infekci zevního zvukovodu často nasedající na bakteriální zánět, může však probíhat akutně i subakutně. Středouší bývá postiženo vzácně. - Klinicky validní materiál: výtěr ze zevního zvukovodu, tkáň ze středouší na mikroskopické a kultivační vyšetření. Mykotické infekce měkkých tkání - Etiologie: dermatofyta, Aspergillus spp., zygomycety, vzácně jiné druhy. - Klinické projevy: mykotické infekce měkkých tkání se v ČR vyskytují vzácně. U imunokompetentních pacientů mohou dermatofyta (hlavně T. verrucosum) invadovat podkoží a měkké tkáně, vzácně se uplatňují i mukormycety při porušení kožních bariér (např. kontaminace rány při traumatech) nebo během hospitalizace. Aspergily a zygomycety se mohou u imunosuprimovaných pacientů šířit z ložisek infekce (nejčastěji paranazálních sinů) per continuitatem a zasahovat i do měkkých tkání. - Klinicky validní materiál: infikovaná tkáň na mikroskopické a kultivační vyšetření, stěr z ložiska může být negativní. Virové infekce - Etiologie: viry, které přímo infikují kůži a sliznice jsou příslušníci 4 rodů – herpesviry, zvláště HSV a VZV, enteroviry – především coxsackieviry B, lidské papilomaviry a poxviry. Kožními projevy se manifestují i další virové infekce, jako spalničky, zarděnky, exanthema subitum, erythema infectiosum, dengue a další. Zde jde obvykle o projev celkové infekce a etiologické agens se nedetekuje z kožních lézí. - Projevy: HSV – gingivostomatitida, opar, herpetické panaritium, paronychium, herpes genitalis, perianalis, analis, eczema herpeticum, atd.; VZV – plané neštovice, pásový opar; enteroviry – herpangina, syndrom ruka – noha – ústa, exantémy různých forem; poxviry - molluscum contagiosum (MC virus), a další. Papilomaviry – veruky, epidermodysplasia verruciformis, condylomata accuminata, laryngální papilomatóza, atd. - Klinicky validní materiál: obsah vezikul, stěr z léze do transportního média, stěr nebo otisk na sklíčko, krev na sérologii. Virologické vyšetření molluscum contagiosum se neprovádí. Parazitární infekce - Viz parazitologie Laboratorní diagnostika: - Tekutý klinický materiál: mikroskopické vyšetření (barvení dle Grama); kultivační vyšetření - krevní agar se stafylokokovou čárou, EA, Sabouraudův agar; anaerobní kultivace - Stěry, výtěry apod.: kultivační vyšetření- krevní agar se stafylokokovou čárou, EA, Sabouraudův agar Otisková metoda - Připravené krevní agary se sterilním čtverečkem filtračního papíru se zašlou na oddělení. Na oddělení se provede otisk ranné plochy, tak že se přenese zpět sterilní pinzetou čtvereček na plochu, ponechá asi 15 vteřin a poté se přenese zpět na PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 28. 6 plotnu. Plotna se řádně označí a odešle do laboratoře, kde se otisk sterilně sejme a plotna se inkubuje 24 hod při 36 °C, při negativním nálezu se ještě dohřívá. - Terapie: betalaktamy (penicilin, oxacilin, aminopenicilin, cefalosporinů 1. a 2. generace), fluorované chinolony (P.aeruginosa), linkosamidy, antimykotika PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 29. 1 29. Mikrobiologické vyšetření bioptického materiálu, punktátu, sekčního materiálu - Vzorky se odebírají z reprezentativního místa infekce na základě validní klinické diagnózy; - Před odebráním vzorku je nezbytná znalost toho, co je třeba prokázat, odkud vzorek odebrat a jak jej zpracovat; - Vzorky musí být odebrán co nejdříve, před nasazením terapie a v adekvátním objemu, který umožní detekci agens͖ - Vzorky musí být správně označeny a každý musí doprovázet vyplněný průvodní list (žádanka)͖ - Stěry a výtěry – indikovány pouze pro odběry orofaryngeální, nazofaryngeální, ušní, oční, rektální, z povrchů superficiálních lézí kůže a sliznic či pro speciální odběry urogenitální͖ ї odběr do nádobek s transportní půdou͖ - Tekuté vzorky (moč, výplachy, punktáty, krev) a tkáŸové biopsie – zasílají se v odběrových nádobách se speciálním médiem či fixačním činidlem, nebo bez něj (sdělí laboratoř)͖ - Vzorky nutné uložit okamžitě po odběru do adekvátního média a uchovávat je za vhodných podmínek͖ - Bioptický materiál o biopsie je vyšetření vzorku živého lidského orgánu nebo tkáně͖ o vzorky se nejčastěji vyšetřují histologicky a cytologicky͖ o lze výjimečně vyšetřovat jako nefixované nativní preparáty (např. schistosomóza)͖ častěji kultivace na pevných nebo tekutých půdách (bakterie, mikromycety, prvoci)͖ či v tkáŸových kulturách (viry)͖ nebo ke zhotovení histologického preparátu; o ke kultivaci se zasílají vzorky ve fyziologickém roztoku nebo v transportních médiích za definovaných podmínek (čas, teplota, prostředí)͖ o může se před fixací pro histologii použít ke zhotovení otisků, roztěrů apod. (např. leishmanióza)͖ o pro histologická vyšetření se vzorky po odběru fixují – nejčastějším fixačním činidlem je formol či fixace v čistém (ε6й) alkoholu – ta je vhodnější pro molekulárněbiologické metody͖ o pro cílené vyšetření metodami molekulárněbiologickými je vhodné doručit zmražený vzorek͖ o pro vyšetření elektronovou mikroskopií se vzorky ihned po odběru vkládají do adekvátního média͖ o před odběrem biopsie je vhodné kontaktovat příslušnou laboratoř, která bude požadované vyšetření provádět͖ o odběr – biopsie kožní a orgánová (tkáŸ, kost), optimálně několik vzorků z různých míst postižené tkáně o adjustace – sterilní zkumavka se šroubovacím uzávěrem, se sterilním fyziologickým roztokem͖ PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 29. 2 o uchovávání před transportem – max 16 h při chladničkové teplotě (4°C) – přítomné bakterie mohou být při vyšší teplotě příčinou kvasných procesů s tvorbou plynu a způsobit porušení obalu; o podmínky transportu – do 2 h při chladničkové teplotě͖ o výsledky – do 2-6 dnů͖ - Punktát o punkce je výkon, při kterém se zavádí punkční jehla do příslušné tělní dutiny nebo orgánu͖ o nutný informovaný souhlas͖ o odběr mozkomíšního moku (liquor)  pro diagnostiku bakteriálních onemocnění͖  odebírá se přísně asepticky z páteřního kanálu při lumbální punkci ї jehla se zavádí do subarachnoidálního prostoru míšního kanálu – vpich se vede třetím a čtvrtým nebo čtvrtým a pátým lumbálním obratlem͖  odběr – aseptický, po dezinfekci místa odběru, do uzavřené stříkačky, nikoliv odkapáváním do zkumavky, v množství asi 5 ml͖  bakteriální meningitidy – velmi nebezpečné – ke zlepšení záchytu Neisseria meningitidis se doporučuje odběr do malého množství sterilního roztoku glukosy͖  důležitý rychlý transport do laboratoře – pro transport vhodnější pokojová teplota (příliš nízká by mohla negativně ovlivnit kultivaci N. meningitidis)͖ a jeho okamžité zpracování͖  pokud nelze transport realizovat okamžitě, je možné ho inokulovat do lahvičky pro hemokulturu a ponechat při pokojové teplotě͖ o odběr tekutiny z peritoneální dutiny  abdominální paracentéza je odstranění tekutiny z peritoneální dutiny – při zmnožení a nahromadění velkého množství – ascites;  před punkcí nemocný lačný, vyprázdněný͖ výkon se provádí v polosedě, aby se tekutina nahromadila v dolní části břišní dutiny͖ o odběr tekutiny z pleurální dutiny  se nazývá torakocentéza͖  výkon se provádí sterilně, punkční jehlou, na kterou nasadíme trojcestný kohout, abychom zabránili vniknutí vzduchu do pohrudniční dutiny͖  nasajeme asi 5-15 ml punktátu a ihned odešleme do laboratoře͖  pneumonie a malignity jsou nejčastější příčiny pleurálního výpotku͖  výpotek by měl být kultivován na aerobní a anaerobní nespecifickou bakteriální flóru, mykobakteria, mykotické patogeny͖  provádí se mikroskopické vyšetření s 'ramovým barvením, iehlovým- Neelsenovým barvením (kultivace je přínosnější)͖  možné vyšetřovat i mikrobiální antigeny – nejčastěji vyšetření antigenu Streptococcus pneumoniae͖  vyšetření pomocí molekulárně genetických metod (PCZ)͖ PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 29. 3  u 'н kultivací dominují streptokoky (S. pneumoniae) a stafylokoky (S. aureus)͖  u '- kultivací dominují . coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas sp., Haemophilus influenza͖  nejčastější anaerobní patogeny – Bacteroides sp., Peptostreptococcus͖ - Sekční materiál (pitevní) o jednotlivé orgány nebo jejich části se posílají odděleně, uložené ve sterilních samostatných nádobách (aby se zabránilo vzájemné kontaminaci různých tkání; materiál odebrat v množství asi 1 cm3)͖ o pro virologické vyšetření – virologické odběrové transportní médium͖ o pro mikrobiologické vyšetření nesmějí být konzervovány roztokem formalinu (obvyklým při vyšetřeních histologických)͖ o pro bakteriologická vyšetření – zkumavka sterilní 30 ml se šroubovacím uzávěrem͖ o po odběru nutno zabránit přístupu vzduchu, aby bylo možno materiál kultivovat také anaerobně. PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 30. 1 30.Mikrobiologická kontrola prostředí a sterility - Mikroorganizmy - všudypřítomné (ubikviterní) - účastní se životních procesů ve složitých vzájemných vztazích - nezbytné pro život - důkaz → umělo chovány bezmikrobní (germ-free) pokusná zvířata- nejsou po přeneseni do normálního života schopná života - někdy nutno mikroby z určitých míst odstranit, nebo omezit jejich výskyt - k tomuto účelu – vyvinuta řada metod selektivní a úplné dezinfekce a sterilizace a řada metod pro kontroly těchto procesů - nutno postupovat uvážlivě – mohou nastat nežádoucí účinky – poškození předmětů a materiálů nevhodnou sterilizací nebo vedlejší účinky ATB zasahující do přirozeného mikrob. systému lidského střeva základní pojmy: • dekontaminace : - procesy ničení a odstraňování mikrobů a jejich součásti - procesy s menší účinností ( úklid , mytí, praní) - procesy s větší účinností ( pro úplnou sterilizaci) - patří sem i likvidace znehodnocených předmětů či nástrojů na jedno použití (spálení) • úklid, mytí a praní - odstraňuje mikroby mechanicky za použití horké vody a povrchově aktivních látek - snížení počtu asi o 90% - k předsterilizační očistě nástrojů a jiných předmětů, odstraňuje mechanické nečistoty(bílkoviny a jiné org.ll), které mohou mikroby chránit před půs. Dezinfekčních prostředků • sanitace - snížení koncentrace mikrobů na úroveň požadovanou ze zdravotního hlediska za bezpečnou - mechanické čistění, mytí, částečnou dezinfekci • asance - odstraňování reservoáru a přenášečů původců nákaz - ochrana před intoxikacemi ze znehodnocených a rozkládajících se potravin a předmětů • dezinfekce - úplné odstraňování původců infekcí, tj. patogenních a patogenně podmíněných mikroorg. - provádí se fyzikálními, chemickými dezinfekčními prostředky, kt. patogenní mikroorg. hubí nebo zbavuje patogenity PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 30. 2 - dezinfikovaný předmět nesmí obsahovat patogenní mikroorg. může obsahovat organizmy nepatogenní - předchází jí mechanická očista • Sanace - vyšší stupeň dezinfekce - liší se použitím účinnějších dezinf. činidel působících též na viry a spóry patogenních mikroorg. - pro předměty , které nejde sterilizovat - odstraňuje všechny formy kromě některých odolných spor a prionů • antisepse - odstranění patogenních mikroorg. z z určitého místa těla (kůže, sliznice, rány...) za použítí tzv. antiseptik, ATB nebo chemoterapeutik - antiseptika = dezinfekční činidla, která nesmějí v místě aplikace pacienta poškozovat (jódová tinktura) • asepse - souhrn opatření, podmínek a postupů (mechanických, dezinfekčních, antiseptických...) zabraňujících mikrobiální kontaminaci prostředí nebo předmětů • sterilizace - úplné odstranění všech životaschopných forem na površích nebo uvnitř daných systémů za použití fyzikálních nebo chemických prostředků - při volbě dekontaminace je třeba uvážit případnou rezistenci či toleranci mikroorg. k některých prostředkům - rezistence- primární nebo sekundární , tj. získaná selekcí nebo mutací • spóry- rezistentní k teplotě 100°C • stafylokoky- těžké kovy • E.coli – fenol • Pseudomonas aeruginosa – deriváty fenolu Kontrola prostředí: - metody kontroly čistoty ovzduší, povrchů, vody, potravin, lékařských nástrojů, farmakologických preparátů - nejčastější metody → kultivační → použití a provedení se řídí příslušnými předpisy (lékopisem PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 30. 3 - další metoda → zkouška na přítomnost pyrogenních látek (zejména bakteriálního endotoxinu) - pro kontrolu se užívají – aeroskopy (pracují na principu vysavače) - podstatnou částí je ventilátor, jehož rychlost může byt regulována - kontrolovaný vzduch se jím nasává a vyfukuje proti polotuhému kultivačnímu médiu ( na Petriho misce) - částice přítomné ve vzduchu včetně bakterii dopadají na povrch média - po inkubaci jsou spočítány vyrostlé kolonie udávající počet bakterii, resp. CFU v prošlém vzduchu - při známé průtokové rychlosti a době nasávání , může být vypočten počet bakterií resp. CFU v jednotce objemu vzduchu !!! CFU = colony forming unit (kolonii tvořící jednotka), která je v případě izolovaných bakteriálních buněk rovná počtu bakterií - bakterie jsou ve vzduchu většinou přítomny ve shlucích nebo na prachových částicích a kolonie proto nevznikla množením jedné bakterie - počet bakterií je obvykle větší než počet kolonií i CFU - orientační údaje o čistotě ovzduší poskytuje jednoduchá sedimentační metoda - při kultivační metodě – inokulum = stěr/ otisk zkoušeného povrchu SEDIMENTAČNÍ METODA – POSTUP: 1. na pracovní stůl položte dnem dolů Petriho misku s KA nebo živným agarem 2. odklopte víčko a ponechte exponovanou 1 hod. 3. misku inkubovat přes noc při 37°C 4. spočítat vyrostlé kolonie 5. popsat jejich morfologii a další vlastnosti( hemolýza...) 6. z vybraných kolonii připravit a popsat mikroskopické preparáty barvené dle Grama 7. počet kolonii udává počet CFU dopadlých na půdu za hodinu METODA NEPŘÍMÉHO OTISKU – POSTUP: - kontroluje čistotu povrchu libovolného předmětu PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 30. 4 1. na povrch KA nebo ŽA přiložte sterilní pinsetou připravený čtvereček sterilního filtračního papíru 2. po jeho navlhnutí přitiskneme papírek na zkoumaný povrch 3. po 1 min. přitiskneme znovu na KA a ponecháme 1 min. 4. papír sejmeme a inkubujeme přes noc při 37°C 5. spočítat vyrostlé kolonie 6. popsat jejich morfologii a další vlastnosti 7. z počtu kolonií a plochy papíru vypočítejte počet CFU na 1 cm 3 zkoušené plochy Kontrola sterilizačních procesů: - využívají se fyzikální, chemické a biologické metody • FYZIKÁLNÍ METODY - spočívají v záznamu správné činnosti sterilizačního zařízení, obvykle autoklávu, zapisovacím zařízením ( termografem) , jehož záznamem je průběh procesu dokumentován • CHEMICKÉ METODY - spočívají ve změně barvy indikátoru, který se vkládá do steril.zařízeni spolu se steril.materálem - příkladem jsou skleněné indikátorové trubičky STERILAN- jejichž obsah mění při 120°C barvu z růžové na zelenou - steril.předměty mohou být vloženy do papírových sáčků LUKASTERIK, opatřených bezbarvým indikačním proužkem, který po tepelné nebo formalínové sterilizaci zhnědne a umožní odlišení sterilizovaných a nesteril.materiálů • BIOLOGICKÉ METODY - Spočívají v kontrolní sterilizaci indikátorových kmenů sporulujících bacilů → Bacillus stearothermophilus – pro parní a formaldehydovou sterilizaci →Bacillus mesentericus a subtilis – pro horkovzdušnou a ethylenoxidovou sterilizaci - po sterilizaci se kontrolní kmeny inkubují po dobu 7 dnů v tekutých médiích - jejichž růst dokazuje neúčinnost steril.procesu - účinnost chem. prostředků – stanovujeme a ověřujeme biolog. metodami → roztokem zkoušeného prostředku o různých koncentracích působí na kultury referenčních mikrobiálních kmenů - v různých časových intervalech se pak odebírají vzorky, které se vyočkují a kultivují - stanoví se minimální inhibiční cidní koncentrace (podobně jako stanovení MIC a MBC při stanovení citlivosti na ATB) i minimální doba působení daného prostředku na daný mikroorg. - účinnost aktuálních dezinfekčních a sterilizačních procesů se provádí metodami kontroly PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 30. 5 POSTUP KONTROLY ÚČINNOSTI : - sterilizace zeminy varem a autoklávovaním 1. z připravené zeminy odeberte cca 1cm 3 (lžičku) do baňky a suspendujte v cca 50 ml fyziologického roztoku 2. ze suspenze vyočkujte jednu kapku na krevní nebo živní agar 3. baňku uzavřete fólií a suspenzi povařte 10min. nad kahanem 4. po vychladnutí znovu jednu kapku vyočkujte 5. baňku se suspenzí odevzdejte ke sterilizaci autoklávovaním 6. poté z ní znovu vyočkujte 7. naočkované půdy inkubujeme přes noc při 37°C 8. semikvantitativně odhadněte počet vyrostlých kolonií 9. pokud se vytvořili izolované kolonie, spočítejte je a vypočítejte účinnost obou postupů v procentech úbytku bakterií PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 31. 1 31. Metody Dekontaminace - hlavním cílem dekontaminace je odstranit z kontaminovaných povrchů a materiálů nebezpečné látky pod hodnoty přípustných norem a v případech, kdy je to možné, je pak úkolem tyto látky zničit, rozložit nebo jinak převést na neškodné produkty. Fyzikální metody • Snížená a zvýšená teplota - na různé mikroby různý účinek - různý účinek za přítomnosti vodní páry a vody - kombinované působení tepla a chem.prostředků(jejich účinnost se teplem zvyšuje) - účinnost působení závisí na době působení a počte mikrobů (závislost popisuje letalitní křivka) - v důsledku chladového šoku, při teplote 0°C některé mikroorg. hynou (Neisseria gonorhoae, Clostridium perfringens) - většina mikrobů chladnici přežívá ( 4°C) , některé se i množí ( Listeria monocytogenes) - zmrazení pod 0°C většina nepřežije , mechanické poškození růstem krystalů ledu - za přítomnosti ochranných ll. (glycerol, mléko, sérum)- většina bakterií zmrazení dobře přežívá - odstraněním vody lyofilizací (mrazovou sublimací) se ze zmrazených kultur připravují konservy sbírkových bakteriálních kmenů • Pasteurizace - zahřání kapaliny na poměrně nízkou teplotu - při dlouhodobé pasteurizaci na 62°C po 30min. - obvykle v několikavteřinovém zahřátí na 70 – 80 °C - ke krátkodobé konzervaci termolabilních tekutin, havně potravinářských ( mléko, pivo, víno..) - z 99 ́% ničí patogeny (salmonely, brucely, mykobakterie, hemolytické streptokoky, stafylokoky) - přežívají spory a termofilní mikroorg. (St. fecalis, S. lactis) - tzv. ultrapasteurizace (uperizace) –mžikové zahřátí kapaliny (nejčastěji mléka) vstřiknutím vodní páry přehřáté na 150°C – ničí všechny mikroby včetně spor - provádí se v kontaminovaných průtokových sterilizátorech • Tyndalizace - zahřátím na 60°C po dobu 30 – 60 min. - opakuje ze 6x v intervalech 16 – 24hod. - u termolabilních látek • Var za normálního tlaku - ve vodě při 100°C hubí po 2 – 30 min. většinu vegetativních forem bakterií, virů a kvasinek PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 31. 2 - přežívají některé viry (heptitida B) a spory - není vhodný ke sterilizaci nástrojů • Frakcionovaná sterilizace - varem při 100°C po dobu 30 min. - opakování 3x v intervalu 16- 24 hod. - za snížené teploty rezistentní bakteriální spory vyklíčí a následná var jejich vegetativní formy ničí - provádí se v Kochových hrncích nebo Arnoldových sterilizátorech proudem nasycené vodní páry - sterilizace párou o teplotě 80 - 100°C – k dezinfekci papíru nebo textilu • Var pod tlakem - působení přehřáté vodní páry - protože bod varu závisí na tlaku , je při přetlaku 200kPa (2 atmosféry) teplota nasycené páry vroucí vody 121°C, při přetlaku 300 kPa 134°C - těchto tlaků se dosahuje v tlakových sterilizátorech nebo autoklávech - autokláv= silnostěnná kovová tlaková nádoba, - přehřátá vodní pára se ve stolních typech vyvíjí vlastním vyhříváním, do větších typů z vyvíječe exposiční doba- 20 min. při teplotě 121°C a 10 min při 134 °C - pro denaturaci prionů – nemusí byt účinná ani hodina při 134°C - parametry autoklávovaní je nutno přizpůsobit termostabilitě sterilizovaných materiálů • Horkým vzduchem - sterilizace v horkovzdušných sterilizátorech = přistroje s termostatickým ohřevem do 200°C a nuceným oběhem vzduchu - protože je suché teplo méně účinné než vlhké, používá se oproti autoklávům vyšší teploty po delší dobu (160 - 180°C, 1 – 2hod ...bakteriální spory by měli být zničeny za 15min při 180°C) - pro sterilizaci suchých předmětů - při 160°C znehodnoceny papír, textil, některé nástroje • Horký olej - ponořením do olejové lázně zahřáté na 200°C - zubařské nástroje • Plamen - žíhání bakteriologických kliček - spálení ve spalovně – způsob dekontaminace materiálů určených k likvidaci • Filtrace - mechanické oddělení částic z termolabilních kapalin nebo plynů - podle požadovaného stupně čistoty a povahy filtrovaného média se používá řada filtrů, lišících se materiálem a velikosti pórů - pro filtraci kapalin- o keramické filtry (Berkefeldovy, Mandlerovy, Chamberlandovy) o asbestové o skleněné o koloidové - filtry s různou velikosti pórů PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 31. 3 - zachytává částice bakterií a velkých virů (většina virů filtrem prochází (filtrabilní viry) • Ultrafialové záření - vlnové délky 210 – 330nm – baktericidní účinky - účinnost klesá se čtvercem vzdálenosti - poškozuje zrak - v praxi hlavně germicidní zářivky(do vzdálenosti 0,5 m) – k dodatkové dekontaminaci místnosti(sterilní provozy, pitevny, laboratorě) • Ionisující záření -v praxi záření gama -proniká většinou materiálu, nezahřívá je a nezanechává residua - sterilizace nástrojů ve výrobě - doporučená dávka – 25kGy – neničí spolehlivě některé viry (HIV, hepatitidy) • Nízkoteplotná plasma - v komorách , kt. jsou nejprve evakuovány a posléze naplněny parami peroxidu vodíku nebo peroctové kyseliny - vysokofrekvenční elektromagnetické pole páry převede na reaktivní radikály, kt. při teplotě 50°C během 20 min.sterilizují většinu suchých materiálů s výjimkou termolabilních a porézních • Mikrovlny - elektromagnetické vlnění o f. MHz az GHz- vytvářejí teplo uvnitř mikrobiální buňky - podobný účinek jako ve vodě - nedají se použít na elektricky vodivé materiály • Osmotický tlak - změnou osm.tlaku, vyvolanou zvýšenou koncentrací anorganických solí, je možno potlačit růst některých mikroorg. - při konzervaci potravin, v diferenciální diagnostike bakterií - tolerují to některé plísně, kvasinky, bakterie Chemické metody - účinnost závisí na koncentraci prostředku, době působení a teplotě (nepřesahuje 100°C) - k dezinfekci a sterilizaci termolabilních látek včetně živých tkání • Anorganické kyseliny a zásady - HCl, HNO 3 , H 2 SO 4 , - při pH menším než 4 (c. = 2%)účinné na bakterie a jejich spory – usmrcují je koagulací bílkovin - Poškozují sklo, porcelán i dezinfikované předměty - NaOH,KOH, Ca(OH) 2 , CaO – účinné na baktérie, spory a viry – při ph větším než 9 denaturují bílkoviny a zmýdelňují tuky - jsou žíravé – poškozují většinu kovů - vhodné k dezinfekci skla, staveb, zasypávání mrtvol • Organické kyseliny - kys. octová, mléčná, propiónová, benzoová, sorbová, salicylová, citronová - slabé antibakteriální a protiplísňové účinky PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 31. 4 - v potravinářství- konzervační prostředky - k výplachům, obkladům • Manganistan draselný - v roztoku o c. 0,1% (růžový) na bakterie - antiseptikum k omývání a výplachům kůže, ran a sliznic - v c. 2% účinný i na některé viry • Peroxid vodíku - 30% roztok – leptavý - 3% - antiseptikum kůže, ran, na výplachy - uvolňuje kyslík ve stavu zrodu a zabíjí tak viry, spory, bakterie • Peroxokyseliny o peroxomravenčí – dobré antibakteriální a fungicidní účinky,nestálá o peroxooctová- nejúčinnější, nejčastěji používanou z této skupiny látek, dezinfekční i sterilizační účinky -pod názvem Persteril ( 36-40%) -v c. 0,5% ničí do 1 minuty bakterie včetně mykobakterií, spory a viry -nepůsobí na vajíčka protozoi a cysty parazitů -sterilizace nástrojů, sanitační úklid -nesmí se používat jako antiseptiku -sterilizace uzavřených nádob a tekutých bakteriologických půd „za studena“ -nevýhodou je katalytivký rozklad za přítomnosti kovu • Ozon - účinný ale labilní - dezinfekce vody • Halogeny a jejich sloučeniny - hlavně chlor, jod a jejich sloučeniny - působí uvolňováním volních halogenů (aktivní chlor) - dobře účinné na všechny bakterie, kvasinky, plísně - méně na mykobakterie, spóry a některé viry - plynní chlor- k dezinfekci pitné vody a dekontaminaci odpadních vod, velmi toxický • Chlornany - k hrubé dezinfekci - chlorové vápno – 10% - chlorové vápenné mléko - roztok chlornanu sodného – podstatou komerčné řady SAVO • Chloraminy - uvolňují aktivní chlor - účinnější, méně rozkládány organickými látkami - nejběžnější – chloramin B - 2% - na bakterie - 5% - na mykobakterie, spóry a viry - účinek se zvyšuje přidáním amonných solí - aktivací PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 31. 5 • Dichlorisokyanurát sodný - 0,5 – 1% účinnější než chlornany a chloraminy • Jod - v roztocích nebo kovalentně vázany na organické nosiče ( jodofory) - nerozpustný v pitné vodě - dobře rozpustný v jodidu draselnom ta vzniku polyjodidů (Lugolův roztok) →slabé dezinfekční účinky výplach sliznic - jodová tinktura – rozpuštěný jodu a jodidu draselného v etanole – působí dobře na všchny mikroorg. včetně spor, mykobakterií, plísní a prvoků - nejspolehlivější antiseptikum kůže a okolí ran • Alkoholy - denaturace bílkovin nebo dehydratace - nepůsobí na spory a většinu virů - účinnost stoupá s délkou řetězce - koncentrovaný etanol mikroby konservuje , v c. 70% - působí dobře na bakterie - n-propanol a isopropanol- působí i na některé viry - součástí dezinfekce rukou - zesilují účinky aldehydů, oxidačních činidel a kyselin • Ethylenoxid - za normální teploty plynný, toxický a velmi reaktivní , ve směsi se vzduchem snadno exploduje - výborné sterilizační účinkyna všechny mikroby včetně spor - vhodný ke sterilizaci nástrojů a pomůcek z plastové fólie ( prochází plastem bez poškození) • Aldehydy - Formaldehyd – plyn rozpouštějící se ve vodě na 40% - formalin - ničí vegetativní formy bakterií, spóry, mykobakterie, plísně a viry - k hrubé dezinfekci v 2 -20% - v uzavřených nádobách a ve směsi s vodní párou při 60 - 80°C ke sterilizaci nástrojů a choulostivých předmětů - nevýhoda: korosivní účinky, dráždivý zápach, toxický a karcinogenní - glutaraldehyd- méně dráždivá olejovitá kapalina, působí podobně jako formaldehyd - v 2% alkalickém roztoku k dezinfekci choulostivých předmětů , které je třeba před použitím opláchnout - působením aldehydů nejsou porušeny antigenní vlastnosti virů a toxinů - k přípravě vakcín • Deriváty fenolu - Fenol (kys. karbolová) – klasické antiseptikum - Působí inaktivaci enzymů a koagulaci proteinů , je toxický a dezinfekční účinnost malá - konservans farmaceutických preparátů • Barviva - akridinová (rivanol, trypaflavin) - trifenylmetanova (krystalová a genciánová violeť, briliantová a malachitová zeleň) PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 31. 6 - k dezinfekci kůže a sliznic - působí dobře na bakterie, kvasinky a prvoky • Povrchově aktivní látky - detergenty = tensidy - působí mechanismem snižování povrchového napětí, změn povrchových struktur bakteriálních buněk , inaktivace specifických enzymů a koagulace bilkovin - bakteriostatický účinek - působí na G+ bakterie a plísně - nepůsobí na mykobakteria , spory a viry • Anion-aktivní sloučeniny - různe druhy mýdel • Amfotensidy - baktericidní a fungicidní účinek • Neionogenní tensidy - přidávají si do tween- albuminové půdy pro kultivaci mykobakterií • Kation-aktivní sloučeniny - kvarterní amonné báze - působí dobře na G+ bakterie a plísně - špatně na G- bakterie - neúčinné na mykobakteria , spory a viry • Azid sodný - v malých c. účinný na G+ i G- bakterie, kvasinky a plísně - toxický, k dezinfekci a konzervaci biologických materiálů včetně diag. preparátů a některých léčiv • Rtuť a její sloučeniny - Sublimát (chlorid rtuťnatý), oxycyanát – toxické , dezinfekční prostředky , málo účinné , již se nepoužívají - Fenylboritan rtuťnatý – bakteriostaticky (komerčný Famosept) – antiseptikum k výplachům dutin • Stříbro - k vykapávaní spojivkových vaků novorozenců - prevence gonorrhhoeické ophthalmia neonatorum ( credeisace) • Cín - Organociničité sloučeniny působí dobře na bakterie včetně mykobakterií a spory - jsou fungicidní , dobrý účinek na dřevokazné houby - mají residuální účinek - toxické, používají se k ochraně stavebních konstrukcí v zemědělství • měď - její sloučeniny mají baktericidní a fungicidní účinek, jsou však toxické - hlavně při ochraně rostlin (postřiky z modré skalice) PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 32. 1 32. Metody sterilizace a kontrola sterilizačních procesů Dezinfekce a sterilizace: - ve zdravotnických zařízeních jsou úkony, které provádějí proškolení zdravotničtí pracovníci - používané postupy a prostředky podléhají schválení hlavního hygienika ČR a jsou upraveny příslušnou hygienickou legislativou -podle stupně odstranění mikroorganizmů z předmětu nebo prostředí se rozlišují následující postupy:  mechanická očista;  dezinfekce;  vyšší stupeň dezinfekce;  sterilizace Mechanická očista – sanitace  Soubor postupů, které mechanicky odstraňují nečistoty a snižují počet mikroorganismů  Úklid se provádí denně na vlhko.  Dle typu pracoviště se používají běžné detergenty nebo detergenty s dezinfekčním prostředkem (dle hygienicko-epidemiologického režimu konkrétního pracoviště), čisticí prostředky, případně čisticí prostředky s dezinfekčním účinkem, aplikují se buď ručně nebo pomocí mycích a čistících strojů, tlakových pistolí, ultrazvukových přístrojů, apod.  Všechny pomůcky a přístroje se udržují v čistotě.  Úklidové pomůcky se po použití dezinfikují a usuší.  Čistící stroje a jiná zařízení se používají podle návodu výrobce. Dezinfekce  Zničení patogenních mikroorganismů v daném prostředí.  Soubor opatření ke zneškodňování mikroorganismů pomoci fyzikálních (teplota nad 90 °C), chemických (použití chemických látek) nebo kombinovaných postupů (teplota nad 60 °C + použití chemických látek), které mají přerušit cestu nákazy od zdroje k vnímavému jedinci. PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 32. 2  Profylaktická, preventivní: provádí se i v době, kdy se infekční onemocnění nevyskytuje, je součástí komplexních hygienických opatření, (př. chlorace vody, pasterizace mléka, úprava odpadních vod).  Represivní, ohnisková: v ohnisku nákazy; je průběžná nebo konečná, je zaměřená na zneškodňování choroboplodných zárodků v ohnisku s cílem přerušit další šíření infekce. Výběr dezinfekce je důležitý, je nutné brát zřetel na jednotlivé druhy mikroorganismů: 1. citlivost jednotlivých mikroorganismů; 2. účinek; 3. vliv teploty a pH; 4. prostředek musí působit na celý povrch a nesmí alergizovat; 5. musí být ekonomicky výhodný Fyzikální dezinfekce  var za atmosférického tlaku po dobu nejméně 30 minut;  var v přetlakových nádobách po dobu nejméně 20 minut;  dezinfekce v mycích, pracích a parních přístrojích při teplotě vyšší než 90 °C;  UV záření o vlnové délce 253,7– 264 nm;  filtrace, žíhání, spalování Chemická dezinfekce Podle způsobu použití:  dezinfekce povrchů;  dezinfekce nástrojů;  dezinfekce rukou;  speciální dezinfekce Podle účinných látek:  Chlorové sloučeniny (př. chlornan sodný – SAVO®),  jodové sloučeniny (př. JODISOL®),  aldehydy,  kvartérní amoniové sloučeniny (KAS),  deriváty fenolu, alkoholy, PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 32. 3  sloučeniny peroxidu (mají charakter oxidační i redukční),  aminy,  tenzidy – chemické povrchově aktivní sloučeniny (nejvýznamnější jsou amonné kvartérní sloučeniny),  hydroxidy (př. hydroxid sodný),  organické kyseliny Podle spektra účinnosti  baktericidní,  virucidní,  fungicidní,  tuberkulocidní,  sporucidní Podle místa použití  Zdravotnictví,  potravinářství, aj. Fyzikálně chemická dezinfekce  Paroformaldehydová komora (dezinfekce textilu, výrobků z umělých hmot, vlny, kůže a kožešin při teplotě 45 až 75 °C).  Prací, mycí a čistící stroje (dezinfekce probíhá při teplotě do 60 °C s přísadou chemických dezinfekčních přípravků) Zásady chemické dezinfekce  Dezinfekční přípravky a postupy, které nepoškozují dezinfikovaný materiál a jsou netoxické.  Zabránění vzniku selekce, případně rezistence mikrobů vůči přípravku – střídají se dezinfekční přípravky s různými aktivními složkami.  Při přípravě dezinfekčních roztoků se vychází z toho, že jejich názvy jsou tzv. „slovní známky“ a přípravky se považují za 100%. [1] PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 32. 4  Dezinfekční roztoky se připravují rozpuštěním odměřeného/odváženého dezinfekčního prostředku ve vodě.  Frekvence výměny dezinfekčních roztoků je dána doporučením výrobce (nejčastěji se provádí každou směnu, podle stupně zatížení biologickým materiálem i častěji). Fyzikálně chemická dezinfekce  Zlepšení účinnosti některých dezinfekčních roztoků lze dosáhnout zvýšením teploty (fenolové přípravky a kvartérní amoniové sloučeniny na 50 až 60 °C, jodové přípravky na 35 °C).  Aldehydové, chlorové přípravky a peroxisloučeniny se ředí studenou vodou.  Dezinfekce se provádí omýváním, otíráním, ponořením, postřikem, formou pěny nebo aerosolem.  Důležité je dodržet koncentraci a dobu působení dezinfekčního přípravku předepsané v návodu.  Předměty a povrchy kontaminované biologickým materiálem se dezinfikují přípravkem s virucidním účinkem.  Při použití dezinfekčních přípravků s mycími a čistícími vlastnostmi lze spojit etapu čištění a dezinfekce. (Postup: dezinfekce – mechanická očista; dezinfekce.)  Předměty, které přicházejí do styku s potravinami, se musí po dezinfekci důkladně opláchnout pitnou vodou.  Dodržování zásad ochrany zdraví a bezpečnosti při práci a používání osobních ochranných pomůcek, pracovníci jsou poučeni o zásadách první pomoci.  K ověření účinnosti dezinfekce používáme mikrobiologické metody (stěry a otisky). Vyšší stupeň dezinfekce  Zaručuje usmrcení všech mikroorganismů, ale ne cyst prvoků, vajíček helmintů etc..  Dvoustupňová dezinfekce:  Postupy, které zaručují usmrcení bakterií, virů, mikroskopických hub a některých bakteriálních spor, nezaručují však usmrcení ostatních mikroorganismů (vysoce rezistentních spor) a vývojových stádií zdravotně významných protozoí, helmintů a jejich vajíček.  Dezinfekční roztoky pro vyšší stupeň dezinfekce se musí ukládat do uzavřených nádob.  Frekvence výměny dezinfekčních roztoků je uvedena v návodu k použití jednotlivých přípravků. PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 32. 5  Pomůcky podrobené vyššímu stupni dezinfekce jsou určeny k okamžitému použití nebo se krátkodobě skladují kryté sterilní rouškou v uzavřených kazetách a skříních (volně uložený – v kazetách 24 hodin, chráněný – v kazetách a uzavřených skříních 48 hodin).  Po použití se předměty očistí (strojně nebo ručně) a osuší.  Při kontaminaci biologickým materiálem – dezinfekce přípravkem s virucidním účinkem, poté, do roztoků určených k vyššímu stupni dezinfekce se ponoří suché předměty tak, aby byly naplněny všechny duté části bez vzduchových bublin.  Po vyšším stupni dezinfekce je nutný oplach předmětů sterilní vodou, k odstranění reziduí dezinfekčních prostředků, sterilní osušení a dále je nutné nakládat s předměty, jako se sterilním instrumentáriem. Sterilizace Předsterilizační příprava  dekontaminace či dezinfekce,  mechanická očista,  oplach pitnou vodou, nebo vodou destilovanou  osušení,  zabalení o Fyzikální sterilizace Sterilizace vlhkým teplem  V parních přístrojích, které musí být až na výjimky vybaveny pravidelně obměňovaným antibakteriálním filtrem,  sterilizace předmětů z kovu, skla, porcelánu, keramiky, textilu, gumy, plastů, léčivých přípravků a dalších materiálů odolných parametrům,  pro inaktivaci prionů se používá teplota 134 °C po dobu 60 minut,  pro některé nebalené předměty určené k okamžitému použití se používá teplota 134 °C po dobu 4 minut, nepoužívá se na centrálních sterilizacích a sterilizačních centrech.  pro léčivé přípravky se používají parametry individuálně dle standardních operačních a technologických postupů PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 32. 6 Sterilizace horkým vzduchem  V přístrojích s nucenou cirkulací vzduchu,  sterilizace předmětů z kovu, skla, porcelánu, keramiky, kameniny a léčivých přípravků při parametrech,  pro léčivé přípravky se používají parametry individuálně dle standardních operačních a technologických postupů. Sterilizace plazmou  Vzniká ve vysokofrekvenčním elektromagnetickém poli nebo vysokonapěťovým výbojem, které ve vysokém vakuu působením na páry peroxidu vodíku, nebo jiné chemické látky uvolňují volné radikály kyslíku; účinek je dán nízkoteplotní plazmou plynu (peroxid vodíku, kyselina peroctová) při teplotě 50 °C a dalších stanovených parametrech o Chemická sterilizace  Materiál, který nelze sterilizovat fyzikálními způsoby,  sterilizačním médiem jsou plyny předepsaného složení a koncentrace. Sterilizace formaldehydem  Působení plynné směsi formaldehydu s vodní párou při teplotě 60–80 °C a podtlaku při parametrech stanovených výrobcem,  zavzdušnění komory na konci cyklu probíhá přes antibakteriální filtr Sterilizace ethylenoxidem  Plynná směs ethylenoxidu při teplotě 37–55 °C při parametrech stanovených výrobcem Zásady sterilizace  Způsoby sterilizace volíme dle doporučení výrobce jednotlivých nástrojů / pomůcek / předmětů,  nástroje / pomůcky / předměty se sterilizují důkladně omyté a osušené,  materiály se vkládají do vhodných obalů a do sterilizační komory se ukládají tak, aby se umožnilo co nejsnazší pronikání sterilizačního média, PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 32. 7  obaly s vysterilizovaným materiálem se označí datem sterilizace, exspirace, kódem pracovníka (odpovídajícího za neporušenost obalu) a kontrolu procesového testu,  každý sterilizační cyklus se dokumentuje: datum, druh sterilizovaného materiálu, jméno a podpis osoby, která sterilizaci provedla,  vysterilizovaný materiál v obalu se převáží v uzavřených přepravkách tak, aby byly chráněny před poškozením a znečištěním,  vysterilizovaný materiál se skladuje:  volně s krátkou exspirační dobou,  chráněn v uzavřené skříni, zásuvce nebo v dalším obalu s delší exspirací,  pro dlouhodobou exspiraci se použije dvojitý obal, který se po sterilizaci vkládá do uzavíratelného skladovacího obalu (např. skříně),  pro lepší možnost manipulace se sterilním materiálem při jeho používání je možné ve výjimečných případech použít podávkové kleště, které jsou uchovávány „na sucho“ v toulci, kdy výměna podávek a toulce musí být prováděna minimálně 1x 8 hodin Kontrola účinnosti sterilizačních přístrojů Biologické indikátory  Nové přístroje, opravené přístroje před uvedením do provozu,  při jakékoliv pochybnosti o sterilizační účinnosti,  pravidelná kontrola:  1x za měsíc: sterilizátory ve sterilizačních centrech, centrálních sterilizací, operačních sálech, operačních traktech nebo na pracovištích, které vykonávají sterilizaci pro jiná pracoviště,  u sterilizátorů ne starších než 10 let nejpozději po 200 sterilizačních cyklech, nejméně však 1x za rok,  u sterilizátorů starších 10 let nejpozději po 100 sterilizačních cyklech, nejméně však 2x za rok Nebiologické testy (sledování parametrů sterilizace obsluhou)  Chemický test procesový:  označuje se každý jednotkový obal,  slouží k rozlišení materiálu připraveného ke sterilizaci a již sterilizovaného, reaguje barevnou změnou již jen na přítomnost sterilizačního média,  chemické testy: určené k průkazu splnění všech parametrů cyklu; vkládají se do míst, kam sterilizační médium nejhůře proniká. PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 33. 1 33. PRAVIDLA BEZPEČNOSTI PRÁCE V PROSTŘEDÍ RIZIKA PROFESIONÁLNÍCH INFEKCÍ - pracoviště (laboratoř, oddělení, ústav) není přístupné osobám, které zde nejsou zaměstnány - vstup na pracoviště je jiným osobám umožněn pouze v doprovodu zaměstnance pracoviště a do infekční části jen tehdy, když se nepracuje s infekčním materiálem a byla provedena celková dezinfekce. Děti nemají přístup na pracoviště vůbec! - vzhledem k možnosti laboratorní nákazy nesmí v mikrobiologických laboratořích pracovat gravidní ženy - v případě školních laboratoří je vstup povolen studentům, kteří zde mají praktické vyučování a za dodržení všech bezpečnostních zásad je zodpovědný vyučující; i když jsou doporučeny modelové pokusy s nepatogenními nebo mírně virulentními mikroorganizmy, tak je bezpodmínečně nutné dodržovat zásady bezpečné práce - šatny, místnost pro jídlo a odpočinek, část administrativní (pracovny, knihovna) jsou odděleny hygienickou smyčkou od místností, kde se pracuje s infekčním materiálem; pracovní přestávka je stanovena interním předpisem - v případě, že není na pracovišti hygienická smyčka, tak po příchodu do zaměstnání se pracovníci převléknou do pracovních oděvů, používaných v neinfekčních částech laboratorního komplexu - pro práci s infekčním materiálem jsou vyhrazeny ochranné pracovní oděvy a pomůcky, které jsou uloženy u vchodu do laboratoří - plášť je označen zřetelným štítkem s nápisem „INFEKCE“ a v tomto ochranném oděvu nesmí pracovníci opustit laboratoř - po skončení práce v laboratoři se při odchodu z infekčního prostředí pracovníci převléknou do pláště používaného v neinfekčních částech pracoviště - ve všech prostorách laboratoře musí být udržován pořádek a čistota, je zde zakázáno jíst, pít nebo kouřit; případné kontaminované přístroje, laboratorní oděv atd. je nutno bezprostředně dekontaminovat - úklid se provádí denně, případně podle potřeby i několikrát za den, ale vždy za použití dezinfekčních prostředků - ochranný oděv určený pro práci v mikrobiologické laboratoři (košile, kalhoty, plášť, pracovní obuv aj.) se nesmí používat mimo toto pracoviště, je nepřípustné nosit jej do veřejných dopravních prostředků, obchodů, domů apod.; nesmí se také prát s ostatním prádlem a před praním je nutno takové oděvy dezinfikovat - jakákoliv práce s mikroorganismy či jejich produkty se provádí pouze v bezpečnostních laminárních flow-boxech (biohazard třídy 3); pokud je nutná práce mimo box, např. na stole, tak je nezbytným vybavením obličejová rouška a latexové rukavice - při práci v laboratoři musí pracovníci dbát zvýšené opatrnosti a důsledně dodržovat „mikrobiologickou čistotu“ pracovního oděvu, rukou, pracovního stolu, skla, podlahy i ostatního laboratorního zařízení, které tvoří součást laboratorního prostředí - na pracovní ploše musí být v dostatečném objemu zásoba dezinfekčního prostředku pro momentální použití v případě naléhavé dekontaminace (rozlití, vysypání materiálu); je nutno správně volit účinnost dezinfekčních prostředků PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 33. 2 - žádné pracovní kroky se neprovádí unáhleně, v případě pochybností se postup konzultuje se „zkušenějším“ kolegou - v laboratoři je třeba se vyhnout jakýmkoliv pohybům rukou k ústům, očím apod., jídlo, pití, kouření, olizování nálepek, pipetování ústy aj. jsou naprosto nepřípustné! (kontaminované ruce či cokoliv jiného je schopno přenést infekci do tělních otvorů) - ruce je třeba dezinfikovat a důkladně umývat mýdlem a teplou vodou při ukončení každé práce (umyvadla vybavená pákovou loketní baterií!) a zvláště důkladně před jídlem, nehty musí být udržovány krátké; po ukončení jednotlivých pracovních kroků v laboratoři a na konci pracovní doby se musí ruce umýt a vydezinfikovat - osobní doplňky výbavy pracovníků (hodinky, náramky, prsteny, velké náušnice apod.) jsou v laboratořích zakázány vzhledem k jejich možné kontaminaci infekčním materiálem a problematické následné dekontaminaci - v chladničkách v laboratorním komplexu nesmí být uchovávány žádné soukromé poživatiny (potraviny, nápoje - k tomu slouží lednice v denní místnosti) - při práci se zvláště patogenními mikroorganizmy nebo s materiálem, který je může obsahovat, je bezpodmínečně nutné používat speciální ochranné pomůcky: např. obličejová maska, gumové rukavice, ochranný štít nebo brýle apod. a dodržovat všechny bezpečnostní předpisy i standardní operační postupy - vyžaduje-li to charakter práce, jsou pracovníci preventivně očkováni (tento krok však neznamená obecné snížení úrovně bezpečnosti!) - práce s pokusnými zvířaty se řídí speciálními předpisy - poranění, kožní onemocnění, astma, bronchitida, záněty oka a jiné poškození mohou znamenat pro laboratorního pracovníka větší riziko infekce – v těchto případech je nutná konzultace vedoucího pracoviště (laboratoře) se závodním lékařem, případně ještě s lékařem - specialistou a následní písemné povolení laboratorní práce v možném riziku profesionální infekce pro tohoto pracovníka - úrazy při zaměstnání, které nemají za následek pracovní neschopnost, se zapisují do knihy úrazů; o úrazu, majícím za následek pracovní neschopnost delší než 1 den je třeba sepsat záznam o úrazu - zaměstnanci jsou povinni hlásit vedoucímu okamžitě všechny závady, které ohrožují bezpečnost práce, úrazy, nehody v laboratoři, exploze, požáry a pod. a o této skutečnosti se provede záznam; je-li to možné, tak laboratoř likviduje případné nehody vlastní - laboratorní trakt (laboratoř) musí být vybavena skřínkou s preparáty pro poskytnutí první pomoci - všechny mikroorganizmy se považují za potenciálně patogenní, jakýkoliv infekční materiál musí být jednoznačně označený, aby se zabránilo omylu - pracoviště musí vést evidenci nebezpečných biologických látek (např. vlastní databáze nebo písemný záznam v kartotéce) - zpracovávaný materiál je obvykle známý z hlediska jeho možné nebezpečnosti pro člověka či životní prostředí – v mikrobiologických laboratořích se jedná o kultury mikroorganizmů na pevných nebo v tekutých médiích (Petriho miska, zkumavka); v případě, že se pracuje s neznámým materiálem, tak jej vždy považujeme za patogenní - veškeré manipulace s infekčním materiálem se provádí výlučně nástroji: kličkami, jehlami, injekčními jehlami a stříkačkami, pinzetami, pipetami a pod.; pipetování ústy je absolutně nepřípustné! PRAKTICKÁ ZKOUŠKA – 33. 3 - kovové kličky a pinzety se před i po použití žíhají do červeného žáru, při žíhání kliček se zbytkem kultury je třeba zabránit prskání a stříkání materiálu osušením kličky na okraji plamene; pokud používáme jednorázové plastové pomůcky, tak ty po použití vkládáme do dezinfekčního roztoku a autoklávujeme - onemocní-li zaměstnanec takovéto laboratoře, tak musí lékaře upozornit, že pracuje v infekčním prostředí s možnými původci onemocnění přenosných na člověka Pravidla pro zacházení s nebezpečnou biologickou látkou - i podmíněně patogenní, či tzv. „nepatogenní“ mikroorganizmy ve vysokých koncentracích vystupují jako striktní patogeny - přímému nebezpečí infekce je laboratorní pracovník vystaven při havarijních situacích, jako je rozbití nádobek s infekčním materiálem, rozbití či rozprášení tohoto materiálu nebo dokonce čistých mikrobiálních kultur Tvorba aerosolů - aerosoly vznikají při některých rutinních manipulacích a musí být minimalizovány pečlivou laboratorní technikou - k infekci může dojít zpravidla cestou respiračního aparátu a infekci způsobí i menší než obvyklé dávky - kapénková infekce = jakýkoliv náraz na povrch kapaliny má za následek vznik a uvolnění kapének, které se rychle odpařují (ulpí na rukou, ochranném oděvu, pomůckách pracovních plochách apod) - kapénky vznikají při prasknutí bublin tekutých médií, u hrdla lahví, zkumavek, hrotů pipet, jehel, injekčních stříkaček, na očkovacích kličkách aj.; smícháním vzduchu s tekutinou při protřepávání zkumavek nebo při násilném vystříknutí obsahu pipet či injekčních stříkaček; při padání kapek na hladký povrch; při vytažení zátky ze zkumavky s tekutým médiem; při neopatrném zacházení s očkovací kličkou při přípravě mikroskopického preparátu a při očkování z tekutých médií; při ponoření rozpálené kličky do bujonu nebo po přiložení na povrch agaru; při odstřeďování a při homogenizaci bakteriální suspenze či hrubém přelévání tekutých médií - infekce zvířením sušených materiálů a prachů, např. při neodborném otevírání ampulí s vysušenými kulturami, ze zaschlých škraloupů kultur na zátkách apod