1. Metabolická acidosa, její příčiny a důsledky ________________________________________________________________________________________________________  acidobazická rovnováha (ABR) - dynamická rovnováha kyselin a zásad uvnitř organismu, tj. stálý poměr mezi jejich tvorbou a odbouráváním, respektive vylučováním - nezbytná pro udržení homeostázy organismu - v klidovém stavu dochází k větší produkci kyselých látek, které jsou ovšem neutralizovány systémem pufrů a vylučovány z těla pryč - fyziologické pH extracelulární tekutiny je 7,36-7,44 - regulace kyselosti prostředí probíhá jednak pufry a jednak orgány (metabolická regulace) - ABR není směna H + a OH - iontů, ale změna koncentrace hlavních iontů, změna pH je až druhotná v důsledku změny v HCO 3 - /pCO 2  v těle je bikarbonátový pufr, jakožto lapač přebytečných vodíkových iontů  na rozdíl od ostatních systémů je hydrogenuhličitanový pufr otevřený systém, můžeme jej doplňovat a odčerpávat, upravovat složení – přesnější regulace vnitřního prostředí  metabolicky je pufr ovlivněn játry (amoniak, močovina, glutamin), ledvinami (vylučování nebo zadržování bikarbonátu případně amoniaku) a respiračně potom plícemi (vylučování CO 2 ) snižuje množství H 2 CO 3 - Henderson-Hasselbachova rovnice pH = pKa + log [HCO 3 - ]/[H 2 CO 3 ] pH = pKa + log [HCO 3 - ]/α . pCO 2 pKa = 6,1 [HCO 3 - ] = 24 mmol/l [H 2 CO 3 ] = 1,2 mmol/l α = 0,224 mmol/l . kPa pCO 2 = 5,3 kPa  standardní bikarbonát - koncentrace bikarbonátu v plazmě nasycené kyslíkem, při teplotě 37°C a při pCO 2 =40 torr (5,32kPa), tj. při vyloučení respirační poruchy - informuje nás pouze o metabolické složce ABR - fyziologické rozmezí = 21-25 mmol/l - aktuální bikarbonát je pak koncentrace bikarbonátů v 1l krve nasycené kyslíkem při aktuálně naměřeném pCO 2 (fyziologicky 21-25 mmol/l)  metabolické poruchy ABR - stavy, při nichž se významně mění koncentrace hydrogenuhličitanů - současně se vždy změní i koncentrace jednoho či více hlavních iontů, neboť hydrogenuhličitanový aniont musí být v rovnováze s ostatními ionty tělesných tekutin - jedná se o acidosy nebo alkalosy - acidemie je odchylka pH od normy X acidosa je přebytek kyselin/nedostatek bazí - kompenzace je vzájemná – metabolická porucha se kompenzuje respirací a naopak - korekce pak probíhá tak, že metabolická porucha se koriguje metabolicky - rozvoj kompenzačních mechanismů – respirace za 12-24 hodin, ledviny asi za 5 dní Metabolická acidosa  stav, kdy dojde k poklesu koncentrace standardních hydrogenuhličitanů pod referenční hodnoty  může se tak stát v důsledku - hromadění některého aniontu, který hydrogenuhličitany z mineralogramu „vytlačí“ - ztrát hydrogenuhličitanů (doprovázených kationtem, nejspíše tedy jako hydrogenuhličitanu sodného) - ztrát některého kationtu, nejspíše sodíku, jež jsou kompenzovány poklesem koncentrace hydrogenuhličitanů (vzácněji)  metabolická acidosa z hromadění aniontů - laktátová acidosa  kyselina mléčná v prostředí, jehož pH je blízké hodnotě 7,4 prakticky zcela disociuje na laktátový aniont  koncentrace laktátu významně stoupá zejména při tkáňové hypoxii - ketoacidosa  z hlediska ABR hromadění β-hydroxybutyrátu a acetacetátu  rozvíjí se pokud glukosa nepostačuje jako zdroj energie a ve zvýšené míře se odbourávají tuky – při hladovění, DM1, extrémní zátěži apod. - renální acidosa  při selhání ledvin se typicky rozvíjí metabolická acidosa  schází se několik poruch, které na ABR působí stejným směrem - hromadění síranů - hromadění fosfátů - hyperurikémie (kyselina močová se za pH blízkého fyziologickému chová jako aniont) - při zachování diurézy a tubulárním porušení selhává reabsorpce hydrogenuhličitanů - ztrácí se acidifikace moči - acidosa při některých otravách  intoxikace ethanolem – metabolizuje se na acetát - kromě nadprodukce acetátu hraje významnou úlohu produkce NADH při odbourávání ethanolu - vysoká koncentrace redukčních ekvivalentů inhibuje odbourávání laktátu, který se hromadí - podobně NADH inhibuje glykolýzu, což v konečném důsledku vede ke stimulaci ketogeneze a hromadění β-hydroxybutyrátu a acetacetátu  intoxikace metanolem – metanol se metabolizuje na formiát  intoxikace etylenglykolem – metabolizuje se na oxalát  metabolická acidosa ze ztrát hydrogenuhličitanů - nejčastěji důsledkem ztrát hydrogenuhličitanů z GIT  duodenální a pankreatická šťáva jsou bohaté na hydrogenuhličitany, které mají neutralizovat tráveninu přicházející z žaludku  normálně se hydrogenuhličitany resorbují zpět v tenkém střevu – při některých onemocněních GIT (průjmy, syndromy krátkého střeva) může být resorpce tak nízká, že koncentrace hydrogenuhličitanů v krvi významně klesne - jinou příčinou mohou být ztráty hydrogenuhličitanů ledvinami (renální tubulární acidosa, nežádoucí účinek diuretické léčby apod.) - do skupiny metabolických acidos ze ztrát hydrogenuhličitanů můžeme také zařadit tzv. diluční acidosu  dochází k ní při rychlém podání infuzí  hydrogenuhličitany se v krvi naředí rychleji, než se stačí metabolismem doplňovat  pochody, které udržují parciální tlak oxidu uhličitého, jsou mnohem rychlejší, takže pCO 2 se nemění  terapie - pokud někoho rychle zalkalizujeme, vzniká respirační tíseň - terapie je podávání bikarbonátů  NaHCO 3  soli organických kyselin (organické kyseliny se metabolizují v Krebsově cyklu na bikarbonát) - Ringerův roztok s laktátem – laktát se metabolizuje na bikarbonát (Na + , Cl - , K + , Ca 2+ )  vzorce: β-hydroxybutyrát, acetoacetát, aceton, laktát, pyruvát (aceton vztah k ABR nemá – nedisociuje) 2. Metabolická alkalosa, její příčiny a důsledky ________________________________________________________________________________________________________  poruchy ABR - alkalemie je odchylka pH od normy X alkalosa je přebytek bazí nebo nedostatek kyselin - alkalémie vede k poklesu vápenatých iontů a tak vzestupu neuromuskulární dráždivosti, dále k poklesu draslíku a poruchám srdečního rytmu - dále tu dochází k posunu disociační křivky Hb – tkáňová hypoxie - alkalosa je horší než acidosa – horší kompenzační mechanismy  metabolická alkalosa je stav, kdy dojde k vzestupu koncentrace standardních hydrogenuhličitanů nad referenční hodnoty  může se tak stát v důsledku - ztrát některého aniontu  obvykle chloridy nebo proteiny, které jsou v ionogramu kompenzovány doplněním hydrogenuhličitanů - vzestupu koncentrace některého kationtu  nejčastěji sodík  alkalosa ze ztrát aniontů - hypochloremická alkalosa  při chronickém zvracení, při němž se ztrácí velké množství chloridového aniontu vyzvracenou žaludeční šťávou  jako důsledek podávání diuretik - hypoproteinemie  bílkoviny se chovají jako polyanionty, takže pokles jejich koncentrace kompenzuje doplněním hydrogenuhličitanů  např. selhání proteosyntézy v játrech, ztráty bílkovin při nefrotickém syndromu, malnutrice  jaterní selhání - typicky provázeno metabolickou alkalosou v důsledku  hypoproteinemie (selhání proteosyntézy  sekundárního hyperaldosteronismu s retencí sodíku (aldosteron se neodbourává játry)  zpomalení močovinového cyklu (metabolický děj, který produkuje proton na každou molekulu vzniklé močoviny)  alkalosa z dehydratace - relativní zvýšení sodných iontů při snížení objemu vody v organismu  hypernatremická alkalosa - nejčastěji důsledkem hyperaldosteronismu  primární hyperaldosteronismus - u některých nádorů nadledvin nebo jiných tumorů, produkujících aldosteron  sekundární hyperaldosteronismus - častější - následek jaterního selhání (aldosteron se v játrech odbourává) nebo nadměrná aktivace renin-angiotenzin-aldosteron (RAAS) - zvýšená hladina aldosteronu způsobí, že ledviny zadržují více sodíku, což se v ionogramu kompenzuje doplněním hydrogenuhličitanového aniontu - šetření sodíku navíc probíhá na úkor zvýšených ztrát draslíku a protonů do moči, což vede k dalšímu prohlubování alkalosy (paradoxní acidurie – tu lze rozetnout podáním draslíku) - retenci sodíku způsobují i kortikosteroidy, metabolická alkalosa proto provází i Cushingův syndrom  Cushingův syndrom vzniká dlouhodobým nadměrným působením vysokých hladin kortizolu v organismu  alkalosa z nadbytku jiných kationtů - vzácněji může metabolickou alkalosu způsobovat nadbytek jiného kationtu (např. ionizovaný vápník)  např. při nádorech kostí (mnohočetný myelom, metastázy karcinomu prsu, prostaty apod.)  při odbourávání tkáně se uvolňuje velké množství vápenatých kationtů, ale i hydrogenuhličitanových aniontů  terapie - argininchlorid (literárně tradováno) - NaCl  doplnění chloridů  místo NaH 2 PO 4 se vylučuje Na 2 HPO 4 (méně acidifikovaná moč)  diluce HCO 3 - - KCl  korekce hypokalémie  nemůžeme jej podat mnoho (draslík)  vyšetření podle Astrupa - plná heparinizovaná krev - kapilární (arterializovaná – třeba dosáhnou vazodilatace) - arteriální - venosní pH 7,4 +- 0,04 pCO 2 5,3 kPa +-0,5, respirační složka HCO 3 akt. 24,0 mmol/l +- 2 HCO 3 st. 24,0 mmol/l +-2, kolik by bylo při nasycení krve na 5,3 kPa CO 2 BE 0,0 mmol/l +-2,5, kolik by bylo nutné přidat silné kyseliny při nasycení krve na 5,3 kPa CO 2 aby pH bylo 7,4, metabolická složka pCO 2 12,0 kPa norma 10-13,3 kPa, respirační podíl na změnách ABR sat. O 2 98,0% norma 94-99%, vhodný pro kontrolu výsledků celk. CO 2 27,0 mmol/l celkové uhličitany – CO 2 + H 2 CO 3 + HCO 3- 3. Kombinované poruchy acidobazické rovnováhy ________________________________________________________________________________________________________  kombinace několika poruch ABR  laboratorní vyšetření ABR - vyšetření krevních plynů a vnitřního prostředí dle Astrupa (nověji vyšetření acidobazické regulace - poskytuje informace o pH krve, parciálním tlaku kyslíku a oxidu uhličitého, procentu okysličené krve v tepnách atd. - k vyšetření se používá arteriální, arterializovaná kapilární nebo centrální venosní krve, vzorek nutno odebrat anaerobně  významná je zejména metabolická acidosa kombinovaná s metabolickou alkalosou - při vyšetření ABR dle Astrupa jsou jednotlivé parametry v normě nebo jen mírně vychýlené (poruchy se vzájemně korigují) - kombinovaná porucha ABR proto nemusí být rozpoznána, nebo může být podhodnocena - léčebný zásah, který ovlivní jednu z dílčích poruch, může způsobit, že druhý porucha rychle převáží – může dojít k prudké změně pH vnitřního prostředí a těžkému metabolickému rozvratu vnitřního prostředí pacienta  proto se laboratorní vyšetření nehodnotí nikdy samostatně – vždy je třeba jej dát do vztahu s ostatními laboratorními nálezy, anamnesou a klinickým stavem  v zásadě platí - každá odchylka v koncentraci hlavních iontů (Na, K, Cl) způsobuje poruchu ABR - každá odchylka koncentrace celkové bílkoviny a albuminu způsobuje poruchu ABR - každé orgánové selhání (renální insuficience, těžší hepatopatie, srdeční selhávání) je provázeno poruchou ABR  pokud poruchu ABR na základě anamnesy, klinického obrazu či jiných vyšetření očekáváme, ale ve vyšetření ABR nevidíme, jde o kombinovanou poruchu a musíme pátrat po dalších odchylkách - pokud rychle ovlivníme jednu složku kombinované poruchy ABR, musíme pečlivě monitorovat vnitřní prostředí a očekávat jeho rychlé změny  MAC + MAL - zvracení + hladovění – hypochloremická alkalosa + ketoacidosa z hladovění - zvracení + průjem – hypochloremická alkalosa + alkalosa ze ztrát bikarbonátu - hepatorenální selhání – kombinace jaterní metabolické alkalosy s renální acidosou - urémie + zvracení - selhání ledvin s nefrotickým syndromem + těžká hypoproteinemie – renální acidosa z hromadění sulfátů a fosfátů je provázen alkalosou při hypoproteinemii - protrahované zvracení – hypochloremická alkalosa při zvracení kombinovaná s ketoacidosou způsobenou hladověním a laktátovou acidosou z nedostatečné perfuze tkání při hypovolemii  MAC + RAL = otrava saliciláty – zvracení a hyperventilace (tachypnoe)  RAC + MAL - selhání jater s respirační insuficiencí  těžká hypoproteinémie při selhání jater vede k plicnímu edému, v důsledku hypoxie se rozvíjí laktátová acidosa  2x MAC = dekompenzovaný diabetes mellitus (ketoacidosa) + hypovolémie (laktátová MAC)  RAC + MAC = kardiopulmonální selhání (kazuistiky) 4. Vztah acidobazické rovnováhy a metabolismu iontů. Změny iontového hospodářství při poruchách ABR, změny ABR při poruchách hospodaření s ionty ________________________________________________________________________________________________________  vztah mezi ABR a metabolismem hlavních iontů rozdělujeme do dvou skupin - výměna protonů za jiné kationty - udržování elektroneutrality, tedy rovnováha mezi koncentracemi hydrogenuhličitanů a ostatních iontů  výměna protonů za kationty draslíku a vápníku - draslík a ABR  na krátkodobém udržování ABR se podílejí zejména pufry, mezi nejvýznamnější patří hydrogenuhličitanový, hemoglobinový systém a intracelulární pufry (hydrogenuhličitany, bílkoviny, fosfáty)  při acidémii bude část nadbytečných protonů vstupovat do buněk, v nichž bude pufrovat  přes buněčnou membránu se tak přenese kationt, což by samo o sobě vedlo ke změně membránového potenciálu  proto se musí do ECT vrátit také jeden kationt – díky vysoké vodivost plazmatické membrány pro draslík to bude právě K+  draselné ionty se tedy na plazmatické membráně směňují za protony! - acidosa  hyperkalemie - nemění se však celkové množství draslíku v organismu, jen se přesouvá mezi kompartmenty - dále ale v důsledku zvýšených renálních ztrát kalia zpětně dojde k jeho depleci - alkalosa  hypokalemie - mechanismus však funguje i obráceně – hyperkalemie způsobí acidosu a hypokalemie alkalosu - vápník a ABR  podobně jako se směňuje K+ s protony, mění se protony i za Ca 2+  klíčovou roli hrají v tomto mechanismu plasmatické bílkoviny - bílkoviny krevní plasmy se chovají jako pufry především díky karboxylovým a amino skupinám - v kyselém prostředí jsou karboxylové skupiny v protonovaném, nedisociovaném stavu (- COOH) - při alkalizaci začnou pufrovat a dochází k jejich disociaci (-COO-) – karboxylát velmi účinně váže dvojmocné kationty (hlavně Ca 2+ )  na pH prostředí také záleží, jaká část vápníku bude ionizovaná a jaká neionizovaná  na plasmatických bílkovinách dochází ke směnění protonů za vápenaté ionty - alkalosa  ionizovaná hypokalcémie - acidosa  ionizovaná hyperkalcémie - celková kalcémie se nemění, je ale podstatné, že právě ionizované kalcium je metabolicky aktivní, zejména pokud jde o membránové děje  příklad je patogeneze hysterického záchvatu - psychogenně podmíněná hyperventilace – hypokapnie spojená s respirační alkalosou - pokles koncentrace ionizovaného vápníku – zvýšení neuromuskulární dráždivosti, prohlubování psychogenního záchvatu - výsledkem bývá pád s křečemi a apnoickou pauzou – během pauzy se upraví pCO 2 , pH, stoupne i ionizovaná kalcémie a epizoda končí - v rámci první pomoci se dává postiženým dýchat do sáčku – dostatečné pro udržení saturace kyslíkem, zabrání ztrátám CO 2 - řízení hyperventilace jako prostředku ke zvýšení neuronální excitability se využívá i cíleně, např. během zaznamenávání EEG  hydrogenuhličitanový aniont a ostatní hlavní ionty - vztah mezi ABR a iontovým hospodářstvím jsou těsně provázané, zejména proto, že jedna část hydrogenuhličitanového pufru nemá náboj (H 2 CO 3 čili CO 2 ), zatímco druhá složka je nabitá (HCO 3- )  hydrogenuhličitanový aniont musí být v rovnováze s ostatními ionty aby byla zachována elektroneutralita vnitřního prostředí  pro pCO 2 nic takového neplatí, jeho regulace může být do značné míry nezávislá - koncentrace většiny hlavních iontů jsou buď přísně regulované, neboť jejich změna by měla závažné funkční důsledky (Na, K, Cl) nebo organismus naopak disponuje jen velmi omezenými možnostmi je rychle ovlivnit (koncentrace bílkovin, ketokyselin, sulfátů a fosfátů)  ale! změní-li se koncentrace některého iontu v důsledku nějakého patologického pochodu, musí být tato změna kompenzována změnou koncentrace dalšího iontu, aby byla zachována elektroneutralita  často kompenzace spočívá ve změně koncentrace hydrogenuhličitanů - hypochloremická alkalosa  při zvracení se žaludeční šťávou ztrácí velké množství chloridů, koncentrace ostatních hlavních iontů se nemění  aby byla zachována elektroneutralita, bude nedostatek aniontů doplněn zvýšením koncentrace hydrogenuhličitanů – ventilace přitom bývá zachována a pCO 2 se nemění  dojde ke změně poměrů v Henderson- Hasselbachově rovnici a rozvíjí se hypochloremická alkalosa  v první řadě vždy dochází ke změně koncentrace iontů, změna pH je až druhotná v důsledku změny poměru bikarbonát/pCO 2 - ketoacidosa  nadbytek kyseliny β-hydroxymáselné a acetoacetátu způsobí pokles koncentrace bikarbonátu  příkladem je dekompenzovaný DM, hladovění  pokles bikarbonátu znamená rozvoj acidosy 5. Základní reaktivní formy kyslíku a dusíku: vlastnosti, reakce, hlavní zdroje v organismu, význam v patogenezi ________________________________________________________________________________________________________  volný radikál - molekula, atom nebo iont schopný samostatné existence, který obsahuje alespoň jeden nepárový elektron  kyslík je v těle třeba hlavně k přenosu elektronů (oxidace) z organických látek na sebe sama za uvolnění obrovského množství energie C 6 H 12 O 6 + 6 O 2 ---> 6 CO 2 + 6 H 2 O ΔG0 = -2820 kJ/mol (180 g glukosy)  reaktivitu kyslíku lze navíc regulovat katalýzou přechodnými kovy (železo, měď)  spinová restrikce kyslíku - normální (triplet) O 2 je biradikál s vysokou afinitou k elektronům - ale příjem elektronu vyžaduje aby jeden ze stávajících nepárových elektronů změnil svůj spin, což je relativně pomalý proces - bez této restrikce bychom v kyslíkaté atmosféře planety okamžitě shořeli - singletový kyslík je excitovaná, vysoce reaktivní forma kyslíku  v dýchacím řetězci běží elektrony po spádu redoxního potenciálu a kyslík je v zásadě potřeba jen na konci řetězce jako akceptor elektronů NADH + H + + ½ O 2 ---> NAD + + H 2 O - např. u bakterií může být akceptorem i jiný prvek, ale afinita k elektronům u něj vždy je nižší než u kyslíku - proto je energetický výtěžek nižší a tak u vyšších organismů, než jsou bakterie, nedostačující - na druhou stranu ale kyslík s sebou nese opotřebení organismu  kyslík sám o sobě pro organismus toxický není, to jeho deriváty - ROS (reaktivní formy kyslíku, kyslíkové radikály) lze odvodit od meziproduktů jeho redukce na vodu ROS – reaktivní formy kyslíku  radikály - superoxid - hydroperoxyl HO 2 . - hydroxylový radikál OH . - peroxyl ROO . - alkoxyl RO .  neradikály - peroxid vodíku H 2 O 2 - kyselina chlorná HClO - ozón O 3 - singletový kyslík 1 O 2  superoxid - zdroje v těle  únik elektronů na kyslík - dýchací řetězec v mitochondriích – únik z redoxních center komplexů I a III, především, ze semiubichinonu - jiné podobné redoxní systémy, např. mikrosomální cytochrom P450 monooxygenasa - jedná se asi o 1-2% celkové spotřeby kyslíku organismem  NAD(P)H oxidasa - fagocyty (respiratory burst) – vzplanutí, aktivace makrofága - při zpracování glukosy vznikne NADPH, buňka si vytvoří systém NADPH oxidasy a ta si pak vyrábí superoxid jako zbraň - nefagocytární buňky  některé enzymy - xanthinoxidasa - cykolooxygenasa - lipoxygenasa  reakce Fe 2+ -hemoglobinu s kyslíkem (někdy se stane, že kyslík ukradne jeden elektron Fe- Hb a vznikne superoxid a methemoglobin) – s tím se musí umět vypořádat červené krvinky  autooxidace (reakce s kyslíkem) různých látek (askorbát, glutathion a jiné thioly, katecholaminy) - vlastnosti  nepříliš reaktivní, oxidační i redukční činidlo  omezená možnost průchodu přes membrány (jen skrz aniontové kanály nebo ve své protonové formě)  uvolňuje železo z Fe-S clusterů - osud  dismutace  reakce s oxidem dusnatým  peroxid vodíku - tvorba v těle  dismutace superoxidu (spontánní nebo katalyzovaná superoxiddismutasou)  přímo činností některých enzymů - xanthinoxidasa - monoaminooxidasa (MAO) - vlastnosti  není radikál v pravém slova smyslu  volně prochází skrz biologické membrány  sám o sobě celkem nereaktivní  rychle reaguje s redukovanými přechodnými kovy jako železo a měď (Fentonova reakce) - osud  Fentonova reakce  vzniká tak hydroxylový radikál – nejnebezpečnější oxidační činidlo v organismu (oxidativní poškození)  bezpečně peroxid vodíku odstraňuje glutathionperoxidasa, peroxiredoxin nebo katalasa  hydroxylový radikál - vznik v těle  ionisační záření  Fentonova reakce (viz výše) - vlastnosti  extrémně reaktivní  poškozuje biomolekuly v blízkosti svého vzniku  existuje cca. 10 -9 s – na hranici definice radikálu RNS (reaktivní formy dusíku)  radikály - oxid dusnatý NO . - oxid dusičitý NO 2 .  neradikály - nitrosonium NO + - nitroxyl NO - - kyselina dusitá HNO 2 - oxid dusitý N 2 O 3 - oxid dusičitý N 2 O 4 - nitronium NO 2 + - peroxynitrit ONOO - - alkylperoxynitrit ROONO  oxid dusnatý - vznik v těle  NO synthasová reakce  tři různé NO synthasy - NOS I (neuronální, konstitutivní) - NOS II (fagocyty, inducibilní) - NOS III (endoteliální, konstitutivní) - u endoteliální je přes vápenatou signalizaci aktivována NOS, NO difunduje ven z buněk a u svalstva způsobuje přes cGMP synthasu vazodilataci - vlastnosti  plynný radikál, toxický plyn ve smogu, přesto ve vhodné koncentraci má v těle fyziologickou funkci  afinita k železu - reakce s hemovým železem guanylátcyklasy (fyziologické účinky, relaxace hladkého svalstva atd.) - reakce s hemovým železem hemoglobinu (fyziologická inaktivace NO)  reakce s –SH sulfhydrylovými skupinami glutathionu atd. na nitrosothiol, reverzibilní (fyziologický transport NO)  reakce se superoxidem na superoxynitrit a konečně hydroxylový radikál (toxicita NO – využito u fagocytů) Volné radikály v patogenezi  příčina chorobného stavu - kancerogeneze v důsledku ionizačního záření - retinopatie novorozenců - iron-overload disease  významný podíl na patogenezi - chronický zánět - ARDS – acute respiratory distress syndrome - aterosklerosa - mozkové trauma - DM - ischemie/reperfuze - stárnutí  jen epifenomenon – obecný důsledek tkáňového poškození 6. Fyziologická úloha reaktivních forem kyslíku v metabolismu: tkáňové hormony, zbraně fagocytů, hydroxylasy, redoxní signalizace ________________________________________________________________________________________________________  potřeba RONS v těle - monooxygenasy: hydroxylace steroidů, xenobiotik atd. - další enzymy - fagocyty: zabíjení mikrobů nebo nádorových buněk - mediátory zánětlivé reakce - lokální hormony, mediátory  hydroxylace hydrofobních látek - monooxygenasy, cytochrom P450... - v podstatě se jedná o řízenou Fentonovu reakci (mechanismem) - u alkoholiků je proto oxidační stres – mají tuto reakci nastartovanou - monooxygenasy  enzymy, které začleňují do molekuly substrátu OH skupinu – hydroxylasy  mají význam při syntéze kolagenu, steroidních hormonů, v metabolismu xenobiotik (cytochrom P450)  enzymy obsahují železo, které funguje jako katalyzátor a reakci urychluje, volné radikály vznikají jako meziprodukty reakce, ale jsou rychle odbourány  další enzymy - oxidasy  např. cytochromoxidasa – oxiduje cytochrom C dýchacího řetězce a elektrony předává koncovému akceptoru aerobního metabolismu – kyslíku  enzym obsahuje Fe a Cu, které fungují jako katalyzátory, jedna molekula kyslíku přijme 4 elektrony za vzniku 2 molekul vody, jako meziprodukty vznikají ROS Fe 3+ + Cu 2+ + e - ---> Fe 3+ + Cu + Fe 3+ + Cu + + e - ---> Fe 2+ + Cu + Fe 2+ + Cu + + O 2 ---> Fe 3+ + Cu + + O 2 . - Cu následně odevzdá elektron superoxidu a vznikne peroxidový radikál Fe 3+ + Cu 2+ + H 2 O 2 + e - + 2H + ---> Fe IV O (ferylový meziprodukt) + Cu 2+ + H 2 O feryl + Cu 2+ + e - + 2H + ---> Fe 3+ + Cu 2+ + H 2 O - NADPH oxidasa  enzym obsažený hlavně v makrofázích a jiných fagocytech  má význam při respiračním vzplanutí, kdy se ve fagocytující buňce vytvářejí volné radikály s cílem zničit fagocytovaný materiál  v tomto případě je vznik volných radikálů žádaný, protože urychluje degradaci fagocytovaného materiálu  NADPH se získává pentózovým cyklem  NADPH oxidasa se oxiduje za vzniku superoxidového radikálu, který pak může - být SOD přeměněn na peroxid vodíku - peroxid pak vstupuje do reakce se superoxidem za vzniku volných radikálů v případě, že je katalyzována železem (to se může uvolnit z fagolysosomu, kde je kyselé pH a nachází se v něm fagocytovaný materiál (tzv. Haber-Weissova reakce) - s myeloperoxidasou pak vzniká HClO - peroxid může vstupovat i do Fentonové reakce za vzniku hydroxylového radikálu  vznikající radikály můžou zároveň působit jako chemoatraktanty a lákat do oblasti další fagocyty  fagocyty - respirační vzplanutí neutrofilních granulocytů a dalších fagocytujících buněk - porucha tohoto mechanismu je chronická toxická granulomatosa, kdy fagocyty nedokážou pohlcené patogeny zabít a ty se v nich hromadí – granulomy - NADPH nenacházíme pouze u makrofágů, ale i jinde, kromě toho mají fagocyty schopnost i tvořit NO. a N-chloramin proto se jedná o smrtící sílu! - výzbroj fagocytu  membránová NADPH oxidasa 2 O 2 + NADPH ---> 2 O 2 . - + NADP + + H +  myeloperoxidasa H 2 O 2 + Cl - ---> R’RNCl + H 2 O (N-chloramin)  proteasy - synergismus mezi RONS a proteasami  HClO, R’RNCl inhibují α1-antitrypsin  některé metaloproteasy jsou aktivovány oxidací - respirační vzplanutí  aktivace NADPH oxidasy NADPH + O 2 ---> NADP + + O 2 . - ---> H 2 O 2  uvolnění Fe ze zásob a Fentonova reakce H 2 O 2 + Fe 2+ ---> OH . + OH - + Fe 3+  myeloperoxidasa z fagolysosomů H 2 O 2 + Cl - ---> HClO ---> chloraminy  syntéza NO (inducibilní NOS) účinkem cytokinů a mikrobů Arg + O 2 ---> citrullin + NO. ---> NO. + O 2 . - ---> OONO - (peroxynitrit, vazodilatační, antimikrobiální)  mediátory zánětlivé reakce - problematické je poškození nejen infekce, ale i okolní tkáně (zánět) - nízká sekrece – zvýšení exprese cytokinů, chemokinů a adhezních molekul  lokální hormony/mediátory - NO.  relaxace hladkého svalstva cévní stěny, GIT, corpus cavernosum penis  neurotransmitter/neuromodulátor CNS, funkce v synaptické plasticitě, učení a paměti  inhibice adhese a agregace trombocytů, adhese leukocytů - O 2 . –  funguje opačně než NO., navzájem se ničí  koncept redoxní signalizace - redoxní prostředí buňky – přibližně dáno poměrem GSH/GSSG a NADH/NAD - ROS fungují nejčastěji jako druzí poslové - na proteinech jsou redoxní sensory  kritické –SH skupiny  Fe-S centra - cíle redoxní signalizace  transkripční faktory  proteinkinasy a fosfatasy - oxidační stres aktivuje určité proteinkinasy a transkripční faktory - výsledným efektem je např. stimulace proliferace, senescence (stárnutí) buněk - působení ROS/antioxidantů v buňkách je dosti specifické a komplikované 7. Peroxidace lipidů jako příklad oxidačního poškození biomolekul. Úloha přechodných kovů (železo, měď) v patobiochemii reaktivních forem kyslíku ________________________________________________________________________________________________________ Oxidativní poškození biomolekul  oxidativní poškození lipidů - peroxidace polynenasycených mastných kyselin v membránách (žluknutí, řetězová reakce lipoperoxidace) - dalším osudem je cyklizace, fragmentace a tvorba látek, jež modifikují biomolekuly (karbonylový stres)  oxidativní poškození proteinů - oxidace –SH skupin - karbonylace –NH 2 katalyzovaná železem - hydroxylace aromatický AMK hydroxylovým radikálem - nitrosylace aromatických AMK peroxynitritem - cross-linking – agregace, síťování proteinů reaktivními aldehydy (produkty lipoperoxidace) - proteolytická degradace modifikovaných proteinů - těmito mechanismy může dojít ke změně antigenních epitopů a tak k rozvoji autoimunitních reakcí!  oxidativní poškození DNA - hydroxylace basí – změna párování bazí - reakce hydroxylového radikálu s deoxyribosou a produkce malondialdehydu - důsledkem obojího mohou být zlomy v DNA řetězci, mutageneze, karcinogeneze, apoptosa, stárnutí atd.  původ radikálů (hlavní cesty) - hydroxylový radikál vzniká ionizací vody - v organismu  jednoelektronová redukce kyslíku (mitochondrie, NADPH oxidasa) vzniká superoxid  dismutace superoxidu produkuje peroxid vodíku  Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvoří z peroxidu hydroxylový radikál Úloha přechodných kovů  redoxně aktivní přechodné kovy přijímají/dávají elektron snadno - obcházejí spinovou restrikci kyslíku - kovy jsou v aktivních centrech všech proteinů pracujících s kyslíkem  tytéž vlastnosti Fe a Cu jsou škodlivé, pokud nejsou kontrolovány - Fentonova reakce  železo v těle - „volné“ neexistuje - Fe 2+ se oxiduje molekulárním kyslíkem na Fe 3+ za vzniku kyslíkových radikálů - Fe 3+ tvoří nerozpustné oxohydroxidy - lidské tělo celkově však obsahuje asi 4g železa  hemoglobin, myoglobin, cytochromy, enzymy obsahující hemové nebo nehemové železo, ferritin, transferrin, laktoferrin - pool nízkomolekulárního železa  komplexy Fe s polyfosfáty, nukleotidy, polykarboxylovými kyselinami (citrát) – fyziologicky pouze uvnitř buněk, v plazmě nikoli  pouze toto železo může reagovat ve Fentonově reakci  kontrola/minimalizace tohoto poolu představuje základní antioxidační strategii organismu  ECT sekvestrace železa a mědi - transferrin Fe 3+ - hemopexin a haptoglobin – hem - ceruloplasmin – transport Cu - Cu ve vazbě na albumin  dále viz. antioxidanty 8. Antioxidační ochrana lidského těla ________________________________________________________________________________________________________  oxidační stres - hladina reaktivních forem kyslíku je udržována v určitých mezích mechanismy antioxidační ochrany - oxidační stres nastává při vychýlení této rovnováhy směrem k oxidaci  antioxidační ochrana - prevence tvorby ROS/RNS (regulace produkujících enzymů, sekvestrace přechodných kovů) - vychytávání, lapání a zhášení radikálů - reparační systémy (fosfolipasy, proteasom, enzymy opravující DNA)  antioxidant v chemii potravin - redukční činidlo schopné zastavit řetězovou reakci lipoperoxidace (chain breaking) - např. butylovaný hydroxytoluen (BHT), butylovaný hydroxyanisol (BHA), tokoferol (vitamin E)  antioxidační ochrana lidského těla - anatomické uspořádání regulující hladinu kyslíku ve tkáních - antioxidační enzymy - sekvestrace redoxně aktivních kovů - antioxidační substráty - stresová reakce - reparace oxidačního poškození DNA, proteinů a lipidů  anatomické uspořádání - příkladem je vniknutí mitochondrie jakožto prokaryotního organismu do eukaryotní buňky nebo shlukování mikroorganismu do kolonií - u člověka též patrné anatomickým uspořádáním a parciálními tlaky kyslíku  antioxidační enzymy - superoxiddismutasa  katalyzuje dismutaci superoxidu  naprosto nezbytná pro život s kyslíkem  SOD1 - užívá Cu+Zn - v cytosolu  SOD2 - užívá Mn (mitochondriální matrix) - užívá Fe (prokaryotická)  EC-SOD - užívá Cu+Zn - extracelulární - váže se na heparansulfát na povrchu cévního lumen - glutathionperoxidasa (GPX), peroxiredoxin  redukce peroxidu spojená s oxidací glutathionu  glutathion je následně regenerován glutathionreduktasami  GPX obsahují selenocystein v aktivním místě  cytosolová GPX - redukuje peroxid a LOOH po uvolnění z fosfolipidů  fosfolipidhydroperoxid-GSH- peroxidasa - redukuje LOOH i v membránách - glutathion (GSH/GSSG)  tripeptid, v každé buňce 1-10 mM  udržuje redukční prostředí ICT  substrát pro GPX, GST  neenzymové reakce s ROS – produkty oxidace GSH jsou toxické pro buňku  při oxidačním stresu export GSSG z buňky - katalasa  tetramer, každá podjednotka obsahuje hem s Fe  dismutace peroxidu vodíku  peroxisomy, erytrocyty  také má peroxidasovou aktivitu, ve srovnání s GPX však nevýznamnou  sekvestrace redoxně aktivních kovů (Cu, Fe) - redoxně aktivní přechodné kovy přijímají/dávají snadno jeden elektron  obcházejí spinovou restrikci kyslíku  jsou v aktivních centrech všech proteinů pracujících s kyslíkem - tytéž vlastnosti Fe a Cu jsou škodlivé, pokud nejsou kontrolovány (Fenton) - proteiny zacházející s Fe nebo Cu  transferin: váže 2 atomy Fe 3+ (transport)  laktoferrin: analogie transferinu, ale Fe neuvolňuje (jen sekvestrace), leukocyty  ferritin: H a L podjednotky, H je ferroxidasa, skladování Fe (až 4500 atomů Fe 3+ )  haptoglobin: váže hemoglobin v cirkulaci  hemopexin: váže hem v cirkulaci  ceruloplasmin: obsahuje Cu, funkce ferroxidasy (export Fe z buněk)  albumin: transport Cu  nízkomolekulární antioxidační substráty - thioly  glutathion  thioredoxin - další endogenní metabolity  bilirubin  kyselina močová  kyselina lipoová - z diety  askorbát (vitamin C)  α-tokoferol (vitamin E)  karotenoidy  rostlinné fenoly - tokoferoly (vitamin E)  skupina 8 isomerů, nejúčinnější α-tokoferol  antioxidant membrán (lipofilní)  chain breaking – zastavuje řetězovou reakci lipoperoxidace - askorbát (vitamin C)  redoxně aktivní derivát sacharidů  u většiny živočichů syntetizován z kyseliny glukuronové  pro člověka, primáty, netopýry a morčata vitamin  deficit způsobuje onemocnění zvané kurděje (skorbut)  askorbát v těle - hlavní funkce je pro- oxidační – kofaktor hydroxylas  hydroxylace prolinu a lysinu při syntéze kolagenu  syntéza noradrenalinu z dopaminu  syntéza karnitinu (úloha v oxidaci tuků)  aktivace hypotalamických peptidových hormonů amidací (CRH, GRH, oxytocin, vasopresin, substance P) - reduktant pro železo – podpora jeho vstřebávání - při poruše sekvestrace Fe (hemochromatosa) může být nebezpečný pro- oxidant - denní potřeba 70-100mg, vyšší dávky p.o. se vyloučí močí (renální práh cca 200mg/24 hodin) - také aktivované neutrofily hromadí dehydroaskorbát (DHA) – ochrana membrány před účinky vlastních ROS - selen  stopový prvek (denní potřeba 55μg), možnost deficitu i intoxikace  součást řady antioxidačních enzymů (glutathionperoxidasy, thioredoxinreduktasy) a také např. 5‘-dejodasy - β-karoten  provitamin A, prekurzor pro syntézu retinalu (vidění) a kyseliny retinové (regulátor genové exprese, růstu a diferenciace buněk)  stresová reakce - oxidace nebo nitrosylace kritických –SH skupin vede k aktivaci transkripčních faktorů (NFκBm Nrf-2...) – aktivace a translokace do jádra - to vede k indukci genové exprese následujících  chaperony (heat shock proteiny)  enzymy antioxidační ochrany  metalothionein  hemoxygenasa - výsledkem je vyšší odolnost vůči dalšímu oxidačnímu stresu  extrémním antioxidačním ochranným mechanismem může být apoptosa  červené krvinky potřebují pentosový cyklus pro tvorbu NADP k redukci glutathionu – jsou vystaveny kyslíku téměř nejvíce 9. Biochemický podklad stárnutí organismu. Radikálová/mitochondriální teorie, stárnutí jako katabolické selhání, vztah k chronickému zánětu ________________________________________________________________________________________________________  stárnutí - pokles vitality s věkem, vzestup náchylnosti k různým chorobám - není chorobou samo o sobě, jedná se o fyziologický proces - u různých živočichů vypadá stejně, ale probíhá různě rychle – musí být univerzální děj - stochastický proces, na rozdíl např. od embryogeneze není přímo programováno genomem (i když geny roli hrají) - na molekulární úrovni je stárnutí neschopnost obnovovat správnou strukturu biomolekul neomezeně dlouho (systemic molecular disorder – Hayflick) - třeba rozlišovat  průměrná délka života (naděje dožití) - 2000: muži 71,65 roku, ženy 78,35 roku - 1920: muži 47 let, ženy 49,6 roku  maximální délka života - u člověka cca 115-120 let, nemění se  patogeneze stárnutí - mnoho teorií kolem procesu stárnutí  evoluční teorie – přirozený vývoj dává přednost genům pro reprodukci před geny pro ochranu buněk – teorie antagonistické pleiotropie (viz 12)  teorie somatických mutací – kumulace mutací DNA odpovědná za projevy stárnutí (neurony se nedělí, jak vysvětlit jejich degeneraci?)  teorie mitochondriální – organely vystavené oxidačnímu stresu, zároveň produkují řadu signálních molekul - obecně se připouští, že s narůstajícím věkem dochází ke střádání chyb v organismu, který není schopen je dostatečně opravovat - nejvýznamnější vliv mají změny mitochondriální a vliv radikálů  radikálová/mitochondriální teorie stárnutí - hromadění oxidačního poškození s věkem = stárnutí (Denham Harman, 1956) - později formulována mitochondriální teorie – mitochondrie jsou hlavní zdroj ROS v organismu - mitochondriální DNA stárne 10x rychleji než jaderná – možná expozice kyslíkovým radikálům či absence histonů, které by ji chránily nebo méně dokonalý systém opravy mtDNA - bludný kruh oxidačního poškození mitochondrií  tvorba kyslíkových radikálů v mitochondriích, následné nahromadění mutací v mtDNA s věkem vede k poruše funkce respiračních komplexů  to vede k další tvorbě radikálů a k projevům – srdeční selhání, svalová slabost, DM, demence, neurodegenerace – prokázáno u mitochondriopatií - mírně poškozené mitochondrie také produkují méně energie než buňka potřebuje (antioxidační mechanismy nepřímo odebírají energii) - nedaří se ale jednoznačně prokázat, že mtDNA je více poškozována ROS, ani že dramaticky hromadí mutace s věkem - model dle Kirkwooda a Kovalda  určité množství ROS uniká z mitochondrií a poškozuje ostatní buněčné struktury  prevence tvorby ROS a systém opravující poškození nejsou nikdy 100% účinné  mírně poškozené mitochondrie produkují méně energie, než buňka potřebuje - důkazy pro radikálovou/mitochondriální teorii stárnutí  life-time energy potential - Drosophila: délka života závisí na teplotě (vyšší t = vyšší spotřeba kyslíku = kratší život) - u většiny savců je délka života dána určitou sumou srdečních tepů/spotřebou kyslíku  kůň má 0,2 l kyslíku/kg/h – žije maximálně 35 let (60 000 l/kg)  veverka má 1 l kyslíku/kg/h – žije maximálně 7 let (60 000 l/kg)  myši, exprimující defektní mitochondriální DNA polymerasu bez proof reading mají 3-5x více bodových mutací v mtDNA, více delecí, zkrácenou délku života a předčasné projevy stárnutí  stárnutí jako katabolické selhání - hromadění defektních složek v buňce - normální odbourávání  kalpainy, proteasom (proteiny s krátkým poločasem)  autofagie (proteiny s dlouhým poločasem, organely) - makroautofagie (celé organely) - mikroautofagie (makromolekuly, malé organely) - chaperony zprostředkovaná autofagie (KFERQ proteiny)  lysosomy (mitochondrie) - odbourávání v lysosomech při selhání  nekompletní degradace v lysosomech vede k uvolnění Fe z mitochondrií, ROS, lipoperoxidaci, cross-linkingu, agregaci a polymeraci zoxidovaných proteinů a lipidů  následkem toho je hromadění lipofuscinu v lysosomech a v cytosolu jsou defektní mitochondriální a proteinové agregáty  deficit hydroláz dodávaných do defektních lysosomů pak vede k tomu, že poškozené, hypertrofované (obří) mitochondrie nelze odbourat – potenciace prvního kroku  následkem všeho je méně ATP a více ROS v buňce, poškozené mitochondrie a lysosomy pak mohou iniciovat apoptosu - jediným způsobem zbavení se odpadních látek se stává buněčné dělení  odpad se neodstraňuje, ale rozděluje do defektních buněk, čímž se snižuje jeho koncentrace  problém vzniká u buněk, které žijí dlouho a dělí se hůře (kardiomyocyty, hepatocyty)  vztah stárnutí k chronickému zánětu - stresová reakce  oxidace nebo nitrosylace kritických SH skupin  následkem toho jsou aktivovány TF a translokovány do jádra  dochází proto k indukci genové exprese pro - chaperony (HSP) - enzymy antioxidační ochrany - metalothionein - hemoxygenasu 1  výsledkem je vyšší odolnost vůči dalšímu oxidačnímu stresu a/nebo propagace zánětu - stresová reakce se ve stáří stává chronickou 10. Význam mitochondrií v buněčné smrti (apoptose i nekrose) a fyziologickém stárnutí organismu ________________________________________________________________________________________________________  význam mitochondrií při nekrose - v časné fázi nekrosy dochází k narušení buněčných membrán, což způsobí, že buňky a jejich organely, např. mitochondrie, začnou bobtnat a dojde k následnému úniku vnitřního obsahu do okolí - to zapříčiní rozpad buňky - dochází k poruše kalciové homeostázy  ischemie a některé toxiny jsou schopné navodit velmi rychlý nárůst koncentrace cytosolového vápníku tokem z mitochondrií, endoplazmatického retikula a extracelulárního prostoru a tím se nespecificky zvýší permeabilita buněčných membrán a aktivuje se řada enzymů poškozujících buněčné struktury (zejména fosfolipasy, proteasy, ATPasy a endonukleasy)  následuje ztráta mitochondriálních pyridinových nukleotidů s navazujícím výrazným úbytkem ATP a snížením až nemožností jeho obnovy  tyto porucha je důsledkem ischemie a působení některých škodlivin a ovlivňuje integritu plasmatické membrány - vysokoenergetické vazby ve formě ATP jsou nutné pro řadu syntetických i degradačních postupů  hypoxie působí na aerobní respiraci, tedy na oxidační fosforylaci v mitochondriích  snížení tenze kyslíku vede ke zpomalení oxidační fosforylace a tím snížené tvorbě ATP  následuje aktivace anaerobní glykolýzy a glykogenolýzy, která vyúsťuje k hromadění laktátu a zvýšení obsahu anorganického fosfátu (hydrolýzou fosfátových vazeb)  snižuje se intracelulární hodnota pH a dochází k zaškrcování chromatinu (clamping)  deplece ATP dále vede k poruše Na/K-ATPázy a tím k isoosmotickému zvýšení obsahu vody v buňce a buněčnému edému - přetrvávající hypoxie způsobuje hyperhydrataci buňky i mitochondrií a poté vakuolizaci mitochondrií a další poškození membrány - při oxidaci v mitochondriích vznikají reaktivní formy kyslíku (ROS) - postischemické zvýšení ROS vzniká nedokonalou redukcí kyslíku v mitochondriích při reakci xanthinoxidasy, kdy dochází k tvorbě superoxidu  průběh apoptosy - apoptosa vyžaduje aktivní účast buňky na svém vlastním zániku – přítomnost a syntézu ATP - podstatou je řada proteolytických štěpení pomocí kaspas, jejichž terminálními substráty jsou pro buňku podstatné regulační a strukturní bílkoviny - průběh lze dělit do 3 částí – iniciační, kontrolní, efektorové - iniciační fáze  množství faktorů, které působí jako ligandy membránových nebo cytoplazmatických receptorů iniciujících vznik apoptotických iniciačních komplexů  kromě této iniciace je podstatné též porušení DNA a změna funkčního stavu mitochondrií  existuje tzv. intrinsická a extrinsická cestra  vnější cesta - sebedestrukce zprostředkovaná imunitními buňkami – nesou na své membráně ligandy tzv. receptorů smrti - zatímco ligandy jsou exprimovány pouze efektory imunitního systému, receptory smrti jsou na membráně buněk všech tkání - jedná se o TNFR, FasR, Apo-1 receptory, které obsahují DD – death doménu v intracelulární části své molekuly - pomocí DD interagují ligandy receptorů smrti s adaptorovými molekulami na vnitřní straně membrány - adaptorové molekuly (např. FADD) slouží k navázání prokaspasy 8 do vznikajícího aktivačního komplexu DISC (death inducing signaling complex) - prokaspasa se pak autokatalyticky aktivuje na kaspasu 8, aktivní, volnou  vnitřní cesta - spouštěcím mechanismem je uvolnění cytochromu c z mitochondrie - uvolněný cytochrom c aktivuje Apaf-1 (apoptotic protease activating factor), který slouží k aktivaci kaspasy 9 - pro plnění této funkce má Apaf-1 doménu CARD (caspase recruitment domain) - navázáním prokaspasy 9 se vytvoří apoptotický signální komplex vnitřní cesty aktivace apoptosy – tzv. apoptosom - jeho výsledkem je uvolnění proteolyticky plně aktivní kaspasy 9 - kontrolní fáze  v buňce je řada bílkovin, které mohou apoptosu ovlivnit  v regulaci sehrávají roli proteiny rodiny Bcl-2 - více než 20 proteinů, patřících jak mezi inhibitory apoptosy (Bcl-2), tak mezi aktivátory (Bax) apoptosy - mají charakteristickou schopnost vytvářet homodimery i heterodimery navzájem (1-4 domény BH) - místem výskytu proteinů této rodiny je hlavně vnější membrána mitochondrií, ale umí dělat kanály i do membrány jaderné či ER - schopnost buňky indukovat apoptosu určuje mimo jiné i poměr intracelulárních koncentrací mezi skupinami pro a proti apoprotických zástupců rodiny Bcl-2 - jednotlivé proteiny významně regulují schopnost uvolnění cytochromu c z nitra mitochondrie, resp. vnitřní membrány - proapoptotičtí zástupci mají schopnost tvořit kanály v zevní membráně mitochondrie – porucha transmembránového potenciálu, nezbytného pro udržení produkce ATP - membrána se stává labilní a cytochrom c se uvolňuje z mitochondrie, na jejímž povrchu je ukotven Apaf-1 - antiapoptotičtí zástupci naopak membránu stabilizují - exekutivní fáze  kaspasy 8 a 9 aktivují výkonné prokaspasy, např. prokaspasu 3, 6, 7  substrátem exekutivních kaspas jsou strukturně a funkčně významné proteiny – aktin, lamin, proteiny regulace sestřihu pre-mRNA, reparační proteiny  rozštěpením inhibitoru kaspasami indukované DNAsy se aktivuje endonukleasa, která způsobí fragmentaci genomové DNA  jakmile dojde k aktivaci efektorových kaspas, je děj apoptosy již nevratný  vliv mitochondrií na apoptosu - podstatný je MPT (mitochondrial permeability transition – megakanál) - mitochondrie zabíjí buňku několika způsoby  uvolnění proapoptotických faktorů z intermembránového prostoru - cytochrom c - AIF (apoptosis inducing factor) - edonukleasa G - Smac/Diablo (inhibitor IAPs) - Htra2/Omi (serinová proteasa, štěpí IAPs) - prokaspasy  narušení buněčné energetiky a produkce ATP (uvolnění cytochromu c, depolarizace)  nadprodukce kyslíkových radikálů  patogeneze chorob jako dysregulace apoptosy - neurodegenerace, ischemie, AIDS: buňky umírají, když nemají - autoimunita, nádory: neumírají buňky, které by měly - nádorové buňky žijí z glykolýzy a mitochondrie vypínají - dichloracetát – inhibice PDH kinasy – aktivace PDH  aktivace mitochondriální respirace a produkce oxidantů  aktivace apoptotického programu  nádorové buňky hynou  význam mitochondrií při stárnutí - postupně se snižuje kapacita oxidativní fosforylace a dochází k pleomorfní vakuolizaci mitochondrií - ROS denně způsobují alterace bazí v DNA i mtDNA, přičemž jsou postupně převyšovány možnosti opravného mechanismu, jehož schopnosti klesají s věkem - mtDNA je tedy postupně více poškozována - pro tuto tezi svědčí radikálová/mitochondriální teorie stárnutí 11. Za jakých podmínek může být buňka nesmrtelná? Autofagie, Hayflickův limit, telomerasa ________________________________________________________________________________________________________  buňka k nesmrtelnosti potřebuje 3 věci - dělení (mj. se ředí neodbouratelné proteiny) nebo spánek v hypoxickém prostředí - telomerasu - žádné anebo vypnuté mitochondrie  typicky u nádorových buněk – glykolýza = warburgův fenomén + vypnutá apoptosa - nejvíce tedy stárnou specializované postmitotické buňky nervové, srdečního a kosterního svalu – nejspíš konečný limit trvání našich těl  autofagie - v buňce se postupně hromadí defektní součásti – zbavuje se jich tzv. autofagií - autofagie (proteiny s dlouhým poločasem, organely)  makroautofagie (celé organely)  mikroautofagie (makromolekuly, malé organely)  chaperony zprostředkovaná autofagie (KFERQ proteiny)  Hayflickův limit - lidské fibroblasty v kultuře se dělí maximálně 50-70x, pak stárnou a hynou - platí to pro všechny somatické buňky, s výjimkou nádorových - u buněk ze starých osob je pochopitelně počet dělení nižší  telomerasa - ribonukleoprotein s vlastním RNA primerem - enzym, který přidává opakující se sekvence navíc k 3‘ konci templátu – dosyntetizuje se tak DNA opožďujícího vlákna a tato není zkracována - jinak telomery určují počet dělení buňky – přílišné zkrácení (bez telomerasy při replikaci dochází ke ztrátám) neumožní buňce přežít (u normálních nenádorových somatických buněk) - telomerasa není klíč k věčnému mládí! - většina buněk lidského těla telomerasu nepotřebuje (dělí se málo nebo vůbec) - kmenové, germinální a aktivované imunitní buňky telomerasu mají - fibroblasty a epiteliální buňky nikdy Hayflickova limitu nedosáhnou - myší somatické buňky telomerasu mají, přesto žije myš kratší dobu než člověk - K.O. myšího genu pro telomerasu ale vede k předčasnému stárnutí až po několika generacích, výskyt lidských epiteliálních nádorů (karcinomů) - nepřítomnost telomerasy u normálních buněk se vysvětluje jako ochrana proti zhoubnému bujení  je stárnutí nevyhnutelné? - Nezmar (Hydra) má jednoduchý tělesný plán, rychlou a úplnou obnovu všech somatických buněk z kmenových buněk - dále má rozptýlenou nerovovou soustavu, žádný mozek ani sval - rozmnožuje se hlavně pučením (nepohlavně) - neprojevuje žádné známky stárnutí - i kdybychom ale dokázali totéž uměle (kmenové buňky), náhrada buněk v CNS musí vést ke ztrátě paměti 12. Rozdíl mezi průměrnou a maximální délkou života. Vliv genů, teorie „těla na vyhození“, teorie antagonistické pleiotropie, účinek kalorické restrikce ________________________________________________________________________________________________________  průměrná a maximální délka života - při otázce smrtnosti rozlišujeme průměrnou délku života, charakterizující očekávané dožití určitého věku v dané oblasti či populaci a maximální délku života, neboli předpoklad dosažení nejvyššího možného věku při nejpříznivějších podmínkách - průměrná délka života  průměrná délka, neboli naděje na dožití určitého věku, s jistou pravděpodobností  tam, kde je vysoká úmrtnost dětí bude průměr očekávaného dožití nižší, než v oblastech, kde se děti dožívají v hojném počtu dospělosti  záleží též na mnoha dalších faktorech – příslušnost k sociální vrstvě (bohatší si mohou dovolit lepší zdravotní péči), stav veřejného zdravotnictví (odráží vyspělost státu – v Japonsku průměr 81 let), probíhající válka, promořenost HIV a TBC v populaci, hladomory, kvalita života, úrazovost lokality atd.  v dnešní době je průměrné dožití mužů u nás kolem 71 a u žen 78 let  před 80 lety to byl u mužů 47 a u žen zhruba 50 let  v předindustriálním období, když někdo přežil pubertu, měl velkou pravděpodobnost dožít se stejného věku jako my dnes, ale v návaznosti na smrtnost mladých byla průměrná délka života nižší (20-30 let)  zvýšení průměrného věku dožití souvisí s pokroky v medicíně, s lepšími životními podmínkami, méně nebezpečnými životem a samozřejmě vysokou kvalitou veřejného zdravotnictví oproti dobám minulým - maximální délka života  u člověka 115-120 let, při současných životních podmínkách dokonce někde i kolem 125 let, avšak jsou i zmínky o lidech žijících déle  lidský věk se v zásadě neprodlužuje, i dříve se lidé dožívali věku nad sto let – doklady jsou již z antiky  zvyšuje se ale pravděpodobnost dožití vyššího věku, střední délka života  přibývá tedy lidí, kteří se dožívají vysokého stáří  i zde hraje roli množství faktorů ovlivňujících život, jako např. prostředí, ve kterém žijeme (radiace, záření, průmyslové oblasti, města X venkov), strava a její složení (podíl zeleniny a ovoce, přímořská strava s větším podílem nenasycených mastných kyselin X tučný základ jídelníčku ČR), fyzická kondice (souvisí s pohybem, utužováním, udržováním svého těla), abusus (kouření, alkohol, léky, kofein) a významnou stránkou bude i duševní stav  genetické vlivy - vliv genu – geny se ve vztahu k délce života uplatňují třemi různými způsoby  geneticky kódovaným programem, kterému se říká programované stárnutí, resp. programovaná smrt a jehož přítomnost je nutná jednak pro zaručení životního prostoru pro novou generaci, jednak jako ochrana před přílišným zatížením genetického materiálu mutacemi v průběhu života (zkracování telomer)  jde o celkový dopad na délku života všech geneticky programovaných funkcí organismů, které samy o sobě bezprostřední vliv na délku života nemají (rozmnožování, adaptace, diferenciace buněk a tkání)  jde o genetický důsledek na funkce organismu, které nejsou řízeny programem smrti, ale které délku života výrazně ovlivňují – zejména imunita, metabolismus a regenerace, biochemicky hlavně produkce klíčových látek – vitaminů, hormonů, enzymů a neuromediátorů (tedy jde o činnost funkcí, které délku a kvalitu života ovlivňují podstatnou měrou) - je zřejmé, že dlouhověkost je určena hlavně geneticky – cestou genové manipulace bude jistě jednou možné lidský věk prodloužit - každému genu však odpovídá určitý proces/stav organismu, proto můžeme klíčový prvek ovlivnit i bez genetické manipulace - nejužší souvislost mezi geny a tělesnými funkcemi nacházíme u látek nejúčinnějších, u hormonů, které jsou důležitými nástroji při řízení organismu, jeho funkcí, orgánů a vývojových procesů - ovlivnitelnost 3 řečených genetických vlivů  genetický program lze ovlivnit samotným zásahem do něj – do struktury DNA a jeho změnou (genová terapie) – etická hlediska v současnosti nepřipouštějí  komplexní přispívání funkcí organismu k délce života lze ovlivnit poznáním a zmapováním všech vztahů mezi fyziologickými funkcemi a následným jemným vylepšováním – tak lze délku života prodloužit, ale ne za určitou hranici, mnoho času navíc nutno věnovat životosprávě a doplňkovým terapiím  pro lidský zásah se jeví jako nejefektivnější oblast důsledků genetického programu – tvorba enzymů a hormonů, které může rozdělit do 3 skupin enzymů z hlediska dlouhověkosti - enzymy a koenzymy, které nám pomáhají asimilovat živiny - enzymy podporující činnost orgánů, dodávající buňce energii a pomáhající uklízet tělo - enzymy, které nás obraňují před volnými radikály, označované jako enzymy a koenzymy s antioxidačním účinkem  teorie těla na vyhození (disposable soma theory) - bakterie nestárnou za cenu vysoké mortality - vyšší organismy – specializace  gamety: haploidní (filtr genetických defektů), obrovská redundance a velká selekce, DNA pro další generace  soma: diploidní, trvalejší struktura, která se ale opotřebovává, DNA není určena pro další generace - v přírodě se většina živočichů stárnutí nedožije – selekční stín pro mutace s negativním vlivem v pozdních fázích života - v přírodním výběru je rozhodující úspěch v reprodukci – geny prodlužující post- reprodukční období jsou k ničemu! - omezené množství energie se musí dělit mezi údržbu těla a reprodukci (trade-off) - příkladem je katastrofické stárnutí u lososa tichomořského – po návratu z moře do původních potůčků se jeho tělo rozpadá – zanedbaná výživa, jediný cíl je rozmnožit se - výjimky ze vztahu délky života a spotřeby kyslíku  želva s krunýřem, křídla u netopýra a vyspělý mozek u šimpanze  ptáci žijí relativně déle než stejně velcí savci, protože mají lepší mitochondrie - krysa žije 3,5 roku, kdežto holub 35 let - intenzita metabolismu u obou srovnatelná, produkce ROS mitochondriemi ve vztahu ke spotřebě kyslíku je asi 10x menší - důkazy pro trade-off mezi délkou života a plodností  v laboratoři lze vyselektovat Drosophily žijící 2x déle asi po 10 generacích, asociováno s pozdější reprodukcí, celkový počet potomstva stejný  genealogické studie britské aristokracie ukazují, že ti, kteří žili nejdéle měli zároveň největší problémy s plodností  teorie antagonistické pleiotropie - geny, které poskytují výhodu v reprodukci, ale poškozují nositele později - příklady u lidí  Huntingtonova chorea - existují dvě teorie - podle jedné mají postižení jako jeden z projevů psychickou promiskuitu – větší množství dětí - dle druhé je výskyt rakoviny mezi postiženými nižší ne u stejně starých v běžné populaci  hemochromatosa - AR onemocnění, zvýšené ukládání Fe – výhoda při morové nákaze  srpkovitá anemie - heterozygot má výhodu při malárii  dědičná trombofilie - rychlejší zástava krvácení při zranění či porodu, nevýhoda při dlouhodobém znehybnění - také možnost toho, že v mládí dobrá obrana proti infekci vede k chronickým zánětům a oxidačnímu stresu ve stáří  současné možnosti ovlivnění - kalorická restrikce  omezení množství potravy při zachování její biologické kvality  funguje u teplokrevných živočichů – myš, makak, s konstantní intenzitou metabolismu (myš žije 28 měsíců, ale omezení potravy na 25% jí prodlouží život na 47 měsíců)  skutečně prodlužuje maximální délku života, snižuje oxidační stres, výskyt nádorů a zpomaluje stárnutí  organismus přečkávají nepříznivé období totiž věnuje více metabolické energie na údržbu  mechanismus - určité potlačení signalizace IFG-I (somatomedin C) a inzulinu - sirtuiny – enzymy deacetylující histony, P53 apod., inhibované NADH  u lidí probíhá studie CALERIE (Comprehensive Assessment of Long-term Effects of Reducing Intake of Energy) - fyzická aktivita  prospívá svalovým mitochondriím  potřeba energie stimuluje biogenesi a obnovu svalových mitochondrií  přiměřená dávka (např. oxidačního) stresu zvyšuje odolnost vůči stresu dalšímu - co tě nezabije, to tě posílí - mechanismu je např. indukce exprese heat shock proteinů (chaperonů), stresová reakce  příkladem je produkce ROS ve svalové tkání při fyzické aktivitě – přesto prospěšné  obdobně mentální aktivita pomáhá obnovovat mozkové mitochondrie (???) - složení stravy  dieta bohatá na ovoce a zeleninu (optimálně 5x 80 g denně) je spojena s nižším rizikem kardiovaskulárních chorob, diabetu a některých typů rakoviny (plíc, ústa, hltan) – neví se však proč  v patogenesi lidských onemocnění se objevují volné radikály – proto by se dalo říci, že řešením je požívání antioxidantů – vitamin E, C, β-karoten a selen  antioxidační přípravky však mohou i škodit - recentní meta-analýza celkové mortality v 68 studiích s podáváním antioxidačních doplňků - β-karoten, vitamin A a vitamin E signifikantně zvyšují mortalitu - vitamin C a selen nemají vliv - ve vyšších dávkách už totiž antioxidanty nedělají nic a působí tam, kde nemají  inhibice stresové reakce  brání boji proti infekci, nádorovým buňkám, oprávněné apoptose - mají i jiné účinky než antioxidační  tokoferoly: protizánětlivé  β-karoten: ko-karcinogen (dohromady s kouřením nebo environmentálními toxiny)  nesmrtelnost ani věčné mládí nejsou na dosah, stárnutí je zřejmě nevyhnutelným důsledkem aerobního metabolismu mitochondrií postmitotických tkání  rychlost stárnutí ale ovlivnit nejspíš lze – kalorickou restrikcí a fyzickou aktivitou s vyváženou dietou  budoucností jsou nejspíš imunomodulace, přímá aktivace sirtuinů, kmenové buňky, ovlivnění autofagie, mitochondriální medicína... 13. Metabolický syndrom a inzulinová rezistence – charakteristika, příčiny, důsledky, možné terapeutické ovlivnění ________________________________________________________________________________________________________  metabolický syndrom = Reavenův syndrom - soubor rizikových faktorů a nemocí, které vedou k zdravotním komplikacím – zvýšenému riziku aterosklerosy a přidružených komplikací - definice není zcela určena – liší se podle jednotlivých společností - základní kritéria pro diagnostiku metabolického syndromu  dyslipidemie - ↑ TAG, ↓ HDL, ↑ LDL (zejména oxidované LDL), ↑ celkového cholesterolu, ↑ apolipoproteinu a v krvi  abdominální/viscerální obezita  hyperglykémie nebo porucha glukosové tolerance nebo DM2  arteriální hypertenze - jedná se o tzv. smrtící kvarteto - oxidované LDL  malé, denzní molekuly LDL  velmi reaktivní a agresivní, pronikají hlouběji do cévní stěny - obezita  tuková tkáň je vysoce metabolicky aktivní, tuk je využíván k tvorbě růstových faktorů  při obezitě je excesivní tvorba růstových faktorů vhodných pro nádory  tuková tkáň viscerální obezity je více metabolicky aktivní, endokrinně aktivní, stimuluje zánětlivou reakci (více prokrvení) než tuková tkáň břišní stěny  karcinogeny rozpustné v tucích se deponují v tukové tkáni, čím více tuku, tím více kancerogenů  souvisí s dysplipidémií - hypertenze  ↑ tlakové zatížení cév – adaptace proliferací hladké svaloviny - ↓ pružnosti cév  za základní patologickou jednotku metabolického syndromu je považována inzulinová rezistence  inzulinová rezistence - ↓ reakce tkání na inzulin (např. ↓ vystavování receptorů pro inzulin na povrch buněk) - ↓ oxidativní a hlavně neoxidativní utilizace glukosy, ↓ aktivita glykogen synthetasy - organismus nereaguje na běžné hladiny inzulinu – tkáně vyžadující inzulin ke zpracování glukosy ji nedokáží utilisovat (sval, tuk) - primární  polymorfismus genu pro IRS-1, glykogensynthasu, glukosové transportéry – hyperglykémie vyvolá inzulinovou rezistenci - sekundární  ↑ volné mastné kyseliny, ↑ nasycené mastné kyseliny, hormonální poruchy – kortizol apod. - příčiny  ↑ hladiny kortizolu v krvi – infekcí způsobený zánět nebo stres přes sympato- adrenální systém - sacharidy: ↑ glykémie, glukoneogeneze v játrech - tuky: mobilizace a lipolýza - amk: ↑ rozklad - ↑ močoviny – vylučování, amk utilizovány pro glukoneogenezi - ↓ vychytávání glukosy svaly a tukovou tkání  časté zvyšování kortizolu intravaskulárně způsobí inzulinovou rezistenci  snížené vychytávání glukosy svaly a tukovou tkání vede ke zvýšení glykémie  β-buňky Langerhansových ostrůvků se snaží o vyrovnání - ↑ produkce inzulinu (krátkodobě to má efekt, dlouhodobě nikoli)  následkem je down-regulace inzulinových receptorů  inzulinová rezistence se projeví ↑ glykémií + ↑ inzulinémií - důsledky  ↓ příjem glukosy svaly vede k nedostatku energie  zvýšený inzulin snižuje glykogenolýzu v játrech – při rezistenci k inzulinu tento mechanismus často nefunguje a je tedy zvýšená glukosa v krvi ještě z důvodu glykogenolýzy v játrech  tuková tkáň snižuje příjem cirkulujících tuků, dochází ke ↑ hydrolýze TAG a tak ↑ volných mastných kyselin v plazmě  mechanismy poškození tkáně - ↑ inzulin / IGF-1 (inzuline qrowth factor 1) vede k proliferaci buněk hladkých svalů cév, migraci a proliferaci cévních a srdečních fibroblastů a následné hypertrofii stěny cév a myokardu (kardiovaskulární onemocnění!) - ↑ inzulin / IGF-1 také zvyšuje riziko rozvoje nádorů - ↑ lipidy, zejména volné mastné kyseliny  vedou ke karbonylovému stresu  akumulace viscerálního tuku vede ke zvýšení zánětlivých cytokinů – rezistin, TGF-β – chronický zánětlivý stav - dlouhodobá hyperglykemie spouští reakce, vedoucí k oxidačnímu stresu  negativní ovlivnění cév, endoteliální dysfunkce  dochází k neenzymatické glykaci – vazbě glukosy na proteiny (i NK), dochází ke změně jejich struktury a zesíťování - endoteliální dysfunkce  nerovnováha tvorby vazokonstrikčních a vazodilatačních působků  snížená aktivita endoteliální syntázy NO (eNOS)  zvýšená degradace NO  dysregulace osy RAAS – zvýšená aktivita a tedy zvýšená hladina angiotenzinu II - prokoagulační stav – z důvodu zvýšené exprese inhibitoru plazminogenu - to všechno vede ke zvýšené pravděpodobnosti kardiovaskulárních onemocnění  terapie - prevencí je fyzická aktivita, redukce mírnější nadváhy, úprava stravy - inzulinová rezistence  PPARγ (peroxisome proliferator activated receptor γ) - jaderný receptor steroidní rodiny - zásadní transkripční mediátor pro adipogenesi, lipidový metabolismus, inzulinovou citlivost a glukosovou homeostasu - PPARγ agonista – lék, thiazolidin - účinek  ↑ citlivost k inzulinu, ↓ glykémie  ↓ hladina volných MK a TAG v cirkulaci  ↓ krevní tlak  ↓ zánět a aterogeneze – pokles monocytární adheze k endotelu, snížená proliferace, migrace a zvýšená apoptosa hladkých svalových buněk cév, snížená akumulace oxidovaných LDL v makrofázích  biguanidy - perorální antidiabetika, rizikem je laktátová acidosa - zvyšují senzitivitu tkání, zejména jater a kosterního svalstva, k inzulinu a snižují glykémii  podporou utilizace glukosy v kosterních svalech a v tukové tkáni (stimulace glykolýzy)  útlumem glukoneogeneze v játrech  snížením resorpce glukosy ze střeva  inhibitory dipeptidylpeptidasy 4 (DPP-4) - štěpí proteiny, které příznivě podporují inzulinovou rezistenci (nemají výrazně vyšší účinnost) - další terapie IR a MS  inhibice RAAS - ACE inhibitory – zabraňují konverzi angiotenzinu I na angiotenzin II - AT1 receptor blokátory – blokují receptor 1 pro angiotenzin II, nemají vyšší účinnost než ACE inhibitory - následkem je snížení krevního tlaku a dále antiproliferační efekt na buňky hladkých svalů cév, fibroblasty, kardiomyocyty - angiotenzin II má totiž proliferační efekt, zejména při dlouhodobém zvýšení aktivity RAAS  statiny - HMG-CoA reduktasa inhibitory - snížení hypercholesterolemie, zlepšení dyslipidemie - antiproliferativní účinek na fibroblasty, buňky hladké svaloviny cév, kardiomyocyty 14. Tvorba AGEs, interakce AGE-RAGE, terapeutické možnosti redukce tvorby/účinku AGEs ________________________________________________________________________________________________________  AGEs (advanced glycation end products) - produkty pokročilé glykace - heterogenní skupina látek, mezi které patří pentosidin, GOLD, MOLD - charakteristická žlutohnědá pigmentace a fluorescence - modifikace biologických struktur, vazba na bílkoviny, schopnost zesítění – crosslinking - reakce se specifickými receptory, např. RAGE - význam v patogenezi chronických onemocnění a jejich komplikací – DM, chronické renální selhání, aterosklerosa, neurodegenerativní onemocnění aj. - změna fyzikálních i chemických vlastností pozměněných AGE bílkovin  změna rozpustnosti  změna náboje  nižší izoelektrický bod  crosslinking  zvýšená rezistence k tepelné denaturaci  stabilita vůči snížení pH  ovlivnění hladiny AGEs v organismu - neenzymatická glykace - oxidační stres - karbonylový stres - obrat proteinů - potrava  tvorba AGEs – neenzymatická glykace (Maillardova reakce) - při neenzymatické glykaci proteinů (starší název neenzymatická glykosylace) reagují volné aminoskupiny s karbonylovými skupinami redukujících cukrů bez katalytického působení enzymů - reakce poprvé popsána Louisem Maillardem, který pozoroval hnědnutí bílkovin při zahřívání s cukry - reakce probíhá ve 3 krocích – iniciace, propagace a terminace - iniciace  neenzymová kondenzace aldehydové skupiny redukujícího cukru (např. glukosa) a aminové skupiny proteinu za vzniku nestabilní Schiffovy baze (produkt časné glykace)  tvorba baze probíhá rychle a k dosažení rovnováhy dochází během několika hodin, tento typ reakce je reverzibilní - propagace  Schiffova baze během několika dní podléhá chemickému přesmyku za vzniku stabilnějších struktur, kterým se říká Amadoriho produkty (přechodné produkty glykace) charakteru ketoaminů  jsou do určité míry reverzibilní, jejich rovnováha je značně posunuta ve směru jejich tvorby  ustálený stav nastává během 20-30 dní  dále během propagace mohou být Amadoriho produkty rozkládány na karbonylové sloučeniny jako glyoxal, methylglyoxal, deoxyglukoson  deoxyglukoson vzniká při vyšším pH, kdy Amadoriho produkty enolizují v pozici mezi 2. a 3. uhlíkem a tím eliminují amin z 1. uhlíku  tyto sloučeniny jsou velmi reaktivní a jsou vlastními propagátory neenzymatické glykace, které způsobují nevratné molekulární změny proteinů - terminace  v poslední fázi reagují Amadoriho produkty nebo jeho degradační sloučeniny s volnými aminoskupinami proteinů s dlouhou životností (kolagen, elastin, myelin)  vznikají produkty pokročilé glykace – AGE-sloučeniny  dané procesy jsou ireverzibilní a trvale poškozují tkáně, ve kterých se ukládají  zvýšená hladina glukosy v krvi vede ke zvýšené tvorbě AGEs (přímá úměrnost tvorby)  následuje rozvoj dlouhodobých komplikací  laboratorním markerem diabetické kompenzace je HbA1 po 3 měsících, fruktosamin po 3 týdnech  vznikají stabilní proteiny s porušenou strukturou bez fyziologických funkcí, s dlouhým biologickým poločasem  endoteliální buňky - nepotřebují inzulin pro příjem glukosy – tedy EC hladina u nich odpovídá IC hladině - dochází u nich k tvorbě prekurzorů AGEs intracelulárně (např. glyoxal) - intracelulární vliv – glykace IC proteinů – ovlivnění genové transkripce - EC transport – glykace proteinů matrix – ovlivnění interakce buněk s matrix - EC transport – vznik AGEs – AGE-RAGE interakce – jaderné NF-κB – tvorba prozánětlivých cytokinů a růstových faktorů  interakce AGE-RAGE - RAGE je receptor pro produkty pokročilé glykace - řadí se do imunoglobulinové superrodiny - jedná se o transmembránový protein, který má schopnost vázat AGE sloučeniny - interakce AGE-RAGE způsobí  nitrobuněčnou signalizaci  nejčastěji se vyskytuje na buňkách endotelu (oblasti typicky postižené aterosklerosou), makrofázích a mikrogliích v mozkové tkání  vede k oxidačnímu stresu a aktivaci MAP-kinas  tyto dva mechanismy vedou k aktivaci transkripčních faktorů, např. NF-κB, který je na tyto mechanismy velmi citlivý – spouští kaskádu reakcí, které vedou k tvorbě mnoha molekul - působení RAGE receptoru v organismu  aktivace NF-κB faktoru  stimulace tvorby cytokinů – IL-1, TNF-α, interferon γ  stimulace tvorby růstových faktorů – IGF-1, PDGF  exprese adhezivních molekul  zvýšení buněčné proliferace  zvýšení vaskulární permeability  podnícení migrace makrofágů  tvorba endotelinu  dochází k mutacím DNA  zvyšuje se syntéza kolagenu IV, proteoglykanů a fibronektinu  v místě zánětu vytvářejí makrofágy karboxymethyllysiny (CML)  negativní působení AGEs v organismu - Diabetes mellitus – mikrovaskulární komplikace  nefropatie vedoucí k selhávání ledvin, depozita v bazální membráně, změna náboje, sekrece růstových faktorů, zvýšení permeability cév, zhuštění a zmnožení mesangiální matrix  neuropatie z důvodu degenerativní změny vláken i myelinové pochvy, somatické i autonomní neuropatie  retinopatie z důvodu edému, fibrosy cév, krvácení do sklivce, mikroaneurysmat a exsudátů - kardiovaskulární komplikace  modifikace proteinů cévní stěny, crosslinking, zvýšená produkce extracelulární matrix  glykace a oxidace LDL částic, poškození endotelu – glykace kolagenu - hromadění AGEs v pyramidových buňkách způsobuje Alzheimerovu chorobu, obecně lze říci, že jde o neurodegenerativní onemocnění - poškození arterií (zeslabení cévní stěny, změny permeability), aterosklerosa - chronická plicní onemocnění, jaterní cirhosa, revmatoidní artritida  terapeutické možnosti redukce tvorby/účinku AGEs - zamezení negativních vlivů AGEs lze docílit obecně na 3 úrovních - vznik AGEs  dietární restrikce (zamezení příjmu nežádoucích potravin)  snížení hyperglykemie a hyperlipidemie  inhibice tvorby oxidantů – snížení oxidačního stresu - degradace zesítěných proteinů chemicky (aminoguanidin?) - interakce AGEs-RAGE  ovlivnění účinku na receptor antiRAGEAb, sRAGE (solubilní receptor pro AGEs je inhibitorem toxických účinků AGEs  sérová hladina je snížena u pacientů s ICHS, arteriální hypertenzí a u pacientů s diabetes - v dnešní době probíhají neustálé studie na ovlivnění hladiny AGEs a jejich nežádoucích účinků - do této souvislosti můžeme zařadit látky např. taurin, carnosin, aspirin, pyridoxamin, aminoguanidin, kyselinu α-lipoovou a další 15. Mechanismus hyperglykémií vyvolaného poškození tkání ________________________________________________________________________________________________________  dlouhodobá hyperglykémie nastává při inzulinové rezistenci nebo při DM1 i DM  nejedná se o kosmetickou vadu – výrazně snižuje očekávanou dobu dožití a kvalitu života  molekulární podklad orgánových změn (jedná se jakoby o odbočky z glykolýzy, protože je hyperglykémie a ta to umožňuje) - polyolová cesta  glukosa se aldosareduktasou přemění na sorbitol (aldosareduktasa, NADPH- NADP+)  sorbitol se oxiduje na fruktosu (NAD-NADH)  polyolová cesta normálně slouží k odstraňování toxických aldehydů  v tomto případě ale zvýšeně spotřebovává redukované koenzymy NADPH, tedy nedochází k dostatečné regeneraci glutathionu a tedy stoupá intracelulární oxidační stres  kromě toho vzniká sorbitol, který nemůže procházet buněčnou membránou a tak vzniká edém - hexosaminová cesta  Glc  Glc-6-P  Fru-6-P  vznik glukosamin-6-P (glutamin-fruktosa-6-P amidotransferasa = GFAT, glutamin se přeměňuje na glutamát)  glukosamin-6-P pak dává vzniknout UDP-N-acetyl-glukosaminu  ten se váže na serinová a threoninová rezidua a modifikuje transkripční faktory  následkem této modifikace dochází ke zvýšení exprese prozánětlivých a prokoagulačních faktorů - cesta proteinkinasy C  Fru-6-P  glyceraldehyd-3-P  DHAP  glycerol-P  DAG  PKC  účinky proteinkinasy C - ↓ eNOS, ↑ ET-1 – endoteliální dysfunkce, hypertenze - ↑ VEGF (vascular endotelial growth factor) – angiogeneze (jen v některých orgánech, např. sítnice – retinopatie) - ↑ TGF-β – tvorba kolagenu a fibronektinu – okluze kapilár - ↑ PAI-1 (inhibitor aktivátoru plazminogenu) – snížení fibrinolýzy, okluze cév – prokoagulační stav (jakoby) – obojí vede k omezení krevního toku, zánětu a ischémii - ↑ NF-κB – exprese genů prozánětlivých cytokinů - ↑ NADPH oxidas – vzestup ROS a oxidativní poškození tkání  efekt na cévy je vazokonstrikce, okluze, prokoagulační stav – ischémie  globální účinek je zánětlivý a poškození proteinů a DNA - tvorba superoxidu  hyperglykémie způsobuje nadbytek redukovaných koenzymů, proto je blokován komplex III v mitochondriích – koenzym Q zůstává redukovaný a dochází ke vzniku superoxidu  superoxid aktivuje jaderné PARP (polyADPribosapolymerasa) a ta způsobí inhibici GAPDH, tedy nedochází k dehydrogenaci glyceraldehydfosfátu na 1,2- difosfoglycerát  akumulují se proto metabolity glykolýzy a dochází k aktivaci poškozujících cest (řečených nahoře) – endoteliální dysfunkce, vznik diabetických cévních komplikací apod.  experimentální léčbou je inhibitor PARP - cesta AGEs  glyceraldehyd-3-P  methylglyoxal  AGEs, produkty pokročilé glykace  následkem je zvýšená tvorba NF-κB, IGF-1, PDGF, adhezivních molekul, buněčná proliferace, zvýšená permeabilita cév, migrace makrofágů a tvorba endotelinu  dlouhotrvající hyperglykémie vede k pozdním komplikacím  poškození zraku - nahromaděním sorbitolu v oční čočce dochází k zadržování vody, která omezuje transparentnost čočky (zakalení čočky, katarakta) - kromě toho v důsledku mikroangiopatie dochází ke změnám na sítnici a retinopatii (také způsobeno angiogenezí, mikroaneurysmaty nebo krvácením do sklivce)  zhoršení vedení vzruchů neurony - nahromadění sorbitolu ve Schwannových buňkách a v neuronech narušuje vedení axonem (polyneuropatie) a poškozuje především vegetativní řízení, reflexy a čití - buňky produkují proti edému kompenzačně myoinositol, který jim pak ovšem chybí pro jiné funkce - též způsobeno AGEs – na základě neuropatie pak vzniká diabetická noha  oslabení imunitního systému - buňky, které neabsorbují v dostatečné míře glukosu, se v důsledku extracelulární hyperosmolarity svrašťují - u leukocytů vede svrašťování k omezení jejich funkce, jako je například tvorba superoxidů, důležitá pro imunitní obranné reakce - pacienti s diabetem vykazují zvýšený sklon k infekcím, jako například infekce kůže (furunkl) nebo ledvin (polynefritis) - infekce potom zvyšují potřebu inzulinu, protože vedou k většímu uvolňování jeho antagonistů  tromboembolické komplikace - hyperglykemie podporuje tvorbu plazmatických proteinů obsahujících sacharidy (fibrinogen, haptoglobin, α2-makroglobulin, koagulační faktory V a VIII) - takto se může zvýšit pohotovost ke srážení, viskozita krve a tím i tromboembolické riziko - dále je zvýšená tvorba PAI-1 (těž trombotický stav)  ledviny – nefropatie - selhávání ledvin následkem AGEs - v ledvinách vzniká glomerulosklerosa (Kimmelstielův-Wilsonův syndrom), která může vést k proteinurii, poklesu GF zánikem glomerulů, hypertenzi a insuficienci ledvin - na základě vysoké koncentrace amk v plazmě vzniká hyperfiltrace dosud intaktních glomerulů, které jsou tím rovněž poškozeny  kardiovaskulární systém - mikroangiopatie  vazbou glukosy na volné aminoskupiny proteinů a následným nevratným přeskupením vznikají AGEs (advanced glycation end products), které se více vyskytují ve stáří  AGEs se váží na receptory buněčné membrány a mohou tím podporovat ukládání kolagenu v bazálních membránách cév  tvorba pojivové tkáně je částečně stimulovaná TGF, navíc vlákna kolagenu mohou být měněna glykosylací  obojí změny způsobují ztluštění bazálních membrán se sníženou propustností a zúžením lumina (mikroangiopatie)  následkem jsou retinopatie, neuropatie, nefropatie, poškození arterií (zeslabení cévní stěny, změny cévní propustnosti a aterosklerosa) - makroangiopatie  uzavření periferních cév  hypertenze podporuje, ve spojení se vzestupem VLDL v krvi a zvýšenou koagulační pohotovostí, vznik makroangiopatií, které mohou vést k dalšímu poškození ledvin, srdečnímu a mozkovému infarktu a k uzavření periferních cév  CNS - hromadění AGEs v pyramidových buňkách – Alzheimerova choroba  játra – jaterní cirhóza  klouby – revmatoidní artritida  přenos kyslíku - chronická plicní onemocnění - reakce s hemoglobinem  glukosa může reagovat s hemoglobinem HbA na HbA1c, jehož zvýšená koncentrace v krvi nasvědčuje už déle trvající popřípadě opakované hyperglykémii (glykovaný hemoglobin)  HbA1c vykazuje vyšší afinitu ke kyslíku než HbA a proto jej na periferii hůře uvolňuje  trvající nedostatek inzulinu vede k poklesu 2,3-bisfosfoglycerátu (BPG) v erytrocytech, jenž jako alosterický regulátor Hb snižuje jeho afinitu ke kyslíku  nedostatek 2,3-BPG má tedy za následek zvýšenou afinitu HbA ke kyslíku  těhotenství - u diabetických rodiček se vy větší míře rodí hypertrofičtí novorozenci – následkem zvýšené koncentrace amk v krvi, která by mohla vyvolat větší sekreci somatotropinu (STH)  peritoneum - u pacientů se selháním ledvin, léčených peritoneální dialýzou vznikají AGEs v peritoneální membráně  amyloidosa spojená s dialýzou - modifikace β2-mikroglobulinu v amyloidových depozitech – kostní a kloubní destrukce  při selhávání ledvin se často před proteinurií objeví albuminurie – selektivní proteinurie - albumin je v malém množství vylučován i fyziologicky – tubulární kapacita resorpce je už při fyziologických hodnotách albuminu vyčerpána - časná diagnostika poruchy glomerulární filtrace, důležitá zejména u pacientů s DM2 - mikroalbuminurie jsou ztráty malých množství albuminu – 30-300mg/den - stanovení v moči  sbírané přes noc <100μg/min je reverzibilní poškození  v první ranní poměr albumin/kreatin – 2,8-22,8 g alb/mol kreat  třeba vyloučit uroinfekci  další diabetické komplikace - diabetická nefropatie – glomerulosklerosa (difusní, nodulární)  zvětšení ledvin, vzestup glomerulární filtrace  stadium mikroalbuminurie  stadium makroproteinurie – postupný pokles glomerulární filtrace  renální syndrom, nefrotický syndrom  bez specifické léčby, léčíme hypertenzi (téměř všichni pacienti s DM1 po 20 letech mají DN) - diabetická retinopatie  70% po 15 letech DM, 5% slepých  neproliferativní forma - mikroaneurysmata, drobná krvácení, edém, exsudáty  preproliferativní forma – plošná krvácení, avaskulární úseky, intraretinální mikrovaskulární abnormality (a-v spoje)  proliferativní forma – novotvorba cév, gliální proliferace, fibrosa, krvácení do sklivce  makulopatie – edém, ischémie - diabetická neuropatie  somatická – distální senzorická (DK), smíšená periferní (+ motorická), proximální motorická, mononeuropatie (n. VI, n. ulnaris)  autonomní – sympatická eferentní (posturální hypotenze atd.), motilita GIT, urogenitální poruchy - diabetická noha – neuropatie, angiopatie vedoucí k ulceraci, gangréně (často přes vysoký plantární tlak + infekce) - diabetes a hypertenze – prevalence dvojnásobná, mortalita na kardiovaskulární choroby spojené s hypertenzí 3x vyšší než u lidí bez DM 16. Karbonylový stres a jeho úloha v patogenezi dlouhodobých komplikací diabetu, aterosklerózy a renálního selhání ________________________________________________________________________________________________________ Karbonylový stres  zvýšení reaktivních karbonylových sloučenin vede k postupným orgánovým poškozením  může být způsobeno jejich zvýšenou tvorbou nebo jejich sníženým odbouráváním (chyba eliminace – aldehyddehydrogenasa) a následným vylučováním  karbonylové sloučeniny mají velmi blízký vztah k oxidačnímu stresu, hyperlipidémii a hyperglykémii  mezi karbonylové sloučeniny patří glyoxal, glykoaldehyd, hydroxynonenal, methylglyoxal, 3-deoxyglukoson, malondialdehyd  vznik - autooxidace sacharidů, polynenasycených mastných kyselin, askorbátu - neoxidační degradace fosfátů cukrů (např. při tvorbě AGEs z Amadoriho produktů) - mohou vznikat jak ze sacharidů, tak Schiffovy baze, tak Amadoriho produktů během tvorby AGEs  eliminace - exkrece ledvinami - enzymatická cesta  specifické reduktasy - aldosoreduktasu, aldehyddehydrogenasu a glyoxalasu  všechny tyto enzymy potřebují pro svou funkci redoxní koenzymy (GSH, NADPH, NADH)  působení - neenzymatická reakce s aminoskupinami proteinů a vznik AGEs (Maillardova reakce) - neenzymatická reakce s lipidy a vznik ALEs (advanced lipoperoxidation end products)  v důsledku zvýšení koncentrace karbonylových sloučenin dochází k mnoha tkáňovým poškozením  komplikace při diabetes mellitus - chronické změny u diabetu jsou následkem hyperglykemie, která vede ke zvýšené glykaci proteinů a následnému oxidačnímu a karbonylovému stresu - tento mechanismus ovšem není jediný, který vede k orgánovým poškozením při diabetu  je třeba si uvědomit, že komplikace při diabetu nevznikají jen působením jednoho mechanismu  jedná se o komplexní a do jisté míry kaskádovitý proces, jenž je značně propojen - mezi komplikace u diabetu se řadí následující změny  metabolické změny - neenzymová glykace (Maillardova reakce) - intracelulární hyperglykemie  ve tkáních, kde není třeba inzulin (oční čočka, nervová tkáň, ledviny) vede hyperglykemie ke zvýšenému obsahu glukosy v buňkách  glukosa se metabolizuje na sorbitol a fruktosu a to vyvolá hyperosmolaritu buněk  tím vzniká osmotické poškození buňky  sorbitol také poškozuje iontové pumpy, což vede k neuropatiím a aneurysmatům v sítnici  makrovaskulární komplikace - urychlený rozvoj aterosklerosy - vede k ICHS, ICHDK (chronická ischemická choroba dolních končetin)  mikrovaskulární komplikace - nefropatie (vede k selhávání ledvin)  depozita v bazální membráně, bazální membrána ztluštěna  změna náboje  sekrece růstových faktorů  zvýšení vaskulární permeability  zhuštění a zmnožení mesangiální matrix  modifikace proteinů cévní stěny, crosslinking  glykace a oxidace LDL částic  poškození endotelu – glykace kolagenu  dochází k progresi renální insuficience a následné urémii - retinopatie  neproliferativní forma (mikroaneurysmata, drobná krvácení, exsudáty, edém)  preproliferativní forma (avaskulární úseky, plošná krvácení)  proliferativní forma (tvorba nových cév, fibrosa, krvácení do sklivce)  ostatní komplikace - diabetická noha  vzniká v podstatě na základě neuropatie a současného postižení malých a velkých cév  vznikají otoky, vředy  do místa se mohou dostat infekce, dochází k nekróze tkáně a gangréně - diabetická neuropatie - hypertenze  komplikace při chronickém selhání ledvin - karbonylový stres poškozuje ledviny prostřednictvím AGEs, ALEs sloučenin, které modifikují biologické struktury (viz poškození vlivem AGEs) nebo dochází k diabetické nefropatii - ve výsledku toto vede k narušení funkce ledvin (vylučování katabolitů, regulace iontové, vodní a acidobazické rovnováhy) - amyloidosa spojená s dialýzou  β-2-mikroglobulin, který je součástí amyloidových depozit, je vlivem oxidačního a karbonylového stresu modifikován a postupně dochází k přitahování monocytů a makrofágů a tvorbě cytokinů - karbonylový stres má také význam v peritoneální dialýze  dochází k autooxidaci glukosy na dikarboxylové sloučeniny, což následně vede ke vzniku AGEs a následnému selhání peritoneální dialýzy  tomu lze předejít separací glukosy od elektrolytového roztoku - karbonylový stres je velmi charakteristický pro chronické selhání ledvin s následnou dialýzou - urémie vede vlivem karbonylového a oxidačního stresu (narušené rovnováhy) ke vzniku  karbonylových sloučenin (glyoxal, glykoaldehyd, metylglyoxal, deoxyglukoson)  produktů radikálových reakcí (hydroxyperoxidy, NO, ox-LDL)  konečných produktů vzniklých oxidačním a karbonylovým stresem (AOPP – advanced oxidation protein products, AGEs – advanced glycation end products, ALEs – advanced lipoperoxidation end products)  tyto způsobují - snížení clearance reaktivních forem dusíku a kyslíku - snížení antioxidační ochrany (enzymy a jejich kofaktory, antioxidační vitaminy, deplece thiolů, hypoalbuminémie – souvislost s malnutricí) - MIA syndrom (malnutrition, inflamation, atherosclerosis)  komplikace při aterosklerose - aterosklerosa je patobiologický pochod, při němž dochází k poškozování cévní stěny a vzniku ateromových ložisek - oba tyto mechanismy postupně způsobí uzávěr tepny a následné ischemické poškození tkáně - na patogenezi aterosklerosy má vliv mnoho po sobě jdoucích procesů - karbonylový stres působí při vzniku následovně  lipoproteinové částice (LDL, VLDL) cirkulující v krvi pronikají do subendotelového prostoru intimy  tyto částice mohou být modifikovány glykací, oxidačním stresem a karbonylovým stresem  vzniká glykovaný LDL, glyko-oxidovaný LDL, oxidovaný-LDL - všechny tyto částice interagují s proteoglykany v mezibuněčné matrix intimy a způsobují tak strukturní modifikace proteinů a crosslinking (zesíťování) - zvětšuje se množství extracelulární matrix a tím dochází ke ztluštění endotelu - dále dochází k poškození endotelu a zvyšuje se prokoagulační aktivita (adheze a agregace trombocytů) - v daném místě vzniká zánět a objevují se protizánětlivé faktory (TNFα, IL-1) - dále nastává blokace syntézy NO, což snižuje vlastní vazodilataci cévní stěny  další důležitou roli v rozvoji aterosklerosy mají makrofágy - makrofágy mají na svém povrchu tzv. scavenger receptor - tímto receptorem je zajištěna akumulace LDL-částic a cholesterolu v makrofázích - jednoduše řečeno pohlcují tyto částice a tím se mění na pěnové buňky - pěnové buňky uvolňují lipidy extracelulárně (tvorba ateromového plátu) a produkují růstové faktory pro buňky hladkého svalstva - dále uvolňují kyslíkové radikály a hydrolasy, které způsobují další modifikaci proteinů - modifikované LDL-částice mají chemotaktické účinky na monocyty (podporují expresi VCAM a dalších adhezivních proteinů v buňkách hladké svaloviny) - v dalším kroku se takto přivolané monocyty zachycují a pronikají do cévní stěny, kde se mění v makrofágy, které se následně mění v již zmíněné pěnové buňky - takto vzniká ateromový plát - uvnitř ateromového plátu postupně dochází k nekróze pěnových buněk, což může způsobit narušení a rozpad plátu - takto může vznikat trombus a s ním související komplikace  terapeutické možnosti redukce karbonylového stresu - v dnešní době se u používaných látek předpokládá schopnost zasáhnout do tvorby produktů karbonylového stresu - mezi nejčastěji udávané látky patří Aminoguanidin, který brání zesíťování - reakce probíhá atakem nukleofilní hydrazinové skupiny na karbonyl - vznikají tzv. hydrazony - vzhledem k úzké souvislosti oxidačního a karbonylového stresu můžeme podávat antioxidační léčbu např. vitamin E, GSH, lipoová kyselina a jiné 21. Pravidla sbalování bílkovin k dosažení nativní konformace ________________________________________________________________________________________________________  konformační změna - je změna sekundární, terciální nebo kvartérní struktury proteinů, aniž by se změnila struktura primární - sbalování proteinu je sled konformačních přeměn, který umožňuje polypeptidovému řetězci zaujmout biologicky aktivní strukturu - ke sbalování dochází během translace i in vitro při renaturaci - jedná se o proces velmi komplexní a o zákonitostech jeho průběhu zatím nejsou dostatečně známé informace - zatímco jednořetězcové bílkoviny se obvykle svinuj do své nativní struktury samovolně, kdy je proces sbalování dán primární strukturou, větší komplexní bílkoviny někdy potřebují ke správnému svinutí pomocnou bílkovinu, tzv. chaperon - když ke konečné konformaci dochází samovolně, je to snaha o zaujetí nejnižšího energetického stavu pro danou primární strukturu v daném fyziologickém prostředí a v přijatelném časovém úseku - podléhá určitým pravidlům, dosud není zcela objasněna  peptidická vazba - má částečně dvojný charakter – kratší než jednoduchá vazba, delší než dvojná - není možná rotace jako u jednoduché vazby - existence ve dvou možných konformacích – cis a trans - ostatní nepeptidové jednoduché vazby rotovat můžou - výpočet možných sekundárních struktur  2 základní sekundární struktury stabilizované vodíkovými můstky - α-helix má 1-4 vnitrořetězcové vodíkové můstky - β-skládaný list má vodíkové můstky mezi dvěma řetězci  u obou pak nacházíme ještě spojovací úseky, které mají jiný charakter (otočky, smyčky)  postranní řetězce - elektrostatické síly  iontové  dipól-dipól interakce (Van der Waalsovy síly)  vodíkové můstky - hydrofobní síly  změna uspořádání vody – hydrofobní úseky u sebe  voda má možnost větší neuspořádanosti (systém směřuje k neuspořádanosti)  hydrofobní síly jsou hlavním impulzem ke sbalování proteinů při 2D konformaci se uvolňují 2/3 obalové vody, při 3D konformaci další 1/3 obalové vody - stabilizace pomocí disulfidických můstků  problematika sbalování proteinu - dnes známe primární strukturu asi 100 000 bílkovin, terciární struktura je objevena asi u desetiny z nich - problém sbalování proteinů není jednoduchou záležitostí, protože protein vystřídá několik konformací, než se stane funkčním - princip samosbalování není úplně jednoduchý, protože by trval příliš dlouho a produkty by zřejmě ihned reagovaly s dalšími látkami v cytoplasmě a vznikla by tak nerozpletitelná směska - Afinsenův postulát  nativní prostorové uspořádání bílkoviny je určeno samotným pořadím aminokyselin v jejím řetězci (primární struktura)  nejvýznamnější roli hrají aminokyseliny proteinového jádra a hydrofobní interakce mezi nimi  rychlost sbalování odpovídá tomu, jak jsou od sebe vzdálené aminokyseliny, které na sebe vzájemně působí  interagují-li spolu aminokyseliny, které spolu v řetězci sousedí, probíhá sbalování rychleji  naopak je-li pro sbalení potřebná interakce mezi vzdálenými aminokyselinami, bude probíhat pomalu - Levinthalův paradox  sbalování proteinu je řízeno termodynamicky – protein se sbaluje do energeticky nejvýhodnější konformace (odpovídající příslušnému minimu volné energie)  toto sbalování ale nemůže probíhat zcela náhodně, protože možných konformací je ohromné množství (řetězec 100 amk, 3 konformační stupně pro každou amk např.)  kdyby měl protein postupně procházet mnoha možnými konformacemi, trvalo by sbalování mnohem déle, než ve skutečnosti pozorujeme – řečený paradox - nativní struktura vzniká termodynamicky, avšak jejímu vzniku předchází vytvoření několika meziproduktů, jejichž vznik je řízen kineticky - sbalování začíná v tzv. nukleačních centrech – částech polypeptidového řetězce, které mají uspořádanější strukturu - nukleační centra se sbalí jako první tím je určeno další sbalování proteinu a výrazně snížen počet možných konformací, které může protein během sbalování zaujímat  domény jsou pak kompaktně zformované globulární části bílkovin v zásadě nezávislé na struktuře ostatních částí molekuly  molten globule = meziprodukt se specifickými vlastnostmi, kompaktní útvar s vysokým množstvím nativních sekundárních struktur s fluktuující terciální strukturou  kvůli fluktuacím během sbalování vznikají v různých fázích určité části řetězce, jež jsou nestabilní, avšak slouží jako kostra pro další sbalování  fáze sbalování proteinů - časná fáze  hydrofobní kolaps  následná kondenzace polypeptidového řetězce  vznik sekundárních struktur - jsou pozorovány mikrostruktury, které přežívají denaturaci a jsou možným základem nukleačních center (hydrofobní shluky) - časnou fází vzniká heterogenní populace částečně sbalených meziproduktů, které jsou ve fluktuující rovnováze a mohou mít multimerní charakter - střední a pozdní fáze  pozorována tvorba vazebných míst pro substráty a ligandy  přesné uspořádání sekundární struktury, správné sbalení hydrofobního jádra  uspořádání podjednotek u oligomerů  přeskupení disulfidových vazeb - krok který výrazně zpomaluje přeskupení disulfidových vazeb je izomerizace prolinu  sbalování proteinů in vivo - objev molekulárních chaperonů - chaperony interagují se vznikajícími proteiny a zabraňují jejich nesprávnému ustálení a následnému sražení - chaperony nenesou informaci, která by vedla k jiné konformaci, než je ta nesená sekvencí amk - chaperony se nejsou schopny vázat na úplně rozbalený polyproteinový řetězec - zatímco malé jednořetězcové bílkoviny jsou schopny se sbalit samovolně, větší molekuly komplexních bílkovin potřebují ke správnému sbalení chaperony  shrnutí známých faktů - vztah mezi primární strukturou a skládáním - rozrušení nativního stavu – změna teploty, pH, mechanické porušení (denaturace...) - špatné skládání a neurodegenerativní choroby - efekt vnějších faktorů na skládání proteinů - Levinthalův paradox a kinetika 22. Úloha chaperonu, proteasomu a lysosomu, stres endoplazmatického retikula buňky ________________________________________________________________________________________________________ Chaperony  proteiny, podílející se na sbalování dalších bílkovin - pomáhají bílkovinám správně se sbalit (najít nativní konformaci), někdy mohou umožnit bílkovině se i rozbalit - zabraňují bílkovinám svinout se předčasně - zabraňují intermolekulárním interakcím ještě nesbalených bílkovin a tím jejich precipitaci  jsou to ATPázy, které jsou nespecifické ke svým ligandům  dříve byly označovány jako stress proteins nebo heat shock proteins  syntéza nastává při celulárním stresu – změny teploty, chladu, vlivem detergens, změnou pH, iontové síly, účinkem toxických látek (snad i některých potravin)  jejich syntéza je obranou proti účinkům stresových faktorů  glucose regulated proteins jsou pak chaperony v endoplazmatickém retikulu (cold shock proteins)  účinky chaperonů - molekulární - rozpoznávají patologický protein, váží se na hydrofobní povrch, inhibují agregaci, zejména. heat shock proteiny – vznik při tepelném poškození - chemické – upravují podmínky uvnitř buňky, stabilizují proteiny proti tepelné a chemické denaturaci - farmakologické – váží se na specifickou konformaci a stabilizují ji, prevence před proteasomální degradací  chaperony nenesou informaci, která by vedla k jiné konformaci, než je ta nesená amk sekvencí  nejsou schopny se vázat na úplně rozbalený polyproteinový řetězec  příklady hlavních chaperonů - ubikvitin a HSP8  regulují degradaci cytoplazmatických proteinů  aktivace molekuly ATP vede k navázání na lysinový zbytek proteinu  takto ubikvitinovaný protein se vsune do kavity vhodného proteasomu, kde se degradace realizuje  degradace asi 30% nově vzniklých polypeptidů a proteinů – při prvním foldingu se utváří velké množství chybných intermediátů, které musí být pro udržení homeostázy v buňkách zničeny - HSP32  enzym hemoxygenasa  oxiduje hemovou část Hb na bilirubin  reguluje správnou koncentraci NADPH v buňkách  rozhoduje o antioxidační metabolické ochraně buněk - HSP28  crystallin  reguluje apoptosu a reorganizaci filament - HSP70  nejdůležitější veliký chaperonový komplex, největší v eukaryotických buňkách  obsažen hlavně v cytoplasmě, endoplasmatickém retikulu a v mitochondriích  pomáhá opravovat špatně uspořádané nascentní nebo již starší hotové polypeptidové řetězce Proteasomy  bílkovinné komplexy s proteasovou aktivitou  mají je eukaryota i prokaryota, v jádře i cytosolu  jsou složeny ze dvou podjednotek – katalytické a regulační  slouží k degradaci intracelulárních proteinů, nejčastěji těch informačních, signálních  rozpoznávají polyubikvitinylované proteiny a vtahují je do svého nitra  v proteasomu v jakémsi minimixéru dojde k odštěpení polyubikvitinů, protein je dále rozštěpen na krátké oligopeptidy, které jsou spolu s ubikvitiny vypuštěny ven do cytosolu  některé proteiny jsou však v proteasomech degradovány bez předchozího označení ubikvitinem, musí být ale přítomen jiný specifický signál anebo zprostředkující protein  inhibice činnosti proteasomů je zajišťována ubistatiny, ty se váží na polyubikvitiny daných proteinů  význam proteasomů - odklízení starých bílkovinných molekul - imunitní – účast v procesu rozpoznání antigenních struktur (rozklad Ag pro následující prezentaci) - regulace buněčného cyklu - význam v apoptose  proteasomy mají i své endogenní inhibitory – počítá se s nimi k využití v terapii nádorů  inhibice proteasomů umožní apoptosu buněk potlačením aktivity nukleárního faktoru NF-κB, který má silné proliferační účinky  jde o to, že inhibitor faktoru NF-κB přestane být degradován a tím dojde k inhibici samotného faktoru  dále inhibice proteasomů způsobí zvýšení aktivity strážného proteinu p53  u neurologických onemocnění spojených s hromaděním proteinových komplexů (Alzheimerova choroba, Parkinsonova nemoc, Huntingtonova chorea) je naopak žádoucí činnost proteasomů podporovat  ubikvitin proteasomový systém - významnou roli v tomto protein-degradačním systému hraje malý protein (76 amk) ubikvitin, sloužící k značení proteinů v ději zvaném ubikvitinace - ubikvitinace  ubikvitin je v buňce nejprve vázán (aktivován) za spotřeby ATP tzv. ubikvitin aktivujícím enzymem E1  následně je přenesen na ubikvitin-přenášející nebo ubikvitin-konjugující enzym E2  další přesun ubikvitinu na protein, který má být degradován (dále PDG, nebo na vytvářející se řetězec ubikvitinů na PDG) je podmíněn ubikvitin ligasou E3, jež dokáže specificky rozpoznat proteiny, které mají být degradovány  nejprve je na PDG navázán jeden ubikvitin, na něj druhý atd.  v buňkách je málo E1 a E2 ale naopak rozmanité množství E3, pro různé skupiny proteinů určených k degradaci  způsob vazby ubikvitinů - nejběžnější způsob vazby dvou ubikvitinů v polyubikvitinovém řetězci je přes lysin 46 (tzv. K48 řetězce) nebo lysin 63 (tzv. K63 řetězce), existují však i jiné řetězce, výjimečně i rozvětvené - za rozsudek smrti jsou považovány zejména K48 řetězce, zatímco K63 hrají roli hlavně v buněčné signalizaci, ale i ony mohou být rozpoznány a degradovány v proteasomech - deubikvitinace  dochází k ní též v eukaryotní buňce  enzymy zodpovědné za tento děj se nazývají deubikvitinasy (DUB) a lze je dělit na 5 skupin - ubikvitin C-terminální hydrolasy - ubikvitin specifické proteasy - proteasy s doménou Machadovy-Josephovy nemoci - proteasy z vaječníkových tumorů - proteasy s JAMM doménou  dnes je známo 75 DUBů, které interagují se stovkami proteinů a hrají v eukaryotní buňce nesmírné množství různých rolí  jedna z JAMM deubikvitinas hraje roli při správném fungování eukaryotního proteasomu (Poh1) - proteasom  protein, který na sobě nese K48 řetězec může být rozpoznán tzv. 26S proteasomem a degradován v něm  26S je běžný typ proteasomu v našich buňkách, má dvě základní části - 20S proteasom neboli hlavní partikule (core particle) – tvar válce, probíhá v ní samotná proteolýza PDG - 19S proteasom neboli regulační partikule (regulatory particle) – nezývá se též PA700  hlavní partikule - čtyři prstence – dva vnější ze 7α podjednotek a dva vnitřní ze 7β podjednotek - aktivní místa štěpící proteiny jsou v β-prstencích a jsou obráceny dovnitř válce proteasomu, konkrétně to jsou podjednotky  β1 = aktivita podobná kaspasám  β2 = aktivita podobná trypsinu  β5 = aktivita podobná chymotrypsinu - kromě běžného 20S proteasomu existují u nás též inducibilní proteasomy s jinými aktivními místy – imunoproteasomy nebo směsné proteasomy - ty hrají roli v imunitní odpovědi buněk na cizorodé látky - zcela speciální typ existuje v brzlíku – thymoproteasomy, obsahující β5t podjednotku s neobvyklou aktivitou (souvislost se selekcí CD8+ buněk)  regulační partikule - vážou se na vnější α prstence 20S proteasomu - regulační částice obsahuje dvě základní navzájem spojené oblasti – bázi a víko - v bázi lze najít 6 rozdílných AAA+ ATPáz a další 4 podjednotky - hlavním posláním je regulace vstupu do nitra 20S proteasomu - víko obsahuje 9 ne-ATPázových podjednotek a základní funkcí je deubikvitinace ubikvitinovaných proteinů pomocí Poh1 před vstupem do nitra 26S proteasomu - degradace neubikvitinovaných proteinů  asi 20% všech proteinů štěpených proteasomy v eukaryotních buňkách, nemusí mát ubikvitinové značení  takové proteiny obsahují špatně uspořádaná místa ve svých strukturách a takový místa potom slouží jako nespecifický signál pro degradaci v proteasomech bez nutnosti ubikvitinace daného proteinu - degradace ubikvitinovaných proteinů  k rozpoznání jsou nutné některé podjednotky z baze (ubikvitinové receptory) a některé proteiny, které jsou jen dočasně asociovány s proteasomem  když je ubikvitinovaný protein již navázán na 26S proteasom, jeho polyubikvitinový řetězec může být proteasomem různě štěpen a znovu syntetizován pomocí deubikvitinas a ubikvitin ligas  snížení intenzity degradace samotných ubikvitinů v proteasomu souvisí s činností specifické DUB, nazývané Ubp6, která není stálou podjednotkou 26S proteasomů  před samotnou degradací PDG je však polyubikvitinový řetězec zpravidla odštěpen vcelku pomocí Poh1 a dále odstraňován jinými DUBy  rozplétání proteinu do primární struktury a jeho přesunutí do otvoru proteasomu je pak spojeno s hydrolýzou ATP AAA+ ATPázami  rozpletený protein může být skladován v α prstencích, pokud β prstence jsou ještě vytíženy degradací předchozího PDG  proteiny mohou přitom vcházet do 20S proteasomu z obou stran  degradace probíhá dokud vzniklé oligopeptidy nejsou dostatečně malé na to, aby difundovaly ven  jakmile se oligopeptidy dostanou ven z 26S proteasomů jsou v buňce dále štěpeny jinými peptidasamy až na aminokyseliny použitelné pro další proteosyntézu nebo v rámci imunitního systému jako antigeny - regulace aktivity proteinů  některé proteiny jsou proteasomy degradovány neúplně neboli naopak dojde k degradaci inhibitorů na nich vázaných  funkce proteasomů není tedy spojována jen s hladinou proteinů v buňce ale i s aktivitou mnoha z nich, např. transkripční faktory, signalizační proteiny  ubikvitin proteasomový systém hraje tedy klíčovou roli v mnoha terapeuticky významných procesech jako jsou zánětlivá onemocnění, neurodegenerativní procesy, svalové dystrofie, virové infekce nebo karcinogeneze Lysosom  sférické membránové organely vyskytující se u mnoha eukaryotních organisml  obsahují přes 50 typů enzymů (kyselé hydrolasy) sloužících rozkladu extra i intracelulárního materiálu (sacharidy, proteiny, lipidy a NK)  vnitřní pH 5,0-6,0 je udržováno protonovou pumpou v membráně lysosomu  vznikají zpravidla oddělením se z hladkého endoplazmatického retikula či Golgiho aparátu  rozlišujeme lysosomy - primární – váčky s enzymy, bez materiálu - sekundární – podstatně větší váčky, vznikající splynutím primárního lysosomu s fagosomem - terciární – obsahují zbytky materiálu, který už nejde rozložit, např. lipofuscin  autofagii využívá buňka k recyklaci vlastních opotřebovaných struktur  onemocnění na podkladě defektu lysosomů - vrozená  genetické poruchy jejich enzymů či regulačních proteinů – dochází k postupnému hromadění materiálu, zejména v CNS a makrofázích  asi 40 chorob s frekvencí 1:100 000 porodů, většinou neléčitelné  Fabryho choroba (léčitelná podáním chybějící α-galaktosidasy)  Niemann-Pickova choroba, Tay-Sachsova choroba, Gaucherova choroba, Pompeho choroba - získaná  většinou jen relativní poruchy z nadbytku přijímaného materiálu  často u makrofágů, např. foamy cells při aterosklerose, ale postiženy mohou být i hepatocyty, epitel buněk proximálních tubulů ledvin  při dně jsou membrány lysosomů rozrušovány krystalky kyseliny močové, což vede k uvolnění enzymů, které se projeví kloubní zánětlivou reakcí Stres endoplazmatického retikula  soubor všech možných vlivů, které vyvádějí endoplazmatické retikulum z homeostázy, což se projeví zejména hromaděním proteinů, které neprošly protein foldinfem  jako odezva se spustí signální dráhy, které se souhrnně označují jako unfolded protein response (UPR)  výsledkem je zpomalení translace mRNA, degradace malfoldovaných proteinů, zvýšení exprese chaperonových genů a udržení oxidativního prostředí v ER  v případě selhání regulačních mechanismů je spuštěna apoptosa  běžná funkce ER - za fyziologických podmínek je během translace mRNA vznikající polypeptid označen a celý komplex ribosom-polypeptid-mRNA odeslán na vhodné místo v ER, kde je polypeptid dotvořen - je provedena N-glykosylace a oxidativní prostředí ER zaručí vznik disulfidických můstků (-SH + -SH  -S-S- + 2H + + 2e - ) - pokud dojde k malfoldingu a protein je sbalen špatně, ohrožuje celé endoplazmatické retikulum, protože indukuje nabalování dalších malfoldovaných proteinů - tomu je zabráněno navázáním chaperonů jako Grp78 (glucose regulated protein) a protein je tak určen k degradaci (ERAD – endoplasmic reticulum associated degradation)  stresové signalizační dráhy - MERK kinasa (elF2 kinasa) - kinasová rodina zahrnující Ire1 – spouští dvě formy odpovědi  exprese chaperonových genů, mimo jiné i Grp78, které zaručí, že proteiny zůstanou v unfoldovaném stavu a nebude docházet k malfoldingu  k expresi dochází pomocí translace mRNA transkripčního faktoru XBP1  vazba a udržení Ca 2+ v ER - transkripční faktor ATF6 (activating transcription factor) – ovlivňuje expresi mRNA XBP1  spuštění apoptosy - není ještě řádně vysvětleno, předpokládají se dvě cesty  pomocí transkripčních faktorů, patrně Ire1 by mohlo upregulovat transkripční faktor GADD153/CHOP, který ovlivňuje rovnováhu mezi Bcl-2 a Bax  pomocí kaspas, patrně casp-12 23. Mechanismus prionových onemocnění ________________________________________________________________________________________________________  prion je z anglického protainaceous infectious particles  jedná se o infekční částice, tvořené pouze molekulou bílkoviny  prionovou teorii formuloval v roce 1982 Stanley Prusiner, který obdržel v roce 1997 Nobelovu cenu  priony jsou původci neurodegenerativních onemocnění lidí i zvířat  charakteristika prionů - za fyziologických podmínek je v lidském mozku prion produktem genu PRNP na 20. chromosomu – protein PrP (PrionProtein), konkrétně PrPC (C-cell), normální, divoká forma - jeho fyziologická funkce je nejasná, zřejmě se podílí na synaptickém přenosu a diferenciaci buněk - patogenní priony mají stejnou primární strukturu (pořadí amk), ale liší se svým konformačním uspořádáním - zatímco divoký PrPC má výraznou převahu α-helixu a asi jen 5% β-skládaného listu, patogenní PrPSc (Sc-scrapie) mají zastoupení β-skládaného listu až 40% - proč aberantní priony PrPSc vznikají je stále nevyřešenou otázkou - mohou pravděpodobně vznikat mutací genu PRNP nebo přeměnou prostorového uspořádání nepatogenního prionu po setkání s patogenním - patogenní priony jsou extrémně odolné proti fyzikálním a chemickým vlivům, z čehož plynou obtíže se sterilizací (dělal se pokus se spálením mozku postižených zvířat při 600°C, popelem se infikovala asi 1/3 exponovaných zvířat) - mezi vysoce infekční patří oko, mozková a míšní tkáň  onemocnění - prionové choroby působí patogeny, které jako jediné neobsahují nukleovou kyselinu - mohou být sporadické, geneticky podmíněné nebo infekční (a to i iatrogenně) - přítomnost defektních proteinů vyvolává onemocnění souborně nazývané jako spongiformní encfalopatie - jde o degenerativní onemocnění nervové soustavy, kdy mozek postupně nabývá houbovitého vzhledu v důsledku tvorby miniaturních otvůrků - lidská prionová onemocnění  Creutzfeldt-Jakobova nemoc (CJD) - velmi vzácné onemocnění ze skupiny transmisivních spongiformních encefalopatií - příčinou je vznik patologické bílkoviny v mozku některých lidí - prionová bílkovina se u CJD dostane do buněk mozku a v nich se zachová jako virus - postižené buňky jsou nakonec tak zaplněny prionovými bílkovinami, že prasknou a odumřou - sporadická CJD  má incidenci 1-2:1000 000  v ČR každoročně umírá více než 10 pacientů na tuto formu CJD  obtíže nastupují kolem 65. roku věku  onemocnění probíhá jako prudce progredující demence (v rozmezí 2-3 měsíců), objevuje se ataxie, myoklonus  nemocný umírá do 5-12 měsíců od prvních příznaků - iatrogenní CJD  objevovala se u pacientů léčených lidským růstovým hormonem z kadaverosních hypofýz (dnes se již připravuje rekombinantně), přenosem tvrdé pleny, perikardu či rohovky  riziko existuje i u neurochirurgických výkonů přenosem prostřednictvím instrumentária  přenos prionů je zřejmě možný i transfuzí - familiární CJD  je genetickou formou s mutací v genu PRNP a neuropsychiatrickou symptomatologií - nová varianta CJD  je charakterizována psychiatrickými příznaky (úzkostí, depresemi, změnami chování), progresivním mozečkovým syndromem, myoklonem, choreou a dalšími neurologickými příznaky  na rozdíl od sporadické formy je průběh pomalejší a postihuje mladší věkové skupiny  přenos je pravděpodobně alimentární z masa zvířat s BSE  inkubační doba je více než 10 let, na celém světě na ni zemřelo asi 200 lidí  Kuru - nákaza se vyskytovala zejména u domorodých kmenů na Nové Guinei, které provozovaly rituální kanibalismus - po několikaleté inkubaci se u nemocných objevil třes, ataxie, imobilita a následná smrt - po potlačení kanibalismu zmizela i nemoc  Alperova nemoc  Gerstmannův-Sträusslerův-Scheinkerův syndrom  fatální familiární insomnie  sporadická fatální insomnie - zvířecí prionová onemocnění  bovinní spongiformní encefalopatie (BSE – nemoc šílených krav) - u skotu pozorována poprvé v roce 1986 - o 10 let později také popsána nová varianta CJD - stoupá počet důkazů o podobnosti původce BSE a nové varianty CJD - nemocí šílených krav se nazývá proto, že v pozdních stádiích vyvolává u zvířat zvláštní chování - makroskopický nález na mozku (pórovatění) v pozdějších stádiích připomíná houbu (spongiformní = houbotvárné) - variantou BSE by mohlo být (dle předpokladů) onemocnění ovcí (scrapie) - inkubační doba je několik let, zatím není důkaz (resp. konkrétní případ), že by byl přenos na člověka možný - prionový celulární protein (PrPC) se přirozeně vyskytuje na membránách gangliových buněk mozku - podílí se na regulaci procesů spánku a bdění a na udržování homeostatických mechanismů organismu - PrPC může měnit svou konformaci na patologickou izoformu PrPSc (příčiny nejsou objasněny) - PrPC a PrPSc se neliší v primární struktuře, rozdíly ale nalezneme v prostorovém uspořádání - PrPSc je ze 41% strukturně β-skládaný list, zatím co PrPC je ze 42% α- helix - díky tomu získává PrPSc extrémní odolnost vůči chemickým a fyzikálním vlivům a účinkům proteas  scrapie (klusavka, drbavka) - nepochybně nejdéle známá prionopatie - u postižené ovce se nejdříve projeví útlum, který se střídá s obdobími přehnané aktivity (se zvířetem „šijou všichni čerti“) - později se může objevit silné svědění - v následujících fázích choroby se objeví poškození CNS (narušena koordinace pohybů) – zvířata našlapují zvysoka, jako kdyby klusala (proto český lidový název klusavka) - nemoc končí ochrnutím a smrtí ovce - člověk se prionem nenakazí, zřejmě není možné, aby ovčí prion sloužil jako matrice pro proměnu lidského PrPC (na rozdíl od prionu skotu, který toto umí a lidé pak onemocní novou variantou Creutzfeldt- Jakobovy choroby)  chronické chřadnutí jelenovitých (CWD – chronic wasting disease)  felinní spongiformní encefalopatie  transmisivní encefalopatie norků  diagnostika - diagnostika spongiformních encefalopatií je založena na klinickém a histopatologickém nálezu (imunohistochemie, Western-blot), případně genetickém vyšetření - sporadická forma CJD  typický nález na EEG (vypadá jako EKG)  na MR je zjevné postižení bazálních ganglií a insuly, atrofie frontotemporální oblasti  v likvoru lze prokázat protein 14-3-3 - familiární forma CJD  lze diagnostikovat stanovením mutace v genu PRNP - variantní forma CJD  priony lze prokázat v tonzilách, apendixu nebo ve slezině  postižení na MR je zejména v pulvinarech thalamu  likvor je negativní na protein 14-3-3 - v histologickém preparátu lze nalézt spongiformní změny (opticky prázdné prostory – vzhled mycí houby), úbytek neuronů a zmnožení astrocytů (astrocytosa)  terapie zatím neexistuje 24. Příčiny patologické konformace bílkovin a klinické důsledky ________________________________________________________________________________________________________  proteolytická konformace bílkovin – proteopatie - není zcela jasné, zda jsou vznikající agregáty příčinou nebo důsledkem nerovnováhy homeostázy proteinu - rizikové faktory  destabilizační změny v primární struktuře  posttranslační modifikace  změny teploty, pH  zvýšená produkce proteinu  snížené vylučování a degradace proteinu  vyšší věk  traumatické zranění mozku  poruchy - primární porucha sbalení – v důsledku mutace genu (cystická fibrosa) a následná ztráta funkce proteinu - agregace do amyloidních fibril  díky mutaci  díky zvýšené produkci  díky alternativnímu sbalení - následky  buď vznikají toxické bílkoviny vedoucí k neurodegenerativním onemocněním  nebo dochází k ukládání – amyloidosy  amyloid - nevětvené extracelulární proteinové fibrily, v preparátu barvitelné Kongo červení nebo Thioflavinem T - obsahují cross-β-sheet páteř, tyto řetězce do sebe zapadají ve formě sterického zipu, na kterém jsou pak navázány další řetězce - i u amyloidu (podobně jako u prionů) lze uvažovat o seeded amyloid production, i když ne zcela prokázáno - u jednotlivých neurodegenerativních i jiných onemocnění, způsobených patologickou konformací bílkovin, se objevují různé mutované proteiny, avšak amyloid mohou vytvářet všechny a jeho charakter je v základu obdobný - fibrily amyloidu nejsou toxické, jen nerozpustné a ukládají se v orgánech, čímž poškozují tkáň  cystická fibrosa - AR choroba, delece 1amk - defekt CFTR = chloridový kanál v epitelových buňkách - klinicky  vznik vysoce viskózní mukózy, hlenu, který blokuje dýchací cesty  zhoršený přenos plynů a perzistující infekce - mutovaný protein CFTR má téměř plnou biologickou aktivitu, ale je rozpoznáván jako chyba a degradován v proteasomech (do určité doby)  Alzheimerova choroba - EC ukládání depozit β-amyloidu - genetický podklad, dochází ke střádání špatně sbalených proteinů - prekurzorový protein je β-amyloidní prekurzorový protein (β-APP) - v mozku pacientů vznikají 2 různé agregáty  chybně složený cytoskeletární protein Tau  plaky tvořené fragmenty membránového proteinu β-APP - β-APP  má nejasnou funkci  patologický je jinak štěpen, vzniká amyloidní β-peptid, který utváří proteinové agregáty  amyloidní β-peptid snadno polymerizuje a utváří nerozpustné fibrily – neuritické plaky (sporadicky i u zdravých jedinců)  postižen je zejména hippokampus – poruchy paměti  plaky infiltrovány reaktivními mikrogliemi, obklopené astrocyty – dochází k uvolnění ROS a cytokinů a rozvíjí se aseptický zánět  následkem je smrt okolních neuronů - terapie  inhibice konformačních změn, vývoj nových peptidů (β-sheet breakers)  experimentální studie chaperonů  Huntingtonova chorea - mutovaný gen, ve kterém dochází k expanzi trinukleotidů - dochází k tvorbě patologického proteinu – huntingtinu, neznámé funkce - mechanismus onemocnění není přesně znám - uvažuje se o přetížení neuronů glutamátovou neurotransmisí, snížení antiapoptotických účinků normálního huntingtinu nebo mitochondriální dysfunkci (pacienti mají nižší metabolickou aktivitu v postižených oblastech) - dochází k selektivní ztrátě neuronů v bazálních gangliích ale i jiných oblastech spojených s koordinací pohybů – např. mozkové kůře - jedná se o AD dědičné onemocnění  amyloidosa - nemoc z ukládání amyloidu v mezibuněčném prostoru - amyloid nedokážou makrofágy rozložit - ukládá se do tkání – ledviny, střevo, myokard, játra, mozek, cévy, jazyk... - dochází ke zvětšení orgánu, který je tuhý a makroskopicky nažloutlý  Parkinsonova choroba - utváří se patologický protein α-synuklein, který potom utváří amyloidové fibrily - juvenilní forma je dána mutací genu parkin - v důsledku mutace dochází k úbytku dopaminergních neuronů v substantia nigra - ten způsobuje zvýšenou aktivitu globus pallidus a tak poruchu pohyblivosti – útlum stimulačních drah, hypokineticko-hypertonický syndrom - v neuronech se utvářejí tzv. Lewyho tělíska  frontotemporální demence - utváří se patologický protein Tau - někdy je považována za podtyp Alzheimerovy choroby  CJD – viz priony 25. Metabolické změny v buňce při anoxii a ischemii ________________________________________________________________________________________________________  ischemické poškození srdce nebo mozku je celosvětově nejčastější příčinou smrti - srdce – aterosklerosa koronárních tepen – ICHS - mozek – problém aterosklerosy proximálněji – karotidy – uvolnění trombu nebo aterosklerotického plátu, jenž je vmeten do distálních částí řečiště (někdy příčinou mozkové mrtvice též krvácení)  hypoxie (anoxie) - nedostatek kyslíku  ischemie - nedostatek kyslíku - průtok krve tkání omezen/zastaven - následkem je porucha dodávky živin a porucha odstraňování zplodin metabolismu  metabolické změny v buňce při hypoxii a ischemii - zvýšení degradace glykogenu a glykolýzy  následkem toho se hromadí laktát a klesá pH (acidosa) - úbytek ATP  buňka má nedostatek energie  adenylátkinasa pak realizuje ADP + ADP  ATP + AMP  AMP je odbouráván až na Pi a hypoxanthin  v srdečním svalu ani nervové buňce není xanthinoxidasa, která by hypoxanthin odbourávala na kyselinu močovou - rozvrat iontových gradientů  ↑ H + (laktát)  ↑ Na + (směna Na + /H + na membráně)  ↑ Ca 2+ (selhání ATP-dependentního čerpání do ECT a ER, poruchy směny Na + /Ca 2+ na membráně)  význam vápníku v buňce - druhý posel důležitý naprosto ve všech životních projevech buňky - v cytoplasmě jen 0,1-0,2μmol – cca 1μmol je již signál - zdroj signálu je  z vnějšku - ligandem aktivované Ca 2+ kanály - napětím řízené Ca 2+ kanály  ze zásob v ER - PI3 receptor/kanál - ryanodinový receptor/kanál - závislý na membránovém potenciálu (kosterní sval) - závislý na Ca 2+ (srdce, CNS) - o tom, jakou informaci Ca 2+ signál nese rozhoduje jeho lokalizace, frekvence a amplituda - vápník je často účinný jen ve vazbě s kalmodulinem  patobiochemické účinky zvýšení intracelulárního kalcia - aktivace mnoha enzymů  Ca/kalmodulin dependentní proteinkinasy  některé fosfatasy (calcineurin)  endoteliální a neuronální NO synthasy  kalpainy (Ca aktivované non-lysosomální proteasy)  fosfolipasy (poškození membrán, syntéza prostanoidů)  endonukleasy (fragmentace DNA při apoptose) - svalová kontrakce - uvolnění hormonů a neurotransmitterů - regulace genové exprese - skladba cytoskeletu (vysoké Ca – membrane blebbing) - mitochondrie  regulace respirace  indukce MPT (mitochondria permeability transition)  import vápníku do mitochondrie - v mitochondrii skladování Ca 2+ (nelze tak úplně říci) - je jedním z cílů Ca 2+ - díky protonové pumpě a rozdílnému náboji na membráně (vně kladný a uvnitř záporný) umožnění průchodu dovnitř mitochondrie - Ca 2+ uniporter – facilitovaná difuze po spádu elektrochemického gradientu, kapacita obrovská - metabolická regulace – kritické mitochondriální dehydrogenasy jsou stimulovány Ca 2+  pyruvátdehydrogenasa  isocitrátdehydrogenasa  2-oxoglutarátdehydrogenasa - takto srdeční mitochondrie reaguje na změny ATP (nikoli deplece ATP, ale zvýšení Ca 2+ !) - mitochondrie tedy buňce umožňuje sekvestraci cytoplasmatického kalcia - bohužel ale jen za určitých okolností – pokud dojde k překročení míry, otevírá se megakanál (1 na 1 mitochondrii) = MPT - MPT = mitochondrial permeability transition  otevření megakanálu ve vnitřní membráně mitochondrie  propustnost pro všechny molekuly menší než 1500 Da  kolaps potenciálu vnitřní membrány, vyrovnání protonového gradientu a rozpřažení nebo inhibice respirace  zbobtnání mitochondrie - otevření megakanálu  spouští Ca 2+  stimulují - oxidanty - depolarizace - anorganický fosfát  inhibují - protony (nízké pH matrix) - magnesiové ionty - ATP a ADP - cyklosporin A - funkce MPT  struktura kanálu stále ještě neznáma  fyziologické (reverzibilní) otevření MPT - energeticky výhodný eflux Ca 2+ z mitochondrie - kalciová signalizace - uvolnění Ca 2+ indukované kalciem, mitochondrie jako Ca 2+ signalling storing device  patologické (ireverzibilní) otevření MPT - buněčná smrt (nekrosa a apoptosa) - mechanismus jak jsou staré mitochondrie označeny pro autofagii - dojde-li k tomuto jevu u všech mitochondrií – kolaps energie – apoptosa/nekrosa 26. Reoxidační poškození tkáně ________________________________________________________________________________________________________  reoxygenační poškození tkáně - další poškození ischemické tkáně, probíhající až po obnovení průtoku krve - významné zejména po krátké ischemii - pokud je tkáň ischemií zcela zničená, reperfuze už nemůže lokální stav zhoršit, ale může vyplavit toxiny z mrtvé tkáně do cirkulace  multiple organ dysfunction syndrome (MODS)  systemic inflamatory response syndrome (SIRS) - záplava kyslíkových radikálů, NO a eikosanoidů  význam poškození - střevo  trombosa, torze, uskřinuté kýly - srdeční infarkt  trombolytická léčba, angioplastika  arytmie, porucha kontraktility (stunning) - perinatální asfyxie - hemoragický šok po doplnění krevního oběhu - otrava oxidem uhelnatým léčená kyslíkem - spánková apnoe - orgány před transplantací  klasický model ischemicko reperfuzního poškození - xanthinoxidasový model dobře vysvětluje poškození střev u koček - lidské srdce ale neobsahuje žádnou xanthinoxidasu - enzym se nachází pouze v játrech, střevě a laktující mléčné žláze, v malém množství je v cévách vázán na povrchu endotelu - přeměna na O formu je v lidském střevě příliš pomalá - tvorba ROS během reperfuze má jiné zdroje  mitochondrie - po ischemii jsou více „děravé“ - mitochondrial permeability transition  leukocyty - no-reflow fenomén (ucpání kapilár adherovanými bílými krvinkami)  MPT je zřejmě hlavním mechanismem reoxygenačního poškození myokardu - ischemie – nízké pH chrání před MPT - reperfuze – v myokardu nastávají podmínky pro MPT koincidencí následujících faktorů  nadprodukce oxidantů  deplece adeninových nukleotidů  vysoká koncentrace Pi (z degradace ATP)  vysoká koncentrace Ca 2+  normalizace pH - ATP synthasa může fungovat i obráceně  H + jde ven za štěpení ATP  výhoda při ojedinělém MPT – dojde k rychlému znovustanovení H + gradientu  při reperfuzi po ischemii ovšem dochází ke ztrátám drahocenného ATP a tak se zhoršuje stav buňky  poly(ADP-ribosa)polymerasa (PARP-1) - enzym vázaný na chromatin, aktivovaný (oxidačním) poškozením DNA - štěpí NAD + , přenáší poly(ADP-ribosa) na jaderné proteiny - pomáhá v opravách DNA a podporuje přežití buňky - je-li ale DNA poškozena příliš, enzym způsobí depleci NAD + , která urychlí buněčnou smrt (suicide response) - deplece NAD + je usnadněna jeho uvolněním z mitochondrií v důsledku MPT  prevence ischemickou reperfuzního poškození - stále spíše teoreticky - řízená hypotermie - MPT inhibitory (má i imunosupresivní účinek, kde je v léčbě využíván, ten však není způsoben inhibicí MPT)  Cyklosporin A – váže cyklofilin D (součást MPT póru) - antioxidanty - PARP-1 inhibitory 27. Excitoxicita v patogenezi poruch CNS ________________________________________________________________________________________________________  excitoxicita hraje roli v patogenezi některých neurologických onemocnění, např. cévní mozkové příhody a Huntingtonovy chorey  excitoxiny jsou exogenní, endogenní, včetně nadbytku excitačních aminokyselin – glutamát  glutamát - většina excitačních synapsí v lidském mozku užívá glutamát - receptory  ionotropní - ligandem řízené iontové kanály - iontové kanály jsou tetramery – tisíce možností složení podjednotek - podle afinity k dalším látkám (agonistům) se dále dělí - non-NMDA receptory  N-methyl-D-asparagová kyselina  rychlá synaptická transmise, propustné pro Na +  dále dělené na AMPA (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxalon) X kainát  AMPA receptory – většina rychlých excitačních synapsí mozku  kainát receptory – i na postsynaptických membránách - NMDA receptory  dlouhodobé změny v síle synaptického přenosu  propustné pro Na + a Ca 2+  metabotropní - spřažené s G proteiny, seven- spanning  glutamátové receptory a indukce LTP (long-term-potentiation) - nízká frekvence impulzů – pouze AMPA receptory aktivní - vysoká frekvence impulzů – AMPA i NMDA receptory aktivní - NMDA receptor je tzv. coincidence detector  synaptická plasticita - síla synaptického spojení udává synaptickou aktivitu - synaptická aktivita vede ke kovalentní modifikaci stávajících proteinů, které pak zpětně ovlivňují sílu synaptického spojení - kromě toho kovalentní modifikace stávajících proteinů způsobí expresi a syntézu nových proteinů, které opět zpětně ovlivňují sílu synaptického spojení - přílišná hladina glutamátu vede k přílišnému dráždění neuronu a může vést až k jeho zahubení – přehnaným influxem Na + a Ca 2+ do buňky  excitoxicita při mozkové ischemii-reperfuzi (u cévní mozkové příhody) - glutamátová kaskáda (MPT se u nervové buňky neúčastní) - indukce  ischémie – depolarizace neuronální membrány vede k uvolnění glutamátu  nadměrná excitace NMDA receptorů způsobí influx Ca 2+ a Na + do buňky  Na + způsobí osmotické bobtnání buňky a nekrosu  Ca 2+ vede k vzestupu hladiny mitochondriálních ROS, vzestupu NO a aktivaci Ca 2+ stimulovaných enzymů (proteasy, fosfolipasy – vzestup eikosanoidů)  takto pokračuje poškození a nastává buněčná smrt – apoptosa, nekrosa - amplifikace  další kumulace Ca 2+ intracelulárně (influx z extracelulárního prostředí a ER do cytoplasmy)  to vede k dalšímu uvolnění glutamátu a poškození dalších neuronů – propagace poškození - exprese  intracelulární Ca 2+ aktivuje Ca 2+ dependentní nukleasy, proteasy a fosfolipasy  dochází tak k poškození biologických struktur – uvolnění kyseliny arachidonové a vznik eikosanoidů a volných radikálů  to vede k propagaci poškození - glutamát je z postsynaptické membrány vychytáván gliovými buňkami a zpracováván na glutamin - transportéry glutamátu využívají iontových gradientů na buněčné membráně - depolarizace membrány vede k tomu, že se ale transport může otočit - do štěrbiny s přebytkem glutamátu je gliemi připumpován další  Huntingtonova chorea - mutace Huntingtonova genu - strukturní změny předpokládaného proteinu huntingtinu - uvolnění excitoxinů – excesivní stimulace NMDA receptorů - to vede k intracelulární kumulaci Ca 2+ a poškození neuronů ve striatu a jiných oblastech - symptomy Huntingtonovy chorey jsou chorea, progresivní degenerace nervového systému 28. Obecné mechanismy smrti nervových buněk při neurodegenerativních chorobách ________________________________________________________________________________________________________  Alzheimerova nemoc (AN) - demence = získaná a progresivní porucha všech vyšších kognitivních funkcí - nejčastější ze všech neurodegenerativních chorob (USA: 30% ve věku 65 let nebo víc) - nejasné oddělení od vaskulární demence (chronická ischemie mozku) a změn při normálním stárnutí mozku - difuzní ztráta neuronů, v patologii je charakteristické  senilní plaky – extracelulárně, jádro z agregovaného β-amyloid peptidu (Aβ)  tangles – vlákna uvnitř neuronů, tvořená z hyperfosforylovaného proteinu tau - epidemiologie  většina případů sporadická, ale dědičnost silně ovlivňuje predisposici (např. polymorfismy apolipoproteinu E)  familiární formy (s časným začátkem): mutace v APP nebo v presenilinech (ovlivňují tvorbu Aβ z APP), také M.Down (trisomia 21 – kde je gen pro APP)  negativní asociace s dosaženou úrovní vzdělání a pravidelnou fyzickou aktivitou - účinná léčba dosud není  Parkinsonova nemoc (PN) - progresivní porucha hybnosti, pomalost pohybů (bradykinesia), klidový třes, obtížný začátek pohybu (akinesia), svalová rigidita - druhá nejčastější neurodegenerativní porucha (5% ve věku 85 let nebo víc) - selektivní smrt neuronů v substantia nigra (SN) – nedostatek dopaminu v striatu – symptomy - patologická anatomie – Lewyho tělíska (ve zbývajících SN neuronech, obsahují agregovaná α-synuklein), ale není specifické - epidemiologie  téměř vždy sporadické  familiární formy s časným začátkem jsou velmi vzácné  někdy též způsobeno toxiny (např. MPTP) - léčba  modulace dopaminergní transmise (L-DOPA + Carbidopa atd.) – v zásadě funguje, ale s vedlejšími účinky a účinek léčby se s časem vytrácí  experimentální terapie transplantací dopamin-produkujících buněk do mozku pacienta  mechanismy smrti neuronů u AN a PN a dalších chorob - jsou komplexní a jen částečně probádané, přesto existuje několik obecnějších rysů  porucha funkce mitochondrií  zvýšení oxidačního poškození  poruchy ubikvitin-proteasomového systému  hromadění abnormálních agregovaných proteinů  změny v metabolismu železa  excitoxicita  zánět  porucha funkce mitochondrií - Alzheimer  mitochondriální poruchy popsány jako snížená aktivita cytochromoxidasy, pyruvátdehydrogenasy a α-ketoglutarátdehydrogenasy  mitochondrie jsou jedním z cílů toxicity Aβ - Parkinson  poruchy v komplexu I nalezeny specificky v nemocné SN – v současné době považováno za jeden z hlavních mechanismů patogenese PN  SN neurony jsou zřejmě zvlášť citlivé k působení komplex I toxinů - MPTP (příměs v heroinu, v neuronech metabolizován na MPP+) u narkomanů (MPTP = 1-methyl-4-feny-1,2,3,6-tetrahydropyridin) - pokusy na zvířatech s rotenonem (pesticid) – takové toxiny mohou být v prostředí velmi rozšířeny  zvýšení oxidačního poškození - Alzheimer  přesvědčivé důkazy pro lokální oxidační stres již na počátku onemocnění  původ ROS - Aβ peptid (základní mechanismus jeho toxicity) – jak přímo, s katalýzou přechodnými kovy, tyk nepřímo (indukce ROS-generujících enzymů, účinek na mitochondrie) - aktivace mikroglie senilními plaky, včetně AGE-RAGE interakce - Parkinson  přesvědčivé důkazy pro lokální oxidační stres, ale vztah příčina/důsledek poněkud nejasný  deplece GSH může být jeden důležitý a časný děj  původ ROS - metabolismus dopaminu (jak jeho neřízená kovy-katalyzovaná autooxidace, tak katabolismus monoaminooxidasami generuje radikály) - proto asi jsou SN neurony zvláště náchylné k oxidačnímu stresu - porucha mitochondrií (např. způsobená MPP+) - možnost uvolnění železa z neuromelaninu - aktivace glie  poruchy ubikvitin-proteasomu - Alzheimer  aktivita proteasomu nízká - mutantní ubikvitin (generovaný chybami transkripce) - některé oxidované/abnormální proteiny (vč. Aβ a tau) mohou proteasom ucpávat - Parkinson  některé vrozené formy - mutace genu pro parkin (E3 ligasa pro ubikvitinaci α-synukleinu) - mutace v UCHL1 (ubikvitin carboxy-terminal hydrolase L1) – enzym důležitý pro recyklaci ubikvitinu  aktivity proteasomu a UCHL1 jsou nízké i u sporadických forem PN - takové poruchy obecně podporují hromadění vadných proteinů a také oxidační stres (porucha odstraňování oxidovaných proteinů)  abnormální agregované proteiny - Alzheimer  amyloid β peptid je aberantní produkt štěpení APP – jeho hromadění je považováno za základní mechanismus patogeneze AD  neurotoxické jsou především rané, ještě rozpustné Aβ-agregáty  produkce ROS je hlavním mechanismem neurotoxicity  zralé plaky nejsou přímo neurotoxické, ale indukují zánětlivou odpověď mikroglie - Parkinson  hromadění α-synukleinu přispívá ke smrti neuronů - mutace v genu pro α-synuklein způsobuje jednu formu familiární PN - zvýšená exprese normálního α-synukleinu také vede k PN (pokusy na zvířatech, též jedna vzácná familiární forma)  ale ne každý případ PN má Lewyho tělíska a existuje také stav s Lewyho tělísky, ale bez PN  změny v metabolismu železa - Alzheimer  stopy Cu nebo Fe jsou nezbytné jako katalyzátory agregace Aβ jak ve zkumavce, tak in vivo  Aβ s vázanou mědí přímo generuje ROS  plaky hromadí Cu, Fe (také Zn, snad i Al) v redoxně aktivních formách - Parkinson  Fe se hromadí v nemocné SN, ale je to relativně pozdní děj  kovy katalyzují autoxidaci dopaminu – ROS + neuromelanin bohatý na Fe  možné uvolnění redoxně aktivního Fe z neuromelaninu (stará, zajímavá, ale nepotvrzená teorie)  excitoxicita - myšlenka pomalé excitoxicity  i fyziologická stimulace glutamátem může být toxická pro neuron, pokud je porušena jeho produkce energie  pokud formulováno tímto způsobem, může být významné v patogenezi mnoha chronických neurodegenerativních chorob  příliš málo glutamátu též škodí - určitá úroveň nervové aktivity je nezbytný pro přežití nervových buněk - kultivace neuronů in vitro – přídavky glutamátu/KCl v určité rané fázi vývoje kultury brání apoptose - NMDA receptor je napojen na signalizaci růstových faktorů (Ras/MAPK apod.) - antiapoptotické signální dráhy se překrývají se signalizací synaptické plasticity  v ontogenezi fyziologicky zanikají ty buňky, které do určitého času nevytvoří dostatečný počet synapsí  mozkový infarkt - centrální léze – anoxie, rychlá nekrosa, příliš mnoho glutamátu - penumbra – hypoxie, opožděná buněčná smrt, spíše apoptotická, příliš málo glutamátu v důsledku ztráty aferentace